李怡文 劉 陽 柳海艷 薛文鑫 李慧云 李 靜

(1 煤炭總醫(yī)院藥學部，北京，100028； 2 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京，100029)

葛花枳椇子配伍使用對醉酒小鼠體內(nèi)乙醇代謝過程的影響

李怡文1劉 陽1柳海艷2薛文鑫1李慧云1李 靜1

(1 煤炭總醫(yī)院藥學部，北京，100028； 2 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，北京，100029)

目的：通過檢測急性乙醇中毒小鼠體內(nèi)乙醇濃度、乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)的在不同時間的變化水平，探討葛花枳椇子配伍應用是否優(yōu)于單獨使用。方法：將ICR小鼠分為空白組、模型組、陽性藥組、單用葛花、枳椇子組及配伍1、2、3組。選取預防給藥的方法，即給藥30 min后灌酒復制模型，分別于酒后0.5 h，1 h，2 h，3 h摘眼球取血及肝臟組織。酶法測定酒后不同時間點小鼠血中乙醇濃度、肝中ADH和ALDH水平。結果:醉酒小鼠血中乙醇濃度在2 h達到峰值，葛花、枳椇子配伍1、2、3組小鼠體內(nèi)乙醇濃度均較模型組顯著降低(P<0.05)；小鼠肝臟中ADH水平在1 h達峰，配伍2、3組可顯著升高小鼠酒后1 h肝臟中ADH的水平(P<0.05)，在2 h、3 h后，只有配伍3組效用較為明顯(P<0.05)；小鼠肝臟中ALDH水平在2 h到達峰值，配伍3組可顯著增加其水平，其余各組有增加的趨勢但差異無統(tǒng)計學意義。結論：葛花、枳椇子配伍使用效果優(yōu)于單獨應用，可降低酒后不同時間點小鼠血中乙醇濃度，其機制可能與激活肝臟中ADH與ALDH活性有關，從而起到預防醉酒的作用。

葛花；枳椇子；配伍；乙醇濃度；乙醇脫氫酶

近年來，隨著經(jīng)濟繁榮及人際交往增多，急性乙醇中毒發(fā)生率也與日俱增。在酒文化歷史悠久的中國，中醫(yī)典籍中關于大量飲酒致病的記載不勝枚舉，如《華佗神醫(yī)秘傳》將其稱為“酒毒”?！吨T病源候論》一書首次提出“酒癖”病名，指出其病機是由于“氣瘀脅肋，結聚成癖”所致。大量飲酒可導致軀體、心理、社會多方面的嚴重損害，尤其是對消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)損害更為明顯[1]請全文規(guī)范參考文獻標注。因此在主觀意識控制下，如何借助藥物有效防治一些無法避免的乙醇攝入，已成為醫(yī)療行業(yè)及從業(yè)者的難題之一[2]。近年來，隨著對傳統(tǒng)中醫(yī)藥的深入研究，逐漸認識到傳統(tǒng)醫(yī)學在防治乙醇中毒方面有一定的優(yōu)勢。葛花、枳椇子在古代文獻中被視為解酒功效顯著的傳統(tǒng)藥對，各代醫(yī)家善將此藥視為君藥，佐以其他藥物治療各種酒病?！侗静菔斑z》中記載葛花辛甘無毒，能“解酒毒，身熱赤……小便赤澀”；《本草綱目》有言：“枳椇子，氣味甘平,能止渴除煩，潤五臟……解酒毒”。藥王孫思邈曾用“園中生枳椇，家中無醉人”來高度評價該藥味解酒毒之力強，現(xiàn)代研究表明葛花與枳椇子中的黃酮、異黃酮能明顯加快體內(nèi)的乙醇代謝，減輕乙醇對肝細胞的氧化損傷等[3-4]。

