韓潔茹 解 穎 劉淑蘭 孟 璐 王書惠

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱,150040; 2 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院,牡丹江,157011)

實(shí)驗(yàn)研究

資生腎氣丸對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1表達(dá)水平的影響

韓潔茹1解 穎1劉淑蘭1孟 璐1王書惠2

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱,150040; 2 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院,牡丹江,157011)

目的:觀察資生腎氣丸對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中白介素1β(IL-1β)及大鼠滑膜半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶-1(Caspase-1)的表達(dá)水平的影響,探討資生腎氣丸防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(GA)的作用機(jī)制。方法:將84只SD大鼠隨機(jī)分為7組:空白組、模型組、中藥痛風(fēng)舒對(duì)照組、西藥秋水仙堿對(duì)照組及資生腎氣丸復(fù)方低、中、高劑量組,每組12只。采用尿酸鈉聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導(dǎo)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型,應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)各組大鼠血清中IL-1β含量,應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)大鼠滑膜Caspase-1含量。結(jié)果:模型組和空白組IL-1β、Caspase-1含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);西藥秋水仙堿對(duì)照組、資生腎氣丸復(fù)方低、中、高劑量組IL-1β和Caspase-1含量與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);中藥中劑量組與痛風(fēng)舒對(duì)照組比較,IL-1β、Caspase-1含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),但與西藥對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。結(jié)論:資生腎氣丸可影響痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠IL-1β和Caspase-1表達(dá),對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有防治作用。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;資生腎氣丸;IL-1β;Caspase-1;實(shí)驗(yàn)研究

骨與關(guān)節(jié)疾病是一種常見(jiàn)病和多發(fā)病,是造成長(zhǎng)期劇烈疼痛和殘疾的主要因素,WTO將骨關(guān)節(jié)病與心腦血管疾病、腫瘤癌癥列為人類健康的三大殺手[1],其中,痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Gouty Arthritis,GA)是最常見(jiàn)和疼痛最明顯的骨關(guān)節(jié)疾病之一,已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的一種的代謝性疾病。GA的發(fā)病機(jī)制是由于尿酸鈉(MSU)或尿酸鈉結(jié)晶從細(xì)胞外液沉積于關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)軟骨等組織器官,導(dǎo)致滑膜及關(guān)節(jié)周圍組織的炎性反應(yīng)[2]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)屬痹證范疇,為本虛標(biāo)實(shí)之證,其受累的關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅、腫、熱、痛的表現(xiàn),并且活動(dòng)受限[3]。姜德友教授提出從腎論治痛風(fēng)的學(xué)術(shù)觀點(diǎn),以補(bǔ)腎利濕法予以治療,由此思路選擇宋·嚴(yán)用和《濟(jì)生方》中資生腎氣丸化裁,臨證用之,頗多效驗(yàn)。本課題前期實(shí)驗(yàn)已驗(yàn)證[4-5],資生腎氣丸中藥復(fù)方顯示出良好的抗炎及鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)就其對(duì)GA大鼠模型血清中特異的炎性反應(yīng)因子白介素1β(IL-1β)和滑膜炎性反應(yīng)因子半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶-1(Caspase-1)的影響開(kāi)展研究,探討資生腎氣丸中藥復(fù)方防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗炎作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠84只,體重(180±20)g,由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供(合格證編號(hào):SCXK(黑)2008004)。在溫度20～22 ℃,相對(duì)濕度30%～35%通風(fēng)良好的動(dòng)物室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物 資生腎氣丸中藥復(fù)方湯劑(熟地黃、澤瀉、山茱萸、懷牛膝、牡丹皮、萆薢、車前子等),由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)藥制劑科提供,將中藥原液分別按1.87∶1,3.74∶1,7.48∶1濃縮為實(shí)驗(yàn)藥液,經(jīng)高溫消毒后封瓶,置于冰箱中保存?zhèn)溆?。秋水仙堿片(云南昊邦制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H53021798,生產(chǎn)批號(hào)140807)。使用前將秋水仙堿片放入研缽內(nèi)研成細(xì)末,過(guò)篩,加滅菌注射用水配置成0.05 mg/mL秋水仙堿混懸液,置于冰箱保存?zhèn)溆?。痛風(fēng)舒片(湖北綠金子藥業(yè)有限責(zé)任公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090687,批號(hào):140301)。使用前將痛風(fēng)舒片放入研缽內(nèi)研成細(xì)末,過(guò)篩,加滅菌注射用水配置成0.1 g/mL痛風(fēng)舒片混懸液,置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 氧嗪酸鉀鹽(OXO)(美國(guó)Sigma公司提供,生產(chǎn)批號(hào)CAS2207-75-2);微晶尿酸鈉結(jié)晶(MSU)(美國(guó)Sigma公司提供,生產(chǎn)批號(hào)CAS1198-77-2)。Caspase-1和IL-1β試劑盒(北京誠(chéng)森生物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)批號(hào):201501)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將84只健康SD大鼠,隨機(jī)分為7組,分別為空白組、模型組、中藥痛風(fēng)舒對(duì)照組、西藥秋水仙堿對(duì)照組、資生腎氣丸復(fù)方低劑量組、資生腎氣丸復(fù)方中劑量組、資生腎氣丸復(fù)方高劑量組,每組12只?？瞻捉M只采用BD針將0.2 mL生理鹽水注入到大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔內(nèi)。其余6組按以下方法GA造模:用3%OXO混懸溶液按大鼠體重注射1 mL/100 g的劑量進(jìn)行腹腔內(nèi)注射,15 min后用BD針將0.2 mL MSU混懸溶液注入到大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔內(nèi)[6]。

