高志鵬， 陳康勇， 郭佳婧

(1.湖南農業(yè)大學 動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.水產高效健康生產湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000； 3.湖南省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，湖南 長沙 410125)

抗生素與抗菌藥物協(xié)同作用防控生物膜的研究進展

高志鵬1,2， 陳康勇1， 郭佳婧3*

(1.湖南農業(yè)大學 動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.水產高效健康生產湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000； 3.湖南省農業(yè)科學院 農產品加工研究所，湖南 長沙 410125)

生物膜(Biofilm)是指微生物為適應周圍環(huán)境，黏附于介質表面并被其自身分泌的胞外基質包裹而形成的一種復雜的、高度異質的聚合結構。生物膜對宿主防御和藥物具有很強的抵御能力，使用單一藥物防治往往效果不顯著，而利用協(xié)同作用將不同抗菌藥物的優(yōu)勢聯(lián)合起來用于生物膜的防控則優(yōu)勢明顯。重點闡述了抗生素與抗生素、抗生素與中藥、抗生素與噬菌體、抗生素與酶的協(xié)同作用研究，以期為生物膜的防控提供新思路。

協(xié)同作用；生物膜防控；抗生素；抗菌藥物

生物膜是指微生物為適應周圍環(huán)境，黏附于生命的或非生命的介質表面，并被其自身分泌的胞外基質包裹而形成的一種穩(wěn)定的、緊密的、復雜的、高度異質的聚合三維網狀結構[1]。細菌分泌的大量胞外聚合物使生物膜形成相對堅固嚴實的結構。研究表明，幾乎所有的細菌都可以形成生物膜[2]，生物膜的形成基本分為5個時期：浮游狀態(tài)、黏附、微菌落形成、成熟生物膜形成和離散。據(jù)統(tǒng)計，80%的細菌性疾病與細菌生物膜有關[3]，細菌可在人體組織如牙齒、皮膚、肺、尿道等器官的表面形成生物膜，導致一系列的感染并發(fā)癥，可引起人類的許多慢性和難治感染性疾病，如齲齒、牙周病、慢性支氣管炎、血栓性靜脈炎、難治性肺部感染和心內膜炎等[4]。生物膜參與65%以上的感染，尤其是與醫(yī)療器械相關的、機體表面的(如皮膚、軟組織等)和慢性感染，原因主要是生物膜對宿主防御和抗菌藥物具有很強的抵御能力[5-7]。與浮游態(tài)細菌相比, 形成生物膜的細菌的標志性特性就是其成熟的生物膜具有很強的耐藥性，其抗藥能力甚至能達到浮游態(tài)細菌的1 000倍[8]。而已在體外藥敏試驗確定為有效的抗生素，也只能短暫緩解生物膜引起的疾病。因此，篩選適宜的防控生物膜的藥物已成為研究熱點。

目前，已經篩選出多種單一藥物用于生物膜防控。例如，兩棲動物皮膚抗菌肽和人胸腺素β4片段都具有抑制生物膜的活性，可用于研發(fā)抗銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)生物膜的藥物[9-10]，阿奇霉素可有效抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生物膜的形成[11]。然而單一藥物的使用存在毒副作用大，易產生耐藥性等缺點，因此越來越多的研究探索利用不同藥物的協(xié)同作用進行生物膜防控。協(xié)同作用將不同抗菌藥物的優(yōu)勢聯(lián)合起來，具有以下優(yōu)勢：減少各有效成分藥物的用量；減輕劑量依賴性和毒性；增強治療效果；加快藥物的分解代謝速度。很多研究已經證實協(xié)同作用相對于單一藥物作用的優(yōu)勢。例如,硝酸銀與地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)產生的脂肽類生物表面活性劑V9T14聯(lián)合作用于大腸埃希菌(Escherichia coli)生物膜，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)用時的硝酸銀劑量比其單用時降低了99.2%～99.6%[12]。替加環(huán)素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)有一定的抑菌活性，而當替加環(huán)素與慶大霉素聯(lián)用時則可完全破壞生物膜[13]。根據(jù)研究中使用的協(xié)同藥物的種類，本文從抗生素與抗生素、抗生素與中藥、抗生素與噬菌體、抗生素與酶等角度闡述了協(xié)同作用在生物膜防控領域的應用，以期為相關研究提供參考。