課題組前期研究結果表明，葛花、枳椇子不同比例配伍，無論是醇提還是水提，對于慢性乙醇性肝損傷大鼠均具有較好的防治作用，其中以葛花、枳椇子2：1比例配伍時對肝損傷大鼠效果更為明顯[5]。對于急性乙醇中毒小鼠，葛花和枳椇子也具有預防醉酒和保護肝臟的作用[6-7]。但兩藥可否配伍用于急性乙醇中毒小鼠以及配伍使用是否優(yōu)于單用兩味中藥還不得而知。因此，本實驗在前期實驗的基礎上，通過檢測小鼠體內(nèi)的乙醇濃度、肝臟中ADH與ALDH含量探討兩味傳統(tǒng)中藥配伍使用的可能性，以期為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 ICR小鼠210只，體重18～20 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號：SCXK(京)2014-0001，適應性喂養(yǎng)一周。

1.1.2 藥物 葛花為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi、甘葛藤P.thomsonii Benth.的花；枳椇子為鼠李科植物枳椇(Hovenia Dulcis Thunb)的干燥成熟帶肉質(zhì)果柄的果實或種子。購于河北安國藥材批發(fā)市場。

葛花提取物：取藥材葛花水中浸泡2 h，分2次提取，以10倍量水煎煮2 h后，傾出煎液后加入8倍量再煎煮1 h。濃縮后配置成含生藥0.4 g/mL溶液待用。枳椇子同葛花溶液配制。混合液提取物：按不同比例(枳椇子∶葛花=1∶1和1∶2和2∶1)。取按比例配好的藥材水中浸泡2 h，提取方法同前。濾過，濃縮至相對密度為1.05，使用前加蒸餾水配制成所需濃度。

陽性藥制備：東寶甘泰片，生產(chǎn)企業(yè)：吉林通化東寶藥業(yè)股份有限公司。用蒸餾水和0.5%CMC配成濃度為0.036 g/mL的溶液。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：56°紅星二鍋頭(北京紅星釀酒股份有限公司)，用于模型復制；注射用生理鹽水(大冢制藥有限公司，生產(chǎn)批號H10987054)；無水乙醇(北京化工廠，生產(chǎn)批號：20140810)；醫(yī)用級肝素鈉(常州千紅生化制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：20130704)；鹽酸氨基脲(北京化學試劑公司，生產(chǎn)批號：20130529)；甘氨酸(北京東勝泰博科技有限公司)；高氯酸(北京化工廠生產(chǎn))；乙醇脫氫酶(ADH)測定試劑盒(南京建成科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20150808)；乙醛脫氫酶(ALDH)測定試劑盒(南京建成科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：20140507)；乙醇脫氫酶(SIGMA公司進口)；氧化型輔酶Ⅰ(SIGMA公司進口)。

儀器：電子分析天平：型號為AEL-160，日本產(chǎn)；臺式高速冷凍離心機：離心機，雷勃爾，LD5-2B0074NL0031；快速混勻器：型號為SK-1，江蘇國華儀器廠；微量移液器：北京青云航空儀表有限公司；752-紫外光柵分光光度計：上海第三分析儀器廠；

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 ICR小鼠按照時間點，將動物分為4批，每組49只，即酒后0.5 h組、1 h組、2 h組、3 h組。各時間點按受試藥物不同分為模型組、陽性藥組、葛花組、枳椇子組、配伍1、2、3組。

1.2.2 給藥方法 空白組與模型組給予等量生理鹽水，陽性對照藥灌服東寶甘泰，其余各組按0.1 mL/10 g體重灌服煎煮制備好的藥液。0.5 h后，除空白組外，其余各組小鼠按分別按0.15 mL/10 g灌胃給予二鍋頭酒。按動物分組方法，小鼠分別于酒后0.5 h、1 h、2 h、3 h行摘眼球取血。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 制作乙醇標準曲線 1)小鼠乙醚麻醉摘眼球取血，滴入預處理的試管內(nèi)(50 μL肝素鈉抗凝)。移液槍從每管中取0.25 mL樣本，加入到離心管中待測，除“0”號管為不含乙醇的對照管外，1、2、3、4、5管的乙醇濃度分別為25、50、75、100、150 mg/dL。2)標準液制備：以上樣本均加入3.4%高氯酸4 mL，吹勻，3 000 r/min離心5 min，取上清即可。3)向上述六只待測管內(nèi)分別加入乙醇脫氫酶(ADH)-氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)液4.9 mL；“0”號管加入0.1 mL蒸餾水為對照品，其余5只各加0.1 mL標準液，室溫靜置60 min。4)標準曲線：選取1 cm比色杯，加入各管中待測樣本，應用752-C紫外-可見分光光度計于340 nm處測定吸光度，詳見圖1?；貧w方程為C=1 179.2A-10.644；r=0.997 8。

