施 楊，居 慧，喻 杰，付元帥

牙鲆NR4A1基因在甲狀腺素誘導仔魚變態(tài)中的表達調(diào)控分析

施 楊1，居 慧2，喻 杰2，付元帥2

（1.上海市食品研究所，上海 200235；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

NR4A1基因是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，在信號轉(zhuǎn)導早期通過對靶基因的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。從牙鲆（Paralichthys olivaceus）中克隆了NR4A1基因cDNA序列，檢測了其在牙鲆變態(tài)中和成魚各組織中的表達模式，分析了其在外源甲狀腺素（TH）以及硫脲（TU）處理仔魚中的表達變化。結(jié)果表明，牙鲆NR4A1 cDNA全長3264 bp，編碼568個氨基酸；牙鲆NR4A1基因與其它物種具有很高的同源性，在系統(tǒng)進化樹中與魚類聚為一支；牙鲆NR4A1基因在成魚心、肌肉和鰓中高表達；在變態(tài)過程中，NR4A1水平逐漸升高，且在25 dph達到最高，之后逐漸降低；TH組中的NR4A1基因水平在變態(tài)早期和高峰期顯著低于正常組，TU組的水平在變態(tài)中后期和結(jié)束期顯著高于正常組；TU組中變態(tài)被抑制的仔魚在正常海水和0.1 mg·L－1TH海水中飼養(yǎng)6 d后，能夠順利變態(tài)，且NR4A1基因在拯救組（TU抑制變態(tài)仔魚在正常海水和0.1 mg·L－1TH海水中飼養(yǎng)）中的表達水平與TU對照組相比顯著降低，與正常組中同時期的水平一致。結(jié)果表明，牙鲆NR4A1基因可能在仔魚變態(tài)調(diào)控中扮演著非常重要的角色。

牙鲆；變態(tài)發(fā)育；NR4A1；基因表達

NR4A家族屬于及早反應(yīng)基因家族，一些化學刺激（如生長因子、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等）和物理刺激（膜去極化、機械攪拌和磁場等）能夠在短時間內(nèi)誘導該家族基因快速表達［1］。NR4A1是NR4A家族中的一員，也是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子和一種響應(yīng)蛋白，通過對靶基因的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在信號傳導的早期發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［1］。NR4A1作為一種核受體，在接受刺激信號后，其分子構(gòu)象迅速發(fā)生改變，與靶基因的調(diào)控區(qū)發(fā)生特異性的識別和結(jié)合，發(fā)揮其對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，參與細胞周期、細胞凋亡、組織器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生、機體免疫應(yīng)答以及內(nèi)分泌調(diào)控等各種生命活動［2］。NR4A1蛋白主要由6個保守的功能結(jié)構(gòu)域組成：AF-1結(jié)構(gòu)域（氨基端長度可改變的轉(zhuǎn)錄激活域，負責與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用）、DBD結(jié)構(gòu)域（包含兩個鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合域，與DNA識別元件結(jié)合，調(diào)控基因表達）、構(gòu)象可變的鉸鏈區(qū)、LBD結(jié)構(gòu)域（包含二聚化位點的配體結(jié)合域，是一分子開關(guān)，與特異性配體結(jié)合改變核受體的分子構(gòu)象，激活轉(zhuǎn)錄）、AF-2結(jié)構(gòu)域（配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活域）、未知功能的可變羧基端［2］。NR4A1廣泛存在于多種生物體中，如：人類（Homo sapiens）、家鼠（Musmusculus）、半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）、斑馬魚（Danio rerio）［3］、非洲爪蟾（Xenopus laevis）［4］等。目前為止，NR4A1基因在牙鲆（Paralichthys olivaceus）中未見報道。