1 抗生素與抗生素的協(xié)同作用

抗生素是人類對抗疾病的重要武器，然而抗生素的濫用卻導致了細菌耐藥性的出現(xiàn)。很多研究表明，即使某種抗生素對浮游態(tài)細菌有很好的控制或殺滅作用，但其在防控生物膜時效果并不理想，例如，對頭孢他啶敏感的銅綠假單胞菌在形成生物膜后對頭孢他啶產生耐藥性，因為在生物膜的藥物滲透屏障作用下，大部分抗生素因無法穿透生物膜與細菌接觸而失效[14]。因此，許多研究者開始探索利用抗生素與抗生素的協(xié)同作用防控生物膜。利用一種抗生素在生物膜中打開“通道”，從而有利于另一種對生物膜內細菌敏感的抗生素通過“通道”殺滅生物膜內部細菌。例如，在體內和體外試驗中，利福平與磷霉素聯(lián)合使用可有效提高對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的抑制效果，磷霉素通過破壞生物膜的結構提高利福平對生物膜的滲透性[15]。大環(huán)內酯類抗生素如紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素和磷霉素均可抑制銅綠假單胞菌生物膜重要成分藻酸鹽的合成和群體感應系統(tǒng)自身誘導分子的合成，從而使生物膜的結構受到破壞，導致生物膜上形成通向生物膜內部的“通道”，消除了藥物滲透屏障，使協(xié)同藥物美洛培南、喹諾酮類抗生素可以利用“通道”穿透生物膜，達到殺滅生物膜內部細菌的目的[16-17]。由此可見,“打開通道”主要是指抑制生物膜基質的形成和破壞生物膜的結構?？傊股嘏c抗生素的協(xié)同作用不但能降低細菌的耐藥性，而且克服了藥物劑量依賴性，對于生物膜的防控具有重要意義。

2 抗生素與中藥的協(xié)同作用

菌耐藥性的產生是在抗生素選擇性壓力下，細菌為了適應環(huán)境發(fā)生變異而進化的結果。而中藥作為新型抗微生物因子和協(xié)作藥物的有效資源，具有毒副作用小、不易產生耐藥性、效果持久等優(yōu)點[18]。五倍子、黃芩、黃連、黃柏、金銀花、穿心蓮、連翹、吳茱萸、龍膽草、大黃、魚腥草等中藥都具有顯著的抗菌作用。中藥與抗生素聯(lián)合使用在防控生物膜方面有不同程度的增效作用，中藥能介導抗生素進入生物膜，并且提高耐藥菌對抗生素的敏感性，降低細菌對固體介質表面的黏附能力，使抗生素最大限度地殺滅細菌，從而有效防控生物膜[19]。目前，抗生素與中藥的協(xié)同作用研究主要是圍繞銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌開展的。例如，金銀花水煎液在體外能降低銅綠假單胞菌對固體表面的黏附能力以及生物膜形成能力，并破壞已形成的生物膜，增強慶大霉素對生物膜內部細菌的清除作用[20]。穿心蓮內酯能增強銅綠假單胞菌生物膜通透性，有利于左氧氟沙星滲進生物膜內的細菌，提高左氧氟沙星對銅綠假單胞菌的抗菌活性[21]。此外，以金銀花為主要成分的雙黃連溶液、中藥提取物銀翹散、黃芩提取物黃芩苷、魚腥草素鈉、苦參水溶液、大蒜素等中藥均能與抗生素協(xié)同作用于銅綠假單胞菌生物膜。五倍子提取物可降低金黃色葡萄球菌生物膜活性，破壞其結構完整性，與克林霉素聯(lián)合使用可顯著提高鈦板表面金黃色葡萄球菌生物膜的清除率[22]。單用五倍子對浮游態(tài)的金黃色葡萄球菌有很好的抑菌和殺菌作用，但對生物膜內部細菌作用較弱，而阿奇霉素可降低細菌的黏附能力，抑制生物膜的形成，有效促進五倍子穿透生物膜，五倍子與阿奇霉素聯(lián)合使用顯著增強了對金黃色葡萄球菌生物膜的防治效果[23]。穿心蓮內酯、黃芩苷、黃芩素等中藥提取物都具有抗金黃色葡萄球菌生物膜的特性，可為抗生素與中藥的協(xié)同作用提供參考。然而中藥防控生物膜的作用機理尚不明確，關于中藥如何干預生物膜的形成、群體感應系統(tǒng)、細胞內信號轉導和基因表達等方面的研究還處于初級階段。因此，在篩選具有良好協(xié)同作用的中藥的同時，應加強其作用機理方面的研究。