圖1 乙醇標準曲線

1.2.3.2 各個給藥組小鼠血液中乙醇含量 小鼠摘眼球取血，滴入事先用肝素鈉抗凝的試管中。從抗凝管中取出0.25 mL樣本，加生理鹽水0.75 mL，其余步驟同1.4.1。根據(jù)吸光度值，通過標準曲線求出各樣品的乙醇含量(mg/dL)。

1.2.3.3 各個給藥組小鼠肝臟中ADH與ALDH含量水平 以上各組小鼠摘眼球取血后，于冰浴上取出同一部位肝組織(左葉)，濾紙吸凈后用玻璃勻漿器制備勻漿，高速離心機4 ℃，3 000 r/min，5 min，取上清待測。空白管加蒸餾水0.2 mL，1 cm比色杯內(nèi)加0.0021 mol NAD 2.8 mL，混勻后在340 nm調(diào)0和100；樣品管加0.3 mol乙醇和上清液各0.1 mL，觀測其5 min內(nèi)吸收度的變化率△A/min，并計算ADH和ALDH活性。

計算公式為：

2 結果

2.1 單用及不同比例配伍對醉酒小鼠血中乙醇濃度的影響 采用預防給藥的方法進行試驗，結果表明，白酒灌胃0.5 h后，模型組小鼠血液中乙醇濃度顯著升高，配伍1、3組能顯著降低小鼠血液中乙醇濃度(P<0.05)，其余各組有降低的趨勢(P>0.05)。

白酒灌胃1 h后，小鼠血液中乙醇濃度持續(xù)升高，陽性藥組、配伍3組能顯著降低小鼠血液中乙醇濃度(P<0.05，P<0.01)，其余各組有降低的趨勢。

白酒灌胃2 h后，小鼠血液中乙醇濃度到峰，3小時后各組均有回落。在這2個時間點，陽性藥組、配伍1、2、3組小鼠血液中乙醇濃度均較模型組顯著下降(P<0.05，P<0.01)。

2.1 單用及不同比例配伍對醉酒小鼠肝中ADH活性的影響 酒后0.5 h，模型組及各個給藥組小鼠肝臟中ADH值較空白組顯著升高(P<0.05)，表明模型復制成功；與模型組比較，除陽性藥組能顯著升高小鼠肝臟中ADH水平(P<0.05)其余各給藥組只有升高該酶的趨勢(P>0.05)。

酒后1 h，模型組與各個給藥組小鼠肝臟中的ADH到達峰值，與模型組比較，陽性藥物組、配伍2、3組小鼠肝臟中ADH水平顯著升高(P<0.05)。

酒后2 h，模型組與各個給藥組小鼠肝臟中的ADH開始回落，陽性藥組、葛花組、配伍3組小鼠肝臟中ADH水平還保持較高濃度，與模型組差異有統(tǒng)計學意義。

酒后3 h，模型組與各個給藥組小鼠肝臟中的ADH降至低點，唯有配伍3組較模型組小鼠肝臟中ADH濃度顯著升高(P<0.05)。

該數(shù)據(jù)與小鼠血液中的乙醇濃度的變化趨勢相吻合，1～1.5 h激活體內(nèi)ADH酶活性，但發(fā)揮解酒作用還需一定時間，因此在2 h檢測小鼠血液中乙醇濃度是出于最高點，而后慢慢回落的過程。肝中ADH活性與乙醇在體內(nèi)的代謝有著必然聯(lián)系，該酶活性升高這可能是降低血中乙醇濃度的原因之一。見表2。