牙鲆屬鰈形目（Pleuronectiforms），牙鲆科（Paralichthyidae），牙鲆屬，是我國一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類。在牙鲆胚后從仔魚向稚魚的發(fā)育過程中有一劇烈的變態(tài)過程，稱為牙鲆的變態(tài)發(fā)育。在仔魚變態(tài)過程中，其右眼移向身體左側(cè)，冠狀幼鰭消長，體位從側(cè)臥變?yōu)槠脚P，浮游生活變?yōu)榈讞?，同時這些過程也伴隨一系列生理學變化［5］。1985年日本學者INUI等［8］研究發(fā)現(xiàn)外源性甲狀腺激素（TH）能顯著加速牙鲆仔魚的變態(tài)，而硫脲（TU）則造成牙鲆仔魚的變態(tài)抑制［6－9］。本研究采用同源克隆和RACE法得到牙鲆NR4A1基因cDNA全長，觀察了NR4A1在牙鲆變態(tài)發(fā)育各時期以及成魚的表達水平，檢測了外源TH和TU對NR4A1表達的影響及其在拯救實驗中的變化，初步闡釋了NR4A1基因在牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中的表達調(diào)控以及可能扮演的重要角色，以期為進一步揭示牙鲆變態(tài)的分子機制提供重要的研究積累。

1 材料與方法

1.1 實驗魚和樣品采集

牙鲆仔魚實驗主要在中國水產(chǎn)科學研究院北戴河中心實驗站于2015年5月29日完成。將孵化后14 d（14 dph，days post hatching）的3 000 ind仔魚平均分為3個組：正常發(fā)育對照組（control），甲狀腺激素（TH，Sigma公司）處理組和硫脲（TU，Sigma公司）處理組，3組仔魚分別養(yǎng)在正常海水、TH處理的海水（0.1 mg·L－1）和TU處理的海水（30 mg·L－1）中，其它飼養(yǎng)條件相同，至正常仔魚變態(tài)結(jié)束。在變態(tài)抑制仔魚拯救實驗中，將35 dph TU組仔魚分成3組：TU組繼續(xù)用含30 mg·L－1TU的海水養(yǎng)殖；TU-NC組改用自然海水養(yǎng)殖；TU-TH組改用含0.1 mg· L－1的海水養(yǎng)殖，6 d后觀察各組仔魚變態(tài)情況。

樣品采集根據(jù)MINAMI［10］的劃分方法結(jié)合實際養(yǎng)殖情況確定取樣時間點，即：16 dph（變態(tài)前，眼睛左右對稱）、21 dph（變態(tài)早期，右眼開始移位）、25 dph（變態(tài)中前期，右眼移至背側(cè)附近，從左眼側(cè)還無法看到右眼）、28 dph（變態(tài)高峰期，右眼到達背中線附近，可在左眼側(cè)看到右眼）、31 dph（變態(tài)后期，右眼到達背中線并開始向左側(cè)移動）、35 dph（變態(tài)結(jié)束期，右眼位于背中線左側(cè)）和41 dph（變態(tài)完成，兩只眼睛均位于頭部左側(cè)）。每個時間點均分別取正常對照組、TH組和TU組的3個生物學重復樣品，即n＝3，DEPC水沖洗，放入RNAstore保存液（天根公司），置于－80℃保存?zhèn)溆茫?1］。

牙鲆成魚購自上海市蘆潮港水產(chǎn)品市場，活體解剖后取其肌肉、腦、心臟、鰓、腎、胃、肝臟、腸、性腺組織等各3份（n＝3），經(jīng)DEPC水清洗，置于液氮，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

利用Trizol?Reaget（Invitrogen），根據(jù)該試劑的操作說明將上述采集樣品進行RNA提取。利用NANODROP 2000C測定總RNA OD260／OD280值及濃度（1.8～2.0范圍的RNA純度較好），再根據(jù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量（28SrRNA和18SrRNA條帶清晰可見，RNA質(zhì)量較好），所有RNA樣品均符合實驗要求后，置－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將上述RNA樣品用DNase I（Promega）處理后，在無RNase的離心管中加入2μg總RNA，1 μL Oligo dT Primer（50μmol·L－1），1μL dNTP Mixture（10 mmol·L－1each），補充RNase free ddH2O至10μL；然后65℃5min，冰上2min；再加入5×PrimeScript Buffer4μL，RNase Inhibitor（40 U·μL－1）0.5μL，PrimeScript RTase（200 U ·μL－1）1μL，補充RNase free ddH2O至20μL；然后進行反轉(zhuǎn)錄，25℃，10 min；37℃，60 min；95℃，5 min，最后冰上放置2 min，cDNA產(chǎn)物－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 牙鲆NR4A1基因的克隆

