陳佩，黨輝，賀國(guó)旗，王紅麗，孟科，陳衛(wèi)

（1.陜西廣播電視大學(xué)，陜西西安710119；2.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001；3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；4.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

一株干酪乳桿菌生物學(xué)特性及其發(fā)酵豆乳的研究

陳佩1，2，黨輝3，4，賀國(guó)旗1，王紅麗1，孟科1，陳衛(wèi)3

（1.陜西廣播電視大學(xué)，陜西西安710119；2.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001；3.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；4.陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安710119）

主要研究一株具有降糖作用的干酪乳桿菌的生物學(xué)特性及其對(duì)發(fā)酵豆乳的品質(zhì)影響。結(jié)果表明該菌株在強(qiáng)酸條件下可以生長(zhǎng)，對(duì)人工胃腸液都具有很好的耐受性。耐受膽鹽的延遲時(shí)間為1.01 h，對(duì)Caco-2細(xì)胞具有較強(qiáng)的黏附能力(15個(gè)/cell)。以干酪乳桿菌發(fā)酵豆乳具有良好的品質(zhì)，且感官評(píng)定綜合得分為90分。

干酪乳桿菌；發(fā)酵豆乳；生物學(xué)特性

我國(guó)糖尿病患者人數(shù)在過去30年中快速增長(zhǎng)了近10倍[1]，目前已超過1億，成為全球糖尿病人數(shù)第一大國(guó)。因此，對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療有非常迫切的需求。大多數(shù)的糖尿病患者通過藥物能達(dá)到降糖的效果，但是每種藥物都存在有一定的副作用，在使用過程中會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。所以人們將目光投向更天然、更安全的降糖途徑。近年來，乳酸菌被證實(shí)具有預(yù)防和治療糖尿病的作用。有研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌[2]、VSL#3（雙歧桿菌，唾液鏈球菌，乳酸桿菌）[3]、嗜酸乳桿菌[4]、乳酸桿菌代田株[5]、鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌[6]等菌株在動(dòng)物模型或臨床試驗(yàn)中對(duì)糖尿病具有預(yù)防或治療的作用。

豆乳含有豐富的植物蛋白、不飽和脂肪酸和維生素等功能成分，不含膽固醇，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高。豆乳經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后制成酸豆乳，產(chǎn)品中含有乳酸菌活菌體及其代謝產(chǎn)物，對(duì)人體的腸胃吸收功能有良好的生理作用，同時(shí)改善了豆乳原有的豆腥味和組織狀態(tài)[7]。目前越來越多的研究集中于用乳酸菌發(fā)酵豆乳[8-9]，且乳酸菌發(fā)酵豆乳制品已成為發(fā)展豆乳工業(yè)的方向之一。

在前期研究的基礎(chǔ)上[10]，研究一株干酪乳桿菌的生物學(xué)特性，初步探討其在豆乳中的發(fā)酵特性，為降糖產(chǎn)品的研究開發(fā)和規(guī)?；a(chǎn)提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌CCFM0412：江南大學(xué)食品生物與技術(shù)中心菌株保藏庫(kù)；MRS液體培養(yǎng)基：青島海博；大豆：市售；胃蛋白酶(1∶10 000)、胰蛋白酶（1∶250）、巰基乙酸鈉：美國(guó)sigma；人結(jié)腸癌腺細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株：上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清、雙抗（青、鏈霉素）：美國(guó)Gibico。

DHP9012恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；SW-CJ-1CV超凈臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；320-S pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UV-2100紫外可見分光光度計(jì)：尤尼科上海有限公司；DJ13B-N620SG九陽(yáng)豆?jié){機(jī)：濟(jì)南九陽(yáng)電器有限公司；TA-XT2質(zhì)構(gòu)測(cè)試儀：英國(guó)Godal ming UK；NDJ/79型粘度儀：同濟(jì)大學(xué)機(jī)電廠；5415R冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf；CX41-12C02 倒置顯微鏡：日本 Olympus；細(xì)胞培養(yǎng)瓶：美國(guó)Corning。

1.2 方法

1.2.1 干酪乳桿菌的制備

將凍存于-80℃的干酪乳桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h，連續(xù)活化三代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 干酪乳桿菌在人工模擬胃腸液中的生長(zhǎng)測(cè)定