3 抗生素與噬菌體的協(xié)同作用

噬菌體(Bacteriophage)在自然界中分布廣泛，是指一類能特異性感染細菌、真菌、放線菌和螺旋體等微生物的病毒的總稱。相比抗生素,噬菌體防治生物膜具有用量少,療效高,可作用于不同成熟程度生物膜等方面的優(yōu)勢。噬菌體可裂解細菌的細胞壁，并快速繁殖、釋放大量子代噬菌體，從而短時高效地破壞生物膜[24]。在此反應過程中，主要效應物質是噬菌體釋放的裂解酶，裂解酶能降解生物膜胞外多糖等主要成分，破壞細菌細胞壁結構，使宿主菌破裂而被殺滅。利用噬菌體分泌裂解酶降解生物膜的這種特性，可以通過噬菌體與抗生素的聯(lián)合使用進行生物膜防控。例如，噬菌體PaP3裂解酶在體外可以特異性地降解銅綠假單胞菌生物膜的胞外多糖，有利于乳酸環(huán)丙沙星、加替沙星、頭孢他啶、硫酸慶大霉素等抗生素穿透生物膜并作用于生物膜內部細菌[25]。噬菌體裂解酶通過水解細胞壁肽聚糖發(fā)揮裂解作用，消除生物膜的保護屏障，進而有利于抗生素殺滅生物膜內細菌；同時通過結合結構域與細菌表面受體結合，侵染生物膜內部細菌[26]。金黃色葡萄球菌噬菌體SAP-26聯(lián)合利福平能夠破壞生物膜基質，殺滅生物膜內細菌，從而有效促進金黃色葡萄球菌生物膜的降解[27]。Yilmaz等[28]用大鼠建立了由置入物引起的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的感染模型，分別運用特異性噬菌體Sb-1、替考拉寧、噬菌體Sb-1和替考拉寧聯(lián)合治療，結果只有噬菌體Sb-1聯(lián)合替考拉寧的實驗組沒有生物膜形成，說明噬菌體Sb-Z與替考拉寧有很強的協(xié)同作用。

然而，噬菌體對其靶細菌的特異性限制了噬菌體的應用，大量研究開始通過基因工程等方法獲得具有特定功能的噬菌體。經過基因改造的噬菌體與抗生素協(xié)同作用不僅能高效降解生物膜，還能有效降低生物膜對抗生素的耐藥性，是防控生物膜的重要方法。Lu等[29]對M13mp18噬菌體進行改造，讓其大量表達SOS修復系統(tǒng)抑制物lexA3，并將改造的噬菌體與氧氟沙星聯(lián)合作用于大腸埃希菌，顯著降低了大腸埃希菌的生物膜形成能力和耐藥性。Pastagia等[30]通過基因工程等方法，將來源于噬菌體的溶菌素與抗生素組裝，從而特定地作用于耐甲氧西林和萬古霉素的金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和耐青霉素的肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumonia)，組裝后的噬菌體可有效殺滅生物膜內部的細菌。通過基因工程改造的噬菌體與抗生素的協(xié)同作用在處理生物膜方面應用前景廣闊。

4 抗生素與酶的協(xié)同作用

酶是一種具有生物催化功能和降解作用的蛋白質，具有毒性低、高效等特點。通過酶與抗生素聯(lián)合使用可高效地清除生物膜。例如，Benzonase是一種非特異性高效核酸內切酶，能將生物膜基質中的胞外DNA降解，破壞生物膜的穩(wěn)定性結構，分別與慶大霉素、利福平、萬古霉素聯(lián)合作用于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)生物膜，可有效殺滅生物膜內的細菌，其生物膜內的活菌數(shù)下降程度顯著高于抗生素單獨處理組[31]。N-乙酰氨基葡萄糖苷酶Nag1可特異性降解金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的胞外多糖，與氨芐西林聯(lián)合使用能恢復生物膜對抗生素的敏感性，提高氨芐西林對生物膜內部細菌的殺滅能力[32]。藻酸鹽裂解酶可通過減少煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)菌絲的厚度、干擾菌絲嵌入胞外多糖，從而促進兩性霉素B進入煙曲霉菌生物膜內部，以此提高抗菌和抗生物膜活性[33]。藻酸鹽裂解酶通過分解生物膜藻酸鹽，并降低細菌黏附性，使生物膜的性下降,致密的胞外多糖變疏松或被清除，從而抑制細菌生物膜分化成熟，使抗生素等藥物更容易滲透進入生物膜內部并殺滅細菌[34]。上述研究充分體現(xiàn)了抗生素與酶的協(xié)同作用在生物膜防控中高效、低毒、有效降低抗菌藥物劑量的特點，因此抗生素與酶的協(xié)同作用是一種環(huán)境友好、經濟節(jié)約的生物膜防控方法。