根據(jù)NR4A1基因在物種中的序列比對結(jié)果，在保守區(qū)設(shè)計3對PCR引物（表1），用牙鲆的混合cDNA（不同時期和不同組織的cDNA）為模板，運用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃預變性3 min；94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離純化后連接到pMDTM19－T Vector（Takara，日本），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)過夜，藍白斑篩選陽性克隆擴大培養(yǎng)后送上海生工生物工程有限公司測序。所得測序結(jié)果采用DNAman中的序列拼接程序進行拼接。

在牙鲆NR4A1拼接序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計RACE的特異性引物（表1），通過Full RACE Kit（Takara）試劑盒進行RACE PCR擴增，將產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，再回收目的片段進行連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序。

表1 實驗中用到的引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.4 基因序列結(jié)構(gòu)和進化分析

運用DNAMAN軟件將所得的牙鲆NR4A1片段序列進行重新拼接間，獲得基因全長。用ORF Finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf）程序獲得NR4A1基因的開放閱讀框和氨基酸序列。運用BLAST program（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）對牙鲆和其它物種的NR4A1基因進行氨基酸序列比對分析，分析該基因的保守型。運用MEGA 5.0［12］軟件，采用NJ（Neighbor－Joining）法構(gòu)建進化樹。從GenBank數(shù)據(jù)庫提取的NR4A1氨基酸序列的代碼如下：［Homo sapiens］（GI｜48145525｜）；［Mus musculus］（GI｜71059903｜）；［Danio rerio］（GI｜182889142｜）；［Xenopus laevis］（GI｜33416666｜）；［Cynoglossus semilaevis］（GI｜657779658｜）；［Stegastes partitus］（GI｜657528683｜）；［Poecilia reticulata］（GI｜658859882｜）。

1.5 熒光定量PCR

NR4A1基因的定量分析在CFX96 TouchTMReal－Time PCR Detection System（Bio-Rad，美國）上進行。首先制備目的基因和內(nèi)參基因（β－actin）的標準曲線。然后對不同組織、不同變態(tài)階段、TH和TU處理以及拯救實驗中的仔魚，按照以下條件進行相對定量分析。反應(yīng)體系（20 μL）：1.0μL cDNA，0.5μL NR4A1 qPCR-F（10 μM）和0.5μL NR4A1 qPCR-R（10μM），10.0μL 2×iQTM SYBR Green Supermix（Bio-Rad，USA）和8.0μL ddH2O；反應(yīng)條件：95℃1 min；95℃10 s，60℃20 s，40個循環(huán)。該實驗中，生物學重復n＝3，技術(shù)重復2次，β-actin為參考基因；NR4A1基因和內(nèi)參基因的擴增效率（E）均介于95%～100%之間，R值均大于0.98，并且二者之間的E值相差小于0.1。

上述NR4A1 mRNA結(jié)果，運用2－ΔΔCT方法［13］進行數(shù)據(jù)處理。運用Sigmaplot 12.0軟件進行作圖分析，數(shù)值采用平均值±標準誤差（mean± SE）表示，n＝3。不同樣品間的相對表達差異分析利用該軟件中的One-Way和Two-Way方差分析法（ANOVA）進行統(tǒng)計分析，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NR4A1的克隆及結(jié)構(gòu)分析