將胃蛋白酶溶于PBS（pH 3.0）中，使其終濃度為3 g/L，過0.22 μm濾膜除菌后備用。將胰蛋白酶溶于PBS（pH 8.0）中，使其終濃度為 1 g/L，過 0.22 μm 濾膜后制備成模擬腸液[11]。

干酪乳桿菌以0.85%生理鹽水重懸后，在模擬胃液(pH 3.0)中調(diào)節(jié)菌液密度至1×109CFU/mL，混勻后37℃培養(yǎng)1、2、3 h檢測(cè)活菌數(shù)。在模擬胃液（pH 3.0）中培養(yǎng)3 h后，取培養(yǎng)液1 mL加入至9 mL的模擬腸液（pH8.0）中，混勻后 37℃培養(yǎng) 2、4、8h檢測(cè)活菌數(shù)[12]。乳酸菌的存活率用以下公式計(jì)算：

式中：N1為經(jīng)過模擬胃腸液處理之后的乳酸菌活菌數(shù)；N0為未處理前乳酸菌的活菌數(shù)。

1.2.3 干酪乳桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的干酪乳桿菌，以2%的接種量分別接種于含有或不含0.3%膽鹽的MRS-THIO(MRS含有0.2%的巰基乙酸鈉)培養(yǎng)基中，混勻后37℃培養(yǎng)。記錄不加膽鹽和加了膽鹽的培養(yǎng)基吸光值達(dá)到0.3個(gè)單位時(shí)各組所需的時(shí)間，這兩組的時(shí)間差即為干酪乳桿菌在膽鹽中生長(zhǎng)的延遲時(shí)間（Lag Time，LT）。延遲時(shí)間的長(zhǎng)短，反映了乳酸菌對(duì)膽鹽的耐受能力。延遲時(shí)間越短，說明耐受膽鹽的能力越強(qiáng)，反之則耐受膽鹽的能力越弱[13]。

1.2.4 干酪乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附能力測(cè)定

Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)在含有20%胎牛血清，1%L-谷氨酰胺，1%非必需氨基酸和1%雙抗的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，等細(xì)胞增殖融合率達(dá)到80%左右時(shí)，以含0.22%EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，按照1∶3進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行下步試驗(yàn)。

參照Bustos等[14]的方法有所改動(dòng)，調(diào)節(jié)Caco-2細(xì)胞密度為4×104cell/孔接種到6孔板中，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的干酪乳桿菌離心后用PBS（pH 7.2）沖洗3次后重懸于高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，并調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL，加入到已生長(zhǎng)好的Caco-2細(xì)胞單層中，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。再以PBS（pH 7.2）沖洗細(xì)胞單層3次，用甲醇固定30 min后，再進(jìn)行革蘭氏染色。隨機(jī)找20個(gè)視野數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以平均每個(gè)細(xì)胞上粘附的干酪乳桿菌數(shù)來評(píng)價(jià)其粘附能力。

1.2.5 發(fā)酵豆乳的工藝流程[15]

大豆→熱燙滅酶（4 min）→浸泡（0.5%NaHCO3溶液，12 h）→清洗→去皮（豆水比1：7，質(zhì)量比）→熱水磨漿（80℃）→過濾→調(diào)漿（7%蔗糖）→均質(zhì)→殺菌（121℃，15 min）→接種→發(fā)酵→低溫后熟→酸豆乳

1.2.6 接種量對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的干酪乳桿菌按照3%、5%和7%的接種量接種到豆乳中，37℃培養(yǎng)，記錄凝乳時(shí)間，測(cè)定pH值、滴定酸度和活菌數(shù)。

1.2.7 發(fā)酵豆乳黏度的測(cè)定

在25℃下，利用黏度計(jì)（10×轉(zhuǎn)子）測(cè)定發(fā)酵豆乳的黏度，重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值。

1.2.8 發(fā)酵豆乳游離氨基酸的測(cè)定

鄰苯二甲醛（ortho-phthalalolehy de，OPA）法測(cè)定發(fā)酵豆乳的蛋白水解程度。340 nm下測(cè)定游離氨基酸與OPA反應(yīng)形成的復(fù)合物的吸光值表示發(fā)酵豆乳的蛋白水解程度，以空白作對(duì)照[16]。

