魏艷麗，Maarten RYDER ，李紀(jì)順，李玲，楊玉忠，楊合同,3*

(1. 山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014； 2. 澳大利亞阿德萊德大學(xué)農(nóng)業(yè)食品葡萄酒學(xué)院，阿德萊德 5064；3. 山東省黃河三角洲可持續(xù)發(fā)展研究院，山東 東營(yíng) 257000)

【農(nóng)業(yè)微生物】

土壤桿菌固氮、溶磷活性及對(duì)植物的促生作用

魏艷麗1，Maarten RYDER2，李紀(jì)順1，李玲1，楊玉忠1，楊合同1,3*

(1. 山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014； 2. 澳大利亞阿德萊德大學(xué)農(nóng)業(yè)食品葡萄酒學(xué)院，阿德萊德 5064；3. 山東省黃河三角洲可持續(xù)發(fā)展研究院，山東 東營(yíng) 257000)

通過(guò)選擇性培養(yǎng)基，定性和定量檢測(cè)了26株土壤桿菌的固氮和溶磷活性，通過(guò)盆栽檢測(cè)了澳洲生防菌株K1026對(duì)黃瓜和小麥的促生長(zhǎng)作用。結(jié)果顯示，包括致病性和無(wú)致病性的26株土壤桿菌均可在無(wú)氮培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)；其中19株具有溶磷活性， K1026對(duì)磷酸鈣液體培養(yǎng)基的溶磷量為109.11 μg/mL；對(duì)黃瓜幼苗根系生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用，但對(duì)小麥生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響。

土壤桿菌；AgrobacteriumrhizogenesK1026；固氮；溶磷；促生作用

土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)K1026通過(guò)產(chǎn)生土壤桿菌素A84和A434[1]，對(duì)致病性土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)侵染引起的冠癭病具有較好的防治效果，已廣泛應(yīng)用于核果類果樹(shù)冠癭病的生物防治中[2]。目前對(duì)生防菌株K1026的研究主要集中于對(duì)核果類果樹(shù)冠癭病的防治作用和作用機(jī)理方面[3-4]，而在其固氮、溶磷和促生作用方面鮮有報(bào)道。本文初步檢測(cè)了26株土壤桿菌的固氮和溶磷活性，并研究了生防菌株K1026對(duì)黃瓜和小麥幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為開(kāi)發(fā)高效微生物菌肥提供種質(zhì)資源，也為菌株K1026的田間應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和植物

1.1.1 供試菌株

生防菌株K1026由澳大利亞阿德萊德大學(xué)Maarten Ryder教授提供，屬于非致病性發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)。25株致病性土壤桿菌(A.rhizogenes)如S-30、K108等由本實(shí)驗(yàn)室分離自山東泰安大櫻桃根癌組織和感病土壤中，可侵染櫻桃根部產(chǎn)生根癌組織。參比菌株為越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderiavietnamiensis)B418，保存于本實(shí)驗(yàn)室，已驗(yàn)證具有固氮、溶磷和促生活性[5]。

1.1.2 供試植物

供試黃瓜品種為中農(nóng)16號(hào)；供試小麥品種為濟(jì)麥22號(hào)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 YMA培養(yǎng)基

K2HPO40.5 g/L；CaCl20.2 g/L；NaCl 0.2 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；酵母浸粉 1 g/L；甘露醇 10 g/L；微量元素(1 000×)2 mL，固體培養(yǎng)基加入瓊脂 15 g/L，調(diào)整pH至 7.2～7.4，121 ℃滅菌 20 min。其中微量元素(1 000×)的配方為：FeCl35 g/L；MnCl20.1 g/L；ZnCl20.5 g/L。

1.2.2 無(wú)氮培養(yǎng)基

KH2PO40.2 g/L；CaCO35.0 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；NaCl 0.3 g/L；甘露醇 10 g/L；CaSO4·2H2O 0.1 g，瓊脂 15 g/L，調(diào)整pH=7.0，121 ℃滅菌 20 min。

1.2.3 Pikovskaya 培養(yǎng)基[6]

葡萄糖 10 g，酵母粉 0.5 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，磷酸鈣 5.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH為7.0～7.5，瓊脂 15 g，121 ℃滅菌 20 min。

1.3 方法

1.3.1 土壤桿菌固氮能力定性檢測(cè)

將包括菌株K1026在內(nèi)的26株土壤桿菌經(jīng)YMA培養(yǎng)基活化后，分別用滅菌牙簽點(diǎn)接于無(wú)氮固體培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)3 d后檢測(cè)菌株生長(zhǎng)情況。