利用分子克隆方法，獲得了牙鲆NR4A1基因全長3264 bp，包括43 bp的5′-UTR、1517 bp的3′-UTR和1704 bp的CDS，預測其編碼568個氨基酸（圖1）。在NCBI中，NR4A1基因的氨基酸序列結(jié)構(gòu)比對分析結(jié)果顯示，其有6個高度保守的結(jié)構(gòu)域，分別為NR＿DBD＿NGFI-B、NR＿LBD＿NGFI-B、zf-C4、ZnF＿C4、HOLI和Hormone＿recep，這與其它已知物種中的NR4A1結(jié)構(gòu)相似（圖2）。

2.2 NR4A1序列比對及進化樹構(gòu)建

NR4A1基因系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示（圖3），牙鲆與其它魚類聚在一支，與深裂眶鋸雀鯛（Stegastes partitus）和半滑舌鰨的系統(tǒng)進化距離相對較近。多物種間NR4A1基因氨基酸序列同源性比對結(jié)果顯示，牙鲆與半滑舌鰨為78.13%，與斑馬魚為68.34%，與網(wǎng)紋鳉（Poecilia reticulate）為68.19%，與深裂眶鋸雀鯛為84.59%（圖4）。

圖1 牙鲆NR4A1基因的cDNA和推導的氨基酸序列Fig.1 cDNA and deduced am ino acid sequences of Paralichthys olivaceus NR4A1 gene

圖2 牙鲆NR4A1基因的6個保守性結(jié)構(gòu)域預測分析Fig.2 Six conservative domains proghosis of Paralichthys olivaceus NR4A1 gene

圖3 NR4A1基因在脊椎動物中的系統(tǒng)進化樹分析（Neighbor－joining，1 000 bootstrap）Fig.3 Phylogenetic tree analysis of NR4A1 in the vertebrate by the neighbor-joining method（1 000 bootstrap）

2.3 牙鲆NR4A1基因在變態(tài)發(fā)育階段和成魚各組織中的表達

定量PCR結(jié)果顯示（圖5）：牙鲆NR4A1基因在成魚各組織中均有表達到，但肌肉、心臟和鰓中表達量較高，在心臟中最高；牙鲆NR4A1基因在仔魚變態(tài)發(fā)育的各個階段均有表達，并且表達變化趨勢與變態(tài)發(fā)育進展相符，即出膜后第16天（16 dph）時，牙鲆NR4A1基因的表達較低，到21 dph時有增長，但與16 dph無顯著差異，在25 dph時其表達水平達到頂峰（約為16 dph的8倍，差異顯著），之后逐漸降低，到35 dph和41 dph時降至最低。

2.4 甲狀腺激素（TH）及硫脲（TU）處理后NR4A1的表達

通過定量PCR方法分析NR4A1基因在TH和TU處理仔魚中的表達變化，結(jié)果顯示：在變態(tài)早期和變態(tài)高峰期的TH組仔魚中，其NR4A1水平顯著低于正常發(fā)育組（control），而在變態(tài)中后期至變態(tài)結(jié)束的TU組仔魚中，NR4A1水平顯著高于正常發(fā)育組，這些結(jié)果表明NR4A1基因的表達直接或間接的受到TH的調(diào)控（圖6）。外源甲狀腺激素（TH）加速牙鲆仔魚變態(tài)，而硫脲（TU）則抑制其變態(tài)。

2.5 硫脲處理組牙鲆的變態(tài)拯救實驗

為了探討硫脲（TU）抑制變態(tài)的仔魚能否被拯救（TU抑制變態(tài)的仔魚完成變態(tài)過程），我們將35 dph TU組仔魚分別放入自然海水中（TUNC組）和含0.1 mg·L－1TH的海水中（TU-TH組）飼養(yǎng)。經(jīng)過6 d的拯救實驗后，從外型判斷TU-TH組和TU-NC組仔魚均完成變態(tài)（圖7），而TU對照組仔魚變態(tài)依然被抑制。同時分析了NR4A1基因在仔魚變態(tài)拯救前后的表達變化，結(jié)果顯示：NR4A1在TU-NC組和TU-TH組中的表達水平相對TU對照組顯著降低，與正常發(fā)育組以及TH處理組41 dph時的表達水平相近（圖9），這些結(jié)果表明NR4A1基因可能在牙鲆仔魚變態(tài)中發(fā)揮重要的作用。