2.3 單用及不同比例配伍對醉酒小鼠肝中ALDH活性的影響 酒后0.5 h，除配伍2組，其余各組小鼠肝臟中ALDH值均較空白組顯著升高(P<0.05)，表明模型復制成功；與模型組比較，各組有升高小鼠肝臟中ALDH水平的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

酒后1 h，有升高小鼠肝臟中ALDH水平的趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

酒后2 h，模型組與各個給藥組小鼠肝臟中的ALDH水平到達峰值，與模型組比較，陽性藥物組與配伍3組升高小鼠肝臟中ALDH水平的作用較為明顯(P<0.05)。

酒后3 h，各組小鼠肝臟中的ALDH濃度開始回落，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 單用及不同比例配伍對醉酒小鼠血中乙醇濃度的影響

注：*P<0.05；**P<0.01

表2 不同組別對急性乙醇中毒小鼠肝中ADH活性的影響

注：*P<0.05；**P<0.01；△P<0.05；△△P<0.01

表3 單用及不同比例配伍對醉酒小鼠肝中ALDH活性的影響

注：*P<0.05；**P<0.01；△P<0.05；△△P<0.01

該數(shù)據(jù)與小鼠肝臟中實測乙醇脫氫酶的變化趨勢有一定的吻合之處，但葛花與枳椇子及其不同配伍組合對于乙醛脫氫酶的改善作用不及對乙醇脫氫酶的變化明顯。見表3。

3 結論

檢測小鼠血中乙醇濃度一方面可以反應體內(nèi)乙醇脫氫酶的活性，另一方面也可以反應肝損傷的程度。對于基礎研究常選用化學法、酶法、直接氣相色譜法、頂空氣相色譜法等進行檢測。Cope采用了熱解吸毛細管氣相色譜法來檢測小鼠內(nèi)源性乙醇濃度，此法具有樣品用量少、靈敏度高等特點[8]，但對于樣本純度與數(shù)量有著較高要求，大樣本測試不宜選用[9]；酶法其靈敏度較氣相色譜法稍差，但特異性強。結合實驗室條件，考慮到實驗樣本較多，故采用酶法對小鼠血中乙醇濃度進行測定。

人體對乙醇的代謝速率因人而異，其中胃的排空速率是其決定因素。乙醇經(jīng)胃排空到達肝臟，其中80%～90%在肝臟內(nèi)代謝，2%～10%由腎臟和肺臟排泄。肝是乙醇代謝最主要的器官，含有3種可以氧化乙醇的重要酶系：即ADH、微粒體乙醇氧化酶系和過氧化物。乙醇的代謝可分為3步：1)80%的乙醇經(jīng)肝中的乙醇脫氫酶催化使乙醇氧化成乙醛，此反應為可逆反應。2)經(jīng)乙醛脫氫酶的催化，乙醛氧化成乙酸，進入三羧酸循環(huán)，此反應不可逆。3)乙酸從肝臟進入血液循環(huán)并激活乙酰輔酶A。有文獻表明，空腹飲酒后，乙醇可在30～90 min完全吸收入血，達到峰值[10]。本實驗結果提示，葛花枳椇子配伍1、2、3組均可降低酒后2 h的血中乙醇濃度，與文獻報道基本吻合[11]。

一次性大量飲酒可造成急性乙醇中毒，乙醇進入人體以后，三大酶系立即啟動。乙醇氧化途徑或過氧化氫途徑代謝會產(chǎn)生大量的乙醛和自由基，對人體造成損害。尤其是當人體一次性大量攝入乙醇，導致乙醇脫氫酶活性降低時，乙醇就會通過另外2個途徑代謝。正常情況下，ADH與ALDH在肝臟中含量最高，有當肝細胞受損時，ADH與ALDH由肝細胞內(nèi)釋放入血，從而引起ADH與ALDH含量升高，所以檢測ADH與ALDH活性是診斷某些肝臟疾病的指標之一。本實驗采取測定單位時間內(nèi)生成的NADH引起的吸收度變化率的方法，測定ADH與ALDH活性的變化，試圖闡述葛花與枳椇子這2種藥物對乙醇的代謝與這2種酶是否相關[12]。