1.2.2 給藥方法 大鼠灌胃1 mL/100 g溶液為標(biāo)準(zhǔn),空白組和模型組均用生理鹽水灌胃,中藥痛風(fēng)舒對(duì)照組和西藥秋水仙堿對(duì)照組分別用痛風(fēng)舒片溶液和秋水仙堿溶液灌胃,資生腎氣丸復(fù)方低、中、高劑量組分別給予相應(yīng)資生腎氣丸實(shí)驗(yàn)溶液灌胃,2次/d,連續(xù)7 d,末次給藥1 h后造模。

1.2.3 取材方法 造模4 h后,各組大鼠給予10%水合氯醛腹腔麻醉后心臟取血,4 ℃ 4 000 r/min離心10 min,取上清液,置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存,待測(cè)。解剖大鼠右膝關(guān)節(jié),用銳利的刀片切取大鼠受試關(guān)節(jié)的滑膜組織,用等滲生理鹽水漂洗滑膜組織,去除表面附著的肌肉組織、血液等,迅速置于無(wú)水乙醇溶液中固定24 h,待免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β含量測(cè)定 從圖表1可以看出:模型組血清IL-1β含量較空白組增高明顯(P<0.01),各觀察組經(jīng)治療后血清IL-1β含量與模型組比較顯著下降,但仍高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與痛風(fēng)舒對(duì)照組比較,秋水仙堿對(duì)照組血清IL-1β含量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),資生腎氣丸復(fù)方中劑量組血清IL-1β含量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與資生腎氣丸復(fù)方高劑量組比較,資生腎氣丸復(fù)方中劑量組和秋水仙堿對(duì)照組血清IL-1β含量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與資生腎氣丸復(fù)方低劑量組比較,資生腎氣丸復(fù)方中劑量組血清IL-1β含量下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);資生腎氣丸復(fù)方中劑量組與秋水仙堿對(duì)照組比較,血清IL-1β水平降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明各給藥組均能降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β水平,但以資生腎氣丸復(fù)方中劑量組和西藥秋水仙堿組療效較好。

2.2 Caspase-1表達(dá)測(cè)定 各組大鼠取滑膜組織按常規(guī)制作石蠟切片,免疫組織化學(xué)染色Caspase-1,每張切片通過(guò)Motic3000顯微攝影系統(tǒng)攝影隨機(jī)攝取3個(gè)視域,采用麥克奧迪image advanced3.2病理圖像分析系軟件進(jìn)行分析,計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的平均灰度值(0-255),陽(yáng)性表達(dá)為淡黃色或棕黃色見(jiàn)圖1～7。見(jiàn)表1。

表1 資生腎氣丸復(fù)方對(duì)各組大鼠血清中IL-1β與滑膜中Caspase-1含量的比較

注:與空白組比*P<0.01;與模型組比△P<0.01;與中藥痛風(fēng)舒對(duì)照組比較，▲P<0.05;與西藥秋水仙堿對(duì)照組比□P>0.01

圖1 各組大鼠滑膜組織病理圖

從以上圖表1可以看出:與空白對(duì)照組比較,模型組Caspase-1的表達(dá)明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,痛風(fēng)舒對(duì)照組經(jīng)治療后滑膜Caspase-1表達(dá)下降,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);資生腎氣丸復(fù)方低、中、高劑量組及秋水仙堿對(duì)照組與模型組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與痛風(fēng)舒對(duì)照組比較,秋水仙堿對(duì)照組和資生腎氣丸復(fù)方中劑量組滑膜Caspase-1表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果說(shuō)明各給藥組均能降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織Caspase-1表達(dá),但以資生腎氣丸復(fù)方中劑量組和西藥秋水仙堿組療效較好。