圖4 NR4A1基因在牙鲆和其它物種間的氨基酸序列對比Fig.4 Am ino acid sequences for NAR4AI alignment of Paralichthys olivaceus and other species

圖5 牙鲆NR4A1在成魚組織和變態(tài)階段的表達模式（A：成魚組織；B：變態(tài)發(fā)育）Fig.5 Relative expression of NR4A1 m RNA in adult fish tissues and metamorphic stages of Paralichthys olivaceus（A：adult tissues，B：metamorphosis）

圖6 NR4A1 m RNA在正常、TH和TU組仔魚變態(tài)過程中的相對表達Fig.6 Relative expression of NR4A1 mRNA in the control，TH-treated and TU-treated larvae duringmetamorphosis

3 討論

已有研究表明，NR4A1基因在細胞信號傳導中發(fā)揮著重要作用，參與了一系列發(fā)育和代謝相關(guān)的生命活動［1，14］。本研究中，我們克隆了牙鲆NR4A1基因序列，并分析了該基因在物種間的系統(tǒng)進化、同源性以及保守性，NR4A1基因在牙鲆與其它物種間具有很高的同源性和保守性，這為進一步分析其在牙鲆發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。同時，NR4A1基因在牙鲆變態(tài)過程中的表達分析表明，它的表達水平隨著變態(tài)發(fā)育逐漸增長，在變態(tài)高峰期達到峰值，隨后逐漸降低至變態(tài)結(jié)束。這些結(jié)果顯示，NR4A1的表達變化與牙鲆的變態(tài)發(fā)育進程是呈正相關(guān)的，可能在牙鲆變態(tài)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在成魚中的組織分布表明，NR4A1基因可能在肌肉、心臟和鰓的發(fā)育以及生理代謝中發(fā)揮著重要作用。

牙鲆的變態(tài)發(fā)育受到許多激素的調(diào)控，而甲狀腺激素和其受體在其變態(tài)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，控制著仔魚變態(tài)的進程以及成?。?5－17］，JANSEN等［18］以及BISBAL等［19］對牙鲆眼睛移位的研究結(jié)果揭示，牙鲆眼睛的移位是受TH控制的，且在此過程中，甲狀腺激素的水平有大幅度的增加，它的濃度分布有著組織性和時間上的特異性［20］。研究表明，外源性的TH能夠加速牙鲆仔魚的變態(tài)過程［8］，而與之相反的是，用甲狀腺素抑制劑硫脲（TU）處理后會導致牙鲆仔魚的變態(tài)停滯［7－8，21－22］。本次實驗使用外源性的TH和TU處理牙鲆尚未開始變態(tài)的仔魚，以研究TH和TU對NR4A1基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在牙鲆變態(tài)過程中，NR4A1基因的mRNA水平明顯受TH和TU的影響，并且二者對NR4A1的表達幾乎具有相反的調(diào)節(jié)作用。在變態(tài)前期和高峰期，外源性TH顯著抑制了NR4A1基因的表達水平；在變態(tài)高峰期和后期，TU組仔魚體內(nèi)的TH水平被抑制，導致NR4A1基因一直處于高水平，這些結(jié)果顯示NR4A1基因表達受到TH直接或間接的調(diào)控，并且在仔魚變態(tài)調(diào)控中可能起著負調(diào)控的作用。因此我們推測TH通過抑制NR4A1基因的表達水平，從而間接地減少仔魚變態(tài)負調(diào)控基因的表達，控制仔魚正常變態(tài)的進程；外源TH的加入，提升了體內(nèi)TH的水平，更快更早的抑制了NR4A1基因的表達，造成變態(tài)抑制基因更早的被抑制，促使仔魚變態(tài)的加速。