基于本實驗結果，小鼠酒后肝中ADH與ALDH活性的改變規(guī)律，可看出酒后1～2 h內(nèi)，肝中ADH活性增強，隨之血中乙醇濃度的增高，酒后1 h，乙醇脫氫酶及乙醛脫氫酶的肝臟中的含量顯著上升，乙醇脫氫酶于1 h達峰，乙醛脫氫酶于1.5 h達峰，而后開始下降，與小鼠血中乙醇濃度達峰值時間基本吻合。葛花枳椇子單用及配伍的各個組藥效也不盡相同，各個給藥組對肝中ADH含量的影響較ALDH含量明顯。提示該藥對配伍發(fā)揮作用主要是在乙醇的吸收階段，而對于乙醇分解代謝階段，作用不甚明顯。

本實驗在前期實驗的基礎上[13-14]，從傳統(tǒng)解救藥對葛花枳椇子配伍角度出發(fā)，通過對急性乙醇中毒小鼠體內(nèi)乙醇濃度、ADH與ALDH含量變化提示配伍使用比單用一種藥物預防醉酒效果更佳，為臨床應用葛花、枳椇子這一傳統(tǒng)解酒藥對防治急性乙醇中毒提供依據(jù)，為傳統(tǒng)中藥的成果轉(zhuǎn)化提供數(shù)據(jù)支持。

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(2017-01-01收稿 責任編輯：徐穎)

Effectiveness of Compatibility of Flos Puerariae and Semen Hoveniae on metabolic process of alcohol for acute alcoholism mice

Li Yiwen1, Liu Yang1, Liu Haiyan2, Xue Wenxin1, Li Huiyun1, Li Jing1

(1Departmentofpharmacy,ChinaMeitanGeneralHospital,Beijing100028，China; 2CollegeofBasicMedicine，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China)

Objective:To discuss whether using the compatibility of Flos Puerariae and Semen Hoveniae or use them respectively was better through testing the changes of alcohol concentration, alcohol dehydrogenase (ADH), aldehyde dehydrogenase (ALDH) in acute alcoholism mice at different time points. Methods:ICR mice were randomly divided into control group, model group, positive group, Flos Puerariae(FP) group, Semen Hoveniae(SH) group, and combination group 1,2,3. Preventive administration method was taken, that was, feeding the mice alcohol to establish the model after 30 min administration. The blood and liver tissue were collected after 0.5 h,1 h, 2 h and 3 h respectively.The concentration of ethanol and the activity of ADH and ALDH in liver at different time point were measured by biochemical enzyme method. Results:The concentration of ethanol in blood reached the peak 2 h after intragastric administration. Compared with the model group, concentration of ethanol in blood in combination group 1,2,3 significantly decreased after 2 h (P<0.05); the level of ADH in the liver of mice reached peak 1 h later, and combination group 2,3 can significantly enhance liver ADH activity 1 h later for the drunken mice (P<0.05). Only combination group 3 was obvious effective in 2 h, 3 h; the level of ALDH in the liver of mice reached a peak at 2 h, and the combination group 3 had a significant increase. As for other groups, they tend to increase but the difference was not statistically significant.Conclusion:The effect of compatibility of Flos Puerariae and Semen Hoveniae was better than single application, it can decrease the concentration of alcohol in the blood of mice. Activating the activity of ADH and ALDH in the liver, inhibit the absorption of ethanol in the digestive tract may play a preventive role.

Flos Puerariae; Semen Hoveniae; Compatibility; Concentration of alcohol; Aldehyde dehydrogenase

煤炭總醫(yī)院科研基金資助項目(K201412) 作者簡介：李怡文(1984.09—)，女，博士，主管藥師，研究方向：中醫(yī)臨床藥學，E-mail：liyiwenjackie@sina.cn

李靜(1962.01—)，女，研究生，主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學，E-mail：lijing0127@sina.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.08.041