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是一種作為臨床病癥而被人們認(rèn)識(shí)的最古老疾病之一[7],血液或滑囊液中的尿酸鈉鹽濃度達(dá)到飽和狀態(tài),尿酸鈉鹽從超飽和的細(xì)胞外液沉積出來(lái),即在關(guān)節(jié)滑膜、軟骨等組織器官出現(xiàn)結(jié)晶沉淀,導(dǎo)致滑膜及關(guān)節(jié)周圍組織的炎性反應(yīng)[8],這是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎形成的基礎(chǔ)。MSU結(jié)晶體脫落、沉積致關(guān)節(jié)腔時(shí),可以引起更多炎性遞質(zhì)釋放,從而引起一系列炎性反應(yīng)[9],而典型的炎性反應(yīng)則表現(xiàn)為局部充血、水腫,關(guān)節(jié)腔中大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維素滲出,則沉積部位出現(xiàn)組織凝固性壞死以及結(jié)締組織細(xì)胞間質(zhì)纖維變性,關(guān)節(jié)局部表現(xiàn)為明顯紅腫、劇烈疼痛和局部溫度升高。

現(xiàn)代研究證實(shí),IL-1β的功能主要包括1)參加炎性反應(yīng);2)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng);3)促進(jìn)組織損傷的修復(fù);4)調(diào)控神經(jīng)生物效應(yīng)。Chapman等證實(shí)MSU晶體刺激關(guān)節(jié)滑液中吞噬細(xì)胞和單核細(xì)胞引起IL-1的大量釋放,并認(rèn)為IL-1β是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)炎性反應(yīng)遞質(zhì)[10]。Giovine認(rèn)為IL-1β在急慢性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中都起非常重要作用,被認(rèn)為是最經(jīng)典的炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[11]。國(guó)外許多專家、學(xué)者發(fā)現(xiàn)并證明IL-1β是前炎性反應(yīng)網(wǎng)鏈中的一級(jí)細(xì)胞因子,在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)生時(shí),IL-1β能造成局部pH值降低,更有利于尿酸鹽結(jié)晶的沉積,形成惡性循環(huán),作為炎性反應(yīng)激活因子和趨化因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),GA模型大鼠血清中IL-1β的水平明顯增高,而在西藥秋水仙堿對(duì)照組、資生腎氣丸復(fù)方低、中、高劑量組的干預(yù)下,IL-1β均有不同程度的下調(diào),以西藥秋水仙堿對(duì)照組和資生腎氣丸復(fù)方中劑量組下調(diào)最為明顯。提示IL-1β和IL-18可能參與了GA的發(fā)病;資生腎氣丸中藥復(fù)方與秋水仙堿作用相似,可能降低GA大鼠模型血清IL-1β和IL-18含量來(lái)減輕、阻斷炎性反應(yīng),從而達(dá)到抗炎的作用。

Caspase-1又稱白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶(Interleukin-1β Converting Enzyme,ICE),Caspase-1主要參與白介素前體的活化,主要作用是參與細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。Caspase-1存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi),主要由單核細(xì)胞合成,常以無(wú)活性的酶原形式存在。當(dāng)機(jī)體感受到危險(xiǎn)信號(hào)后,形成炎性體(如NALP3),使無(wú)活性的Caspase-1酶原通過(guò)自動(dòng)加工活化,活化的Caspase-1可以在位點(diǎn)為Tyr-Val-His-Asp116/Ala117處,將31 kD的IL-1β前體剪切成IL-1β,還能在IL-18前體Asp36處剪切成為成熟的IL-18[12]。目前研究表明,在關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)中,Caspase-1下游產(chǎn)物——IL-1β和IL-18所形成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)對(duì)GA的發(fā)病扮演重要作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)各組大鼠滑膜中Caspase-1表達(dá),研究發(fā)現(xiàn):與空白組比較,GA模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Caspase-1表達(dá)增強(qiáng);與模型組比較,西藥秋水仙堿對(duì)照組及資生腎氣丸復(fù)方高、中、低劑量均對(duì)滑膜組織Caspase-1的表達(dá)有不同程度下調(diào),其中以資生腎氣丸復(fù)方中劑量組下調(diào)最為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。從而提示:Caspase-1在GA大鼠模型滑膜組織中處于高表達(dá),而在降低Caspase-1表達(dá)水平上,資生腎氣丸復(fù)方中劑量組優(yōu)于其他組,這可能是其防治GA的作用機(jī)制之一。