1.3.2 土壤桿菌溶磷活性測(cè)定

溶磷能力定性實(shí)驗(yàn)采用點(diǎn)接Pikovskaya培養(yǎng)基的方法，將26株土壤桿菌經(jīng)YMA活化后，分別用滅菌牙簽點(diǎn)接于Pikovskaya 培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)4～7 d后，測(cè)量溶磷圈直徑。

參考Li等[7]方法進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，挑選溶磷能力強(qiáng)的菌株，在YMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，然后用無(wú)菌水洗下培養(yǎng)物制備菌懸液，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于液體Pikovskaya培養(yǎng)基中，26 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)7 d。采用磷鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定并計(jì)算發(fā)酵液中可溶性磷的含量，以滅菌后未接種的空白 Pikovskaya液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.3.3 生防菌株K1026對(duì)黃瓜和小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)在山東省科學(xué)院生態(tài)研究所溫室中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)用土為普通蔬菜地土壤加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的河沙，充分混勻。將K1026和B418菌株分別在YMA和B418培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h ，然后分別用無(wú)菌水洗下菌體，調(diào)整菌懸液濃度為5×108CFU/mL。用以上兩種菌懸液分別浸泡黃瓜和小麥種子2 h，同時(shí)設(shè)清水浸種對(duì)照。每盆播種8粒，待黃瓜和小麥分別長(zhǎng)出4片葉后，每盆定苗4株。分別于播種后6～7 d調(diào)查出苗率，42 d后測(cè)定幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)，包括根長(zhǎng)、株高、根部鮮重(干重)和整株鮮重(干重)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Ducan’s方差分析，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤桿菌在無(wú)氮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)

檢測(cè)了包括K1026在內(nèi)的26株土壤桿菌在無(wú)氮培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是致病性土壤桿菌還是生防菌K1026，所有26株菌在無(wú)氮培養(yǎng)基上均可正常生長(zhǎng)。

2.2 土壤桿菌的溶磷活性

檢測(cè)的26株土壤桿菌在Pikovskaya固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，其中19株可觀察到明顯的溶磷圈(圖1)，溶磷圈直徑1.08～1.22 cm之間。

采用磷鉬藍(lán)分光光度法，定量檢測(cè)了3株土壤桿菌的溶磷活性，發(fā)現(xiàn)26 ℃搖床培養(yǎng)72 h，測(cè)試的3株土壤桿菌均具有較好的溶磷效果。其中生防菌K1026發(fā)酵液中可溶磷含量可達(dá)到109.11 μg/mL，病原菌S-30發(fā)酵液中可溶磷含量達(dá)140.11 μg/mL，土壤桿菌K108發(fā)酵液中可溶磷含量最高，為162.18 μg/mL(圖2)。

圖1 部分土壤桿菌的溶磷活性Fig.1 Phosphate solubilizing activity of Agrobacterium strains.

圖2 部分土壤桿菌的溶磷活性定量檢測(cè)Fig.2 Quantitative determination of phosphate solubilizing activity of 3 strains in liquid medium

2.3 生防菌株 K1026對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可知，與對(duì)照相比添加土壤桿菌K1026的處理黃瓜根的長(zhǎng)度增加25.49%，根部干重增加62.96%，均達(dá)到差異顯著水平；但株高和地上部分干重兩個(gè)指標(biāo)與對(duì)照無(wú)顯著性差異。伯克霍爾德氏菌B418處理的黃瓜種子，除能增加株高外，其他指標(biāo)與對(duì)照均無(wú)顯著性差異。

表1 不同菌劑處理對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)LSD檢驗(yàn)在P<0.05水平上差異顯著。

2.4 生防菌株 K1026對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

生防菌株K1026對(duì)小麥根系生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響，對(duì)整株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用也較小；而B(niǎo)418對(duì)小麥生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，與對(duì)照水處理相比，對(duì)根系干重的增長(zhǎng)率為26.32%，對(duì)植株地上干重增長(zhǎng)率達(dá)到6.12%，見(jiàn)表2。

表2 不同菌劑處理對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)LSD檢驗(yàn)在P<0.05水平上差異顯著。