1.2.9 發(fā)酵豆乳感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)定小組由10名研究生（5男5女）志愿者組合，并全部接受過《食品感官評(píng)定》課程的培訓(xùn)。按照表1各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)[17]。

表1 酸豆乳感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of fermented soymilk

2 結(jié)果與討論

2.1 干酪乳桿菌在人工模擬胃腸液中的存活率

乳酸菌要進(jìn)入人體腸道發(fā)揮益生作用，首先應(yīng)該具有較強(qiáng)的耐受胃腸液的能力。干酪乳桿菌在人工模擬胃腸液中的存活率見表2。

表2 干酪乳桿菌在人工模擬胃腸液中的存活率Table 2 Tolerance of Lactobacillus casei to simulated gastrointestinal juice

從表2可見，干酪乳桿菌在人工模擬胃液（pH 3.0）中可存活3 h，并且存活率為82.34%。在模擬腸液（pH 8.0）中可存活8 h，且存活率可達(dá)到90%以上，結(jié)果表明干酪乳桿菌對(duì)人工模擬胃腸液有很好的耐受力。

2.2 干酪乳桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力

膽鹽能夠破壞細(xì)胞的細(xì)胞膜，所以對(duì)膽鹽的耐受能力是評(píng)價(jià)益生菌的一個(gè)重要指標(biāo)。干酪乳桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力見圖1。

圖1中所示，本試驗(yàn)中的干酪乳桿菌對(duì)于膽鹽的延遲時(shí)間為1.01 h，說明此菌株對(duì)膽鹽具有很好的耐受性。乳酸菌中有些菌株可以產(chǎn)出膽鹽水解酶，此酶可將甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合的膽鹽催化水解為氨基酸殘基和游離的膽鹽。這種乳酸菌具有降低血清膽固醇水平和預(yù)防正常人高膽固醇血癥的發(fā)生[18]。

圖1 干酪乳桿菌對(duì)膽鹽的耐受能力Fig.1 Bile salts tolerance of Lactobacillus casei

2.3 干酪乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力

益生菌能夠黏附定植與腸壁細(xì)胞表面，是其發(fā)揮益生作用的必要條件之一[19]。Caco-2細(xì)胞是一種人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞，可以較好的模擬人體腸道中的環(huán)境。干酪乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力見圖2。

圖2 干酪乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附形態(tài)（×400）Fig.2 The morphology of adherent of Lactobacillus casei to Caco-2 cells

如圖2所示，干酪乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞具有一定的黏附能力，依據(jù)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明粘附率為15個(gè)/cell，由此推測(cè)此試驗(yàn)菌株在腸道中具有較好的定植能力，可以發(fā)揮其益生作用。

2.4 不同接種量對(duì)發(fā)酵豆乳的影響

根據(jù)發(fā)酵豆乳的工藝流程，將干酪乳桿菌以不同接種量接入到豆乳中，測(cè)定其凝乳時(shí)間、pH值、滴定酸度和活菌數(shù)，結(jié)果見表3。不同接種量下，酸豆乳的凝乳時(shí)間和滴定酸度差異顯著（P＜0.05），隨著接菌量的增加，豆乳的凝乳時(shí)間相應(yīng)縮短，滴定酸度升高。接種量為7%和3%的pH值差異顯著（P＜0.05）?；罹鷶?shù)隨著接種量的增加而增加。綜合考慮選取7%的接菌量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表3 干酪乳桿菌接種量對(duì)酸豆乳發(fā)酵特性的影響Table 3 The fermentation characteristics of Lactobacillus casei in different inoculums densities

2.5 發(fā)酵豆乳表觀黏度的變化

干酪乳桿菌在發(fā)酵豆乳期間表觀黏度的變化如圖3所示。

圖3 干酪乳桿菌發(fā)酵過程中酸豆乳表觀黏度變化Fig.3 Changes of apparent viscosity of soymilk during fermentation with Lactobacillus casei