圖7 NR4A1基因在TU抑制變態(tài)仔魚拯救中的表達變化（A：變態(tài)抑制拯救前后的形態(tài)變化；B：NR4A1在變態(tài)抑制仔魚拯救前后的表達變化）Fig.7 Relative expression levels of NR4A1 mRNA in the rescued larvae inhibited by TU（A：morphologic changes before and after rescue；B：relative levels of NR4A1 m RNA before and after rescue）

為了進一步探究NR4A1基因在牙鲆變態(tài)中的作用，筆者設(shè)計了TU抑制組仔魚的拯救實驗。實驗結(jié)果證明，TU組變態(tài)抑制的仔魚在去除TU抑制即放入正常海水和TH處理的海水，仍能快速地完成仔魚的變態(tài)；同時我們檢測了NR4A1基因的表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與TU對照組相比，拯救組中的NR4A1基因水平顯著降低，這可能是因為被TU抑制變態(tài)仔魚體內(nèi)TH去抑制的結(jié)果，這進一步表明NR4A1基因的表達直接或間接地受TH調(diào)節(jié)，并可能在仔魚的變態(tài)中通過負調(diào)控的方式發(fā)揮著重要的作用。

［1］ MARUYAMA K，TSUKADA T，OHKURA N，etal.The NGFI-B subfamily of the nuclear receptor superfamily［J］.International Journal of Oncology，1998，12（6）：1237－1280.

［2］ 谷亞龍，張新東，金保方.核受體NR4A1功能及調(diào)控的研究進展［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2014，8（8）：1507－1511.

［3］ CHENG Y Y，TAOW J，CHEN JL，etal.Genomewide identification，evolution and expression analysis of nuclear receptor superfamily in Nile tilapia，Oreochromis niloticus［J］.Gene，2015，569（1）：141－152.

［4］ KLEIN S L，STRAUSBERG R L，WAGNER L，et al.Genetic and genomic tools for Xenopus research：The NIH Xenopus initiative［J］.Developmental Dynamics，2002，225（4）：384－391.

［5］ FUKUHARA O.Morphological and functional development of Japanese flounder in early life stage［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1986，52（1）：81－91.

［6］ TANANGONAN JB，TAGAWA M，TANAKA M，et al.Changes in tissue thyroxine level of metamorphosing Japanese flounder Paralichthys olivaceus reared at different temperatures［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1989，55（3）：485－490.

［7］ MIWA S，TAGAWA M，INUIY，et al.Thyroxine surge in metamorphosing flounder larvae［J］.General and Comparative Endocrinology，1988，70（1）：158－163.

［8］ INUI Y，MIWA S.Thyroid hormone induces metamorphosis of flounder larvae［J］.General and Comparative Endocrinology，1985，60（3）：450－454.

［9］ DE JESUS EG，HIRANO T，INUIY.Changes in cortisol and thyroid hormone concentrations during early development and metamorphosis in theJapanese flounder，Paralichthys olivaceus［J］.General and Comparative Endocrinology，1991，82（3）：369－376.

［10］ MINAMI T.The early life history of a flounder Paralichthys olivaceus［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1982（48）：1581－1588.

［11］ ZHAIW，ZHANG J，SHI Z，et al.Identification and expression analysis of IGFBP-1 gene from Japanese flounder（Paralichthys olivaceus）［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，2012，161（4）：413－420.

［12］ TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al.MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731－2739.

［13］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2－ΔΔCTmethod［J］.Methods，2001，25（4）：402－408.

［14］ KIM BY，KIM H，CHO E J，etal.Nur77 upregulates HIF-αby inhibiting pVHL-mediated degradation［J］.Experimental and Molecular Medicine，2008，40（1）：71－83.

［15］ Schreiber A M，Specker J L.Metamorphosis in the summer flounder（Paralichthys dentatus）：stagespecific developmental response to altered thyroid status［J］.General and Comparative Endocrinology，1998，111（2）：156－166.