5 其他協(xié)同作用

5.1 超聲波與抗菌藥物的協(xié)同作用

超聲波是一種機械壓力波，作為傳統(tǒng)的無創(chuàng)性設備，在很多領域都已得到運用。在防控生物膜過程中，超聲波可以使不同接觸表面的微生物脫落甚至失活，而且低頻超聲能顯著增強抗生素活性[35-36]。例如，低頻超聲可增強慶大霉素對銅綠假單胞菌和大腸埃希菌生物膜的活性[37]，有利于骨水泥中釋放的慶大霉素殺滅金黃色葡萄球菌與凝固酶陰性葡萄球菌(Coagulase-negativestaphylococci)生物膜內部細菌[38]。超聲波與10%的磷酸三鈉聯(lián)合使用能增強超聲波對雞肉表面假單胞菌(Pseudomonadaceae)生物膜的清除能力，超聲波處理破壞了生物膜結構，磷酸三鈉可抑制細菌活性，使生物膜內部的細菌離散出來[39]。超聲波可產生高壓及高剪切力，增強細胞間的微對流，增高輻照區(qū)域局部溫度，這些作用均可增強生物膜對藥物的通透性，有利于藥物作用于生物膜內細菌[40-41]。

5.2 EDTA與抗菌藥物的協(xié)同作用

二乙胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)是臨床上治療重金屬中毒的常用藥物，EDTA與鈣、鐵等金屬離子的結合可抑制細菌生長和生物膜的形成，同時也可減少細菌產生的毒素因子。EDTA主要是通過破壞生物膜胞外多糖和細菌的細胞壁，利于抗生素等藥物的滲入發(fā)揮殺菌作用[42]。例如，EDTA與慶大霉素聯(lián)合使用可有效抑制多重耐藥性的銅綠假單胞菌生物膜的形成[43]。 EDTA與環(huán)丙沙星和氨芐西林聯(lián)合作用于黏液型銅綠假單胞菌生物膜，可使環(huán)丙沙星和氨芐西林的最低抑菌濃度降低30倍，EDTA通過和細菌細胞壁脂多糖上的鎂離子結合，促進脂多糖釋放，從而增加細胞的通透性，加快藥物的滲透[44]。EDTA與美婷或亞甲基藍聯(lián)合使用能有效破壞水霉菌(Saprolegnia)生物膜結構、促進藥物的滲透，作用效果明顯優(yōu)于美婷及亞甲基藍單獨使用[45]?？梢奅DTA與其他藥物的協(xié)同作用對生物膜的防治具有重要意義。

5.3 酶與酶的協(xié)同作用

不同的酶清除生物膜的機理不同，它們的協(xié)同作用可破壞生物膜基質的不同成分，或者同一成分的不同化學鍵，使生物膜的結構從多方向受到攻擊，從而最大限度地清除生物膜。例如，由糜蛋白酶和鏈道酶組成的復合生物酶，能水解生物膜基質，有效降解清除銅綠假單胞菌生物膜[46]。鏈球菌激酶和鏈球菌脫氧核糖核酸酶聯(lián)合應用對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜具有顯著的抑制作用[47-48]。蛋白酶與多糖降解酶聯(lián)合使用能夠有效去除黏附在不銹鋼材質上的大腸埃希菌生物膜[49]。酶與酶的協(xié)同作用是生物膜防治的重要研究方向，但由于酶的價格相對較高,產量較低，同時酶的生產沒有達到專門化、集約化，使其未能廣泛應用。

本課題組在遲緩愛德華氏菌生物膜相關研究中發(fā)現(xiàn)，EseB(Ⅲ型分泌系統(tǒng)輸送器蛋白)在遲緩愛德華氏菌表面形成一種胞外纖絲結構，這一結構介導了生物膜的形成。與此同時，驗證了抗EseB抗體對生物膜的防控作用，結果發(fā)現(xiàn)抗EseB抗體能夠抑制生物膜的形成，隨抗體濃度增加，生物膜形成能力逐漸降低[50]。這表明抗體是一種潛在的生物膜防控藥物，接下來將研究抗體與抗生素、中藥等藥物的協(xié)同使用在生物膜防控中的作用，以期為生物膜的防控提供更多有效的措施。

6 展 望

抗生素與抗生素的協(xié)同作用：目前抗生素依然是防控生物膜的主要藥物，但細菌耐藥性的產生是限制其發(fā)展的重要因素，因此探索合理的協(xié)同作用藥物種類和使用劑量，尋找特異性藥物靶點和新型抗生素，將是今后使用抗生素防控生物膜的研究重點。