發(fā)酵前2 h因?yàn)槎谷槌室簯B(tài)狀，所以表觀黏度的變化很微小。之后隨著乳酸菌的快速繁殖產(chǎn)酸，豆乳的pH值不斷下降，大豆球蛋白之間不斷聚集凝結(jié)，形成了酸凝膠體系，所以酸豆乳的表觀黏度也不斷升高。當(dāng)發(fā)酵豆乳過程中凝乳的形成抑制了發(fā)酵乳桿菌的乳酸代謝，因此到發(fā)酵后期，豆乳黏度呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。

2.6 發(fā)酵豆乳蛋白水解能力的變化

發(fā)酵豆乳蛋白水解能力的變化見圖4。

圖4 干酪乳桿菌發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化Fig.4 Changes of free amino acid content in soymilk during fermentation with Lactobacillus casei

如圖4所示，干酪乳桿菌在發(fā)酵豆乳初期，由于其生長(zhǎng)代謝緩慢分解大豆蛋白的能力較弱，故游離氨基酸的含量較低，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆蛋白被分解的量增加，游離氨基酸的含量也隨之迅速增加，吸光值也越來越高。

2.7 發(fā)酵豆乳感官評(píng)定

干酪乳桿菌發(fā)酵豆乳結(jié)束后，經(jīng)過10名專業(yè)感官鑒評(píng)人員對(duì)色澤，氣味，滋味和組織狀態(tài)4個(gè)指標(biāo)的評(píng)定，發(fā)酵豆乳產(chǎn)品呈現(xiàn)良好的品質(zhì)，綜合得分為90分。目前市場(chǎng)上還沒有比較成熟的發(fā)酵豆乳產(chǎn)品，因此我們暫時(shí)無法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行橫向的比較。但是在以后的應(yīng)用開發(fā)研究中，可以根據(jù)特別的產(chǎn)品需求有針對(duì)性的進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

目前，全球的糖尿病發(fā)病率和患者總數(shù)都呈逐年增加的趨勢(shì)。因?yàn)閭鹘y(tǒng)降糖藥物的使用會(huì)引發(fā)一系列的副作用，所以人們逐漸將目光投入到更安全的天然食品，尋求理想的降糖保健食品。國(guó)內(nèi)外的研究表明乳酸菌通過調(diào)節(jié)宿主腸道菌群達(dá)到降糖的作用。本研究對(duì)一株具有潛在的降糖作用的干酪乳桿菌生物學(xué)特性及其在發(fā)酵豆乳中的應(yīng)用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明該菌株具有較好的耐酸、耐膽鹽和黏附的生物特性，耐受膽鹽的延遲時(shí)間為1.01 h，對(duì)Caco-2細(xì)胞具有較強(qiáng)的黏附能力（15個(gè)/cell），并且發(fā)酵豆乳成品風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的感官評(píng)定得分。故該菌株可以作為潛在降糖的益生菌，未來可進(jìn)一步研究開發(fā)出具有降糖作用的新型發(fā)酵產(chǎn)品，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Study on the Biological Characteristics of Lactobacillus casei and Application in the Fermented Soymilk Produce

CHEN Pei1，2，DANG Hui3，4，HE Guo-qi1，WANG Hong-li1，MENG Ke1，CHEN Wei3
（1.Shaanxi Radio&TV University,Xi'an 710119，Shaanxi，China;2.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723001，Shaanxi，China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122，Jiangsu，China;4.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an 710119，Shaanxi，China）

The aim of the present study was to investigate the biological characteristics of a Lactobacillus casei strain with hypoglycemic activity and application in the fermented soymilk produce.The results showed that Lactobacillus casei could grow under strongly acidic conditions,and survive in the simulated gastro-intestinal juice.The bile tolerance of this strain in the form of lag time was 1.01 h.More importantly,it possessed strong adhesive properties to Caco-2 cells （15 bacteria per cell）.The results revealed that Lactobacillus casei grew well in fermented soymilk with good sensory quality.The sensory evaluation score of fermented soymilk produce was 90 points.

Lactobacilus casei；fermented soymilk；biological characteristics

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.005

2016-09-21

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目“益生乳酸菌胞外多糖制備及功能研究”（2015NY025）；陜西廣播電視大學(xué)重點(diǎn)課題“陜南泡菜中優(yōu)質(zhì)菌株的篩選及菌群關(guān)系研究”（15D-08-A02）

陳佩（1983—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品微生物。