3 討論

土壤桿菌(Agrobacterium)在分類學(xué)上屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)，一直被認(rèn)為由于不固定氮而區(qū)別于根瘤菌和其他自生固氮菌[8-9]。本文檢測(cè)的26株土壤桿菌均可以在無(wú)氮培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，初步推測(cè)固氮活性是該類菌株的共性。通過(guò)對(duì)土壤桿菌K84菌株(與菌株K1026具有相同遺傳背景)基因組序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了與根瘤菌結(jié)瘤相關(guān)的nod類基因。王麗等[10]研究了土壤桿菌C58/pGV3850菌株的固氮生理特性，結(jié)果表明該菌具有自生固氮活性，這與本文研究結(jié)果一致。

已報(bào)道的溶磷微生物主要有細(xì)菌、真菌和放線菌[11-12]。本文首次定性、定量檢測(cè)了土壤桿菌的溶磷活性，發(fā)現(xiàn)26株待測(cè)菌株中有19株在Pikovskaya固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并可產(chǎn)生明顯的溶磷圈，并且首次驗(yàn)證了生防菌株K1026的溶磷活性。作者通過(guò)檢索發(fā)現(xiàn)菌株K84基因組中含有多個(gè)磷酸酶基因，推測(cè)土壤桿菌可產(chǎn)生胞外酶促進(jìn)磷酸鈣的轉(zhuǎn)化。

在促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)方面，本文研究發(fā)現(xiàn)土壤桿菌K1026浸種處理，對(duì)黃瓜根長(zhǎng)和根部干重都有顯著增加； Hao等[13]檢測(cè)了一株土壤桿菌D3對(duì)油菜種子根系生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明土壤桿菌D3可顯著增強(qiáng)油菜種子根系的生長(zhǎng)，并測(cè)定了該土壤桿菌的轉(zhuǎn)氨酶活性，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)氨酶活性高低與根系生長(zhǎng)的長(zhǎng)度呈現(xiàn)正相關(guān)。說(shuō)明生防菌株K1026不僅可用于櫻桃等核果類果樹(shù)根癌病的生物防治，還可用于微生物肥料的生產(chǎn)起到促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。

本文研究發(fā)現(xiàn)K1026生防菌株對(duì)小麥的根部生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，推測(cè)是由于土壤桿菌在自然條件下可以趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物，而對(duì)小麥等單子葉植物不易侵染造成的，具體原因還需要進(jìn)一步的研究。

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[2]KERR A. Biological control of crown gall [J]. Australasian Plant Pathology, 2016, 45: 15-18.

[5]李紀(jì)順，陳凱，楊合同，等.伯克霍爾德氏菌B418 的生物學(xué)特性[C]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2004年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2004:432-437.

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Nitrogen fixation, phosphate solubilizing activity and plant growth promotion ofAgrobacterium

WEI Yan-li1, Maarten RYDER2, LI Ji-shun1, LI Ling1, YANG Yu-zhong1, YANG He-tong1,3*

(1. Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences, Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Jinan 250014, China; 2. School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide, Adelaide 5064, Australia; 3.Research Center of Sustainable Development in the Yellow River Delta，Dongying 257000, China)

∶Through selective medium, the function of fixing nitrogen and dissolving phosphorus of 26Agrobacteriumstrains were studied by both qualitative and quantitative analysis methods. Meanwhile, growth-promoting effect of Australian bio-control strain K1026 on cucumber and wheat was measured by pot experiment. The results showed that all the strains regardless of pathogenicity or non-pathogenicity could grow normally on nitrogen-free medium. 19 of the 26 strains had the ability to dissolve phosphorus, the Phosphate released by K1026 in Pikovskaya broth medium was up to 109.11 μg/mL , having the strongest activities among all stains. The pot experiments showed that K1026 had obvious growth-promoting effect on the cucumber seedlings, and the root length and the dry weight of the root biomass was increased by 25.49%, 62.96%, respectively, compared with the control. However, K1026 had no obvious effect on the growth-promotion of wheat.

∶Agrobacteriumtumefaciens;AgrobacteriumrhizogenesK1026; nitrogen fixation; phosphate-solubilisation; growth promotion effect

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.005

2017-05-11

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016GNC113010)；2017年度山東省引進(jìn)國(guó)外智力成果示范推廣項(xiàng)目；黃河三角洲學(xué)者工程專項(xiàng)

魏艷麗(1978—)，女，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)微生物。E-mail: yanli_wei@163.com

*通信作者，楊合同，研究員，黃河三角洲學(xué)者特聘專家，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)病害生物防治。E-mail: yanght@sdas.org

S436.629

A

1002-4026(2017)04-0026-05