抗生素與中藥的協(xié)同作用：國內外防控生物膜研究多側重于抗菌西藥的研發(fā)，而對中藥的開發(fā)還很有限。相對于其他協(xié)同作用，中藥及其有效成分聯(lián)合抗生素在生物膜防控中已顯示良好效果，同時細菌不易對中藥產生耐藥性，這些都證明了中藥具有良好的應用前景。今后應加強防控生物膜中藥及其有效成分的篩選，探討其破壞或抑制生物膜的靶點和作用機理研究。

抗生素與噬菌體協(xié)同作用：雖然我國噬菌體裂解酶資源豐富，且裂解酶易于批量生產、提純，但是仍然存在許多因素制約著噬菌體防控方法研究的發(fā)展。國內外相關研究較少且不夠深入，缺乏明確的作用機理。噬菌體還存在宿主譜窄、研發(fā)成本高等問題。通過基因工程構建能表達高效、環(huán)保、無毒的噬菌體裂解酶的工程菌將是今后研究的重點。

抗生素與酶協(xié)同作用：抗生素與酶協(xié)同作用研究還處在初級階段，酶具有的特異性、生物膜復雜的成分和結構為研究提供了重要的突破點。因為生物膜基質同一成分可以被多種不同的酶分解，同時一種酶又可以分解不同的成分，這就提供了多方面的研究方向。隨著研究的深入會發(fā)掘出更多用于生物膜防治的高效、廣譜的酶。

目前，雖然在抗生素與抗菌藥物協(xié)同作用防控生物膜領域已經進行了許多研究，但還有很多工作需要繼續(xù)開展。一是對生物膜性質及對生物膜內細菌的生理和分子特征進行深入研究，為協(xié)同藥物的篩選、協(xié)同作用機理等研究奠定理論基礎。二是對協(xié)同作用機理的研究還很匱乏，協(xié)同作用對生物膜信號傳遞系統(tǒng)、發(fā)揮作用的具體靶點、群體感應系統(tǒng)、耐藥基因、蛋白表達譜的改變等方面都缺乏細致研究，今后需要開展更多的研究以闡明不同藥物協(xié)同作用的詳細機理。三是目前對于協(xié)同作用防控生物膜的研究多局限于體外實驗，而體外實驗與體內實驗依然存在一定的差異，因此對于體外實驗效果良好的協(xié)同藥物，需要通過體內實驗做進一步驗證。四是需要進一步拓展協(xié)同藥物種類，積極尋找特異的藥物作用靶點，并通過化學合成或基因工程的方法研制多靶點藥物，這將是未來防控生物膜的重要方向。

Advances in Synergy of Antibiotics and Antibiotic Medicine to Prevent and Control Biofilm

GAO Zhi-peng1, 2, CHEN Kang-yong1, GUO Jia-jing3

(1.Coll.ofAnim.Sci. &Technol.,HunanAgric.Uni.,Changsha410128; 2.Collabor.Innovat′nCtr.forEffic. &HealthProduct′nofFish.inHunanProv.,Changde415000; 3.Inst.ofHunanAgric.Prod.Process.,HunanAcad.ofAgric.Sci.,Changsha410125)

Biofilm is a complex, highly heterogeneous, polymeric structure, in which microbial cells adhere to media surfaces and embedded in extracellular matrix secreted by their own to adapt surrounding environments. Biofilm is highly resistant to host defense and medicaments, and in most cases the effect of single drug is usually not significant, yet there are obvious advantages to use synergistic effect of different antibiotic medicine for biofilm prevention and control. The studies on synergy effects of antibiotics with antibiotics, antibiotics with traditional Chinese medicine, antibiotics with phages, antibiotics with enzymes were summarized in this article, so as to provide some new line of thinking for biofilm prevention and control.

synergy; biofilm prevention and control; antibiotics; antibiotic medicine

湖南省教育廳科學研究項目(16B125)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目((G)SCX1510)；湖南農業(yè)大學青年科學

基金項目(15QN01)

高志鵬 男，講師，博士。主要從事水產動物病原微生物學研究。Tel: 0731-84618176，E-mail：gaozhipeng627@163.com

* 通訊作者。女，助理研究員，碩士。主要從事食品微生物學研究。Tel: 0731-84698915，E-mail：guojiajing1986@163.com

2016-11-07；

2017-01-17

Q939.93

A

1005-7021(2017)03-0116-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.019