文蕾, 林云良, 高紅梅, 李峰, 姜姣姣, 宋祥云, 付瑞明, 王岱杰*

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

山楂葉提取物中牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷對(duì)照品的制備

文蕾1, 林云良2, 高紅梅2, 李峰2, 姜姣姣1, 宋祥云2, 付瑞明2, 王岱杰2*

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2. 山東省分析測(cè)試中心，山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

采用高速逆流色譜結(jié)合半制備液相色譜技術(shù)快速分離山楂葉中低含量的牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷單體。以氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)為溶劑系統(tǒng)，流速為5.0 mL/min，轉(zhuǎn)速為850 r/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，從山楂葉黃酮提取物中富集得到含牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種化合物的混合組分，經(jīng)半制備液相進(jìn)行二次分離純化，得到純度大于98%的牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷單體。研究結(jié)果表明，該技術(shù)對(duì)山楂葉中低含量黃酮類化合物的分離快速、高效，且純度高。

山楂葉；牡荊素；金絲桃苷；異槲皮苷；高速逆流色譜；半制備液相色譜

山楂葉(Crataegi Folium)為薔薇科(Rosaceae)植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.Var.majorN. E. Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥葉，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂等多種功效，在我國(guó)山東、陜西、山西等地均廣泛分布[1]。山楂葉作為山楂果實(shí)的副產(chǎn)物，資源豐富、產(chǎn)量高，具有廣泛的開發(fā)價(jià)值。現(xiàn)代藥理研究表明，山楂葉具有降血脂、抗心肌缺血缺氧、防治糖尿病、抗炎和鎮(zhèn)痛等多種藥理活性[2-5]，已廣泛地應(yīng)用于山玫膠囊、益心酮片等多種中成藥中。牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷為黃酮類化合物，是《中國(guó)藥典》中規(guī)定的山楂葉、山楂葉提取物及相關(guān)制劑的檢測(cè)指標(biāo)[6]。這3種成分在山楂葉中含量較低，采用聚酰胺柱聚酰胺色譜、硅膠柱色譜和Sephadex LH-20柱色譜等傳統(tǒng)制備方法，具有分離時(shí)間長(zhǎng)、重現(xiàn)性差、死吸附嚴(yán)重、溶劑消耗量大等問(wèn)題[7-14]。

為了克服上述缺點(diǎn)，我們運(yùn)用高速逆流色譜結(jié)合半制備液相色譜技術(shù)，對(duì)山楂葉中含量較低的牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種黃酮類成分進(jìn)行分離純化，得到高純度的單體，為進(jìn)一步開發(fā)山楂葉資源提供了技術(shù)支持。3種化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 山楂葉中3種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