［16］ GALAY BURGOSM，POWER D M，LLEWELLYN L，et al.Thyroid hormone receptor expression during metamorphosis of Atlantic halibut（Hippoglossus hippoglossus）［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2008，281（1）：56－63.

［17］ LAUDET V.The origins and evolution of vertebrate metamorphosis［J］.Current Biology，2011，21（18）：R726－R737.

［18］ JANSEN J，ENGER P.NADPH diaphorase activity is asymmetrically distributed in the optic tectum during the period of eye migration in turbots［J］.Acta physiologica scandinavica，1996，157（4）：515－517.

［19］ BISBALG A，BENGTSON D A.Reversed asymmetry in laboratory-reared summer flounder［J］.The Progressive Fish-culturist，1993，55（2）：106－108.

［20］ TAGAWA M，MIWA S，INUIY，et al.Changes in thyroid hormone concentrations during early development and metamorphosis of the flounder，Paralichthys olivaceus［J］.Zoological Science，1990，7（1）：93－96.

［21］ INUIY，YAMANO K，MIWA S.The role of thyroid hormone in tissue development in metamorphosing flounder［J］.Aquaculture，1995，135（1）：87－98.

［22］ 蘇艷芳，付元帥，施志儀，等.牙鲆SRF基因的克隆及真核表達載體的構(gòu)建［J］.海洋漁業(yè)，2015，37（4）：331－340.

SU Y F，F(xiàn)U Y S，SHI Z Y，et al.Cloning of SRF from Paralichthys olivaceus and eukargotic expression veetor construction［J］.Marine Fisheries，2015，37（4）：331－340.

Expression regulation of Paralichthys olivaceus NR4A1 gene in themetamorphic larvae induced by thyroid hormone

SHIYang1，JU Hui2，YU Jie2，F(xiàn)U Yuan-shuai2
（1.Shanghai Food Research Institute，Shanghai 200235，China；2.ShanghaiOcean University，Shanghai 201306，China）

NR4A1 gene，an important transcription factor，regulates the specific expression of targetgenes and plays a key role in the early signal transduction.In this study，the full-length cDNA of Paralichthys olivaceus NR4A1 gene was cloned，and its structure was analyzed by the bioinformaticsmethod，while its expression patterns during the metamorphosis and in different tissues of adult fish were detected using the real-time quantitative PCR technology.The expression responses of NR4A1 to exogenous thyroid hormone（TH）and thiourea（TU）during themetamorphosiswere also detected.Finally，a rescue assay was performed and the changes of NR4A1 during the rescuewere detected.The results showed that NR4A1 contained 3 264 bp cDNA sequence and encoded 568 amino acids.NR4A1 of Japanese flounder showed high homology compared to the other reported species.NR4A1 of Japanese flounder wasmainly expressed in heart，muscle and gill.During themetamorphosis，the expression level of NR4A1 increased gradually，and reached the peak at 25 dph，subsequently declined gradually.In the TH group，the expression levels were significantly lower than the control at the pre-metamorphosis and the climaxmetamorphosis period（P＜0.05）.While in the TU group the experssion levelswere higher than the control in the latemetamorphosis period.Themetamorphic inhibition of 35 dph TU larvae can be rescued in the normal seawater and the TH-treated seawater（P＜0.05），and NR4A1 was significantly down-regulated in the rescued larvae compared with the TU-treated larvae（P＜0.05）.These results demonstrate that NR4A1 plays a key role in regulatingmetamorphosis in the Japanese flounder.

Paralichthys olivaceus；metamorphosis；NR4A1；gene expression

Q 959.468

A

1004－2490（2017）04－0433－10

2016－06－15

國家自然科學基金（41506159）；上海市自然科學基金（15ZR1420600）；中科院海洋所海洋生物學重點實驗室開放課題（KF2015No.01）

施 楊（1988－），男，助理工程師，研究方向為食品分子檢測。E-mail：602483415＠qq.com

付元帥（1981－），講師。E-mail：ysfu＠shou.edu.cn