對(duì)于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病因病機(jī),現(xiàn)代醫(yī)家越來(lái)越注重體質(zhì)及先天稟賦的重要性,同時(shí)亦強(qiáng)調(diào)后天的調(diào)攝。如房氏[13]認(rèn)為,本病的主要病機(jī)為先天稟賦不足,腎氣虧虛,由于腎司二便的功能失調(diào),濕濁排泄減少;又加之平素嗜食膏粱厚味,傷及脾胃,運(yùn)化無(wú)權(quán),就使得濕濁內(nèi)聚,久則化熱,流注關(guān)節(jié)、肌肉,閉阻經(jīng)脈,致關(guān)節(jié)部位紅、腫、熱、痛、重著、麻木、屈伸不利等癥狀。蓋氏[14]認(rèn)為致痹之病邪非受自于外,而主生于內(nèi)。大凡痛風(fēng)者,多有先天稟賦不足;或因命火不能暖坤土而導(dǎo)致素體脾虛;又或年事已高,臟氣日衰,若加之調(diào)攝失宜,如飲食不節(jié),過(guò)食肥甘厚味,久之,必將致使脾失健運(yùn),無(wú)以升清降濁無(wú)權(quán);腎乏氣化,而水失總司,于是水谷不歸正化,痰濕內(nèi)生,滯留血中進(jìn)而瘀結(jié)為患。所以在治療GA時(shí)要考慮固護(hù)腎氣,扶正祛邪。故本課題組采用補(bǔ)腎利濕法指導(dǎo)臨床用藥,以資生腎氣丸為代表方進(jìn)行加減。藥物組成有熟地黃、山藥、澤瀉、山茱萸、茯苓、懷牛膝、萆薢等,以補(bǔ)腎利濕為主,兼以祛濕止痛。并且目前已發(fā)現(xiàn)資生腎氣丸中茯苓等單味中藥都具有降尿酸作用[15],復(fù)方中藥經(jīng)過(guò)配伍,能夠多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)治療痛風(fēng),同時(shí)可以減輕單味藥的帶來(lái)的不良反應(yīng),提高用藥的安全性。

資生腎氣丸復(fù)方中藥可以明顯降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中IL-1β和滑膜中caspase-1的活性,緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)癥狀。在防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)中,資生腎氣丸復(fù)方中藥表現(xiàn)出較好的抗炎作用,以期為指導(dǎo)臨床用藥和新藥研發(fā)提供方向。

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(2017-04-19收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effect of Zisheng Shenqi Decoction on Expression of IL-1β and Caspase-1 in Gouty Arthritis Rats

Han Jieru1,Xie Ying1,Liu Shulan1,Meng Lu1,Wang Shuhui2

(1HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Haerbin150040,China; 2Departmentofurinarysurgery,
MudanjiangMedicalUniversityaffiliatedHongqiHospital,Mudanjiang157011,China)

Objective:To observe the effect of Zisheng Shenqi Decoction on expression of IL-1β and Caspase-1 in gouty arthritis rats and to explore the mechanism of Zisheng Shenqi Decoction in the treatment of GA.Methods:Eighty four rats were randomly divided into seven groups:blank control group,model group,herbal control group,western medicine control group,high dosage herbal group,medium dosage herbal group and low dosage herbal group,twelve rats in each group.The uric acid sodium and oxygen polybenzoxazines potassium were used to induce rat gouty arthritis model.ELISA was used to detect the concentration of serum IL-1β in rats and analyze the data.Using immunohistochemical method to detect the contents of synovial Caspase-1 in rats.Results:The differences of IL-1β and Caspase-1 level between model group and blank group had statistical significance(P<0.01).The expression of IL-1β and Caspase-1 in model group was also apparently different from that in western medicine control group,highdosage herbal group,medium dosage herbal group and low dosage herbal group,the differences had statistical significance(P<0.01);The expression of IL-1β and Caspase-1 in medium dosage herbal group was apparently different from that in herbal control group(P<0.01),but had not apparently difference from western medicine control group(P>0.01).Conclusion:Zisheng Shenqi Decoction can inhibit the expression of IL-1β and Caspase-1 in gouty arthritis rats.It has certain curative effect gouty arthritis.

Gouty arthritis;Zisheng Shenqi Decoction;IL-1β;Caspase-1;Experimental studies

黑龍江省教育廳基金項(xiàng)目(1254b022);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173170);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基金項(xiàng)目(201107) 作者簡(jiǎn)介:韓潔茹(1982.07—),女,博士研究生,副教授,教研室主任,研究方向:經(jīng)方治療內(nèi)科疑難雜病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究,E-mail:87569229@qq.com

王書惠(1981.01—),女,碩士研究生,講師/主治醫(yī)師,研究方向:經(jīng)方治療內(nèi)科疑難雜病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究，E-mail：bcf55555@163.com

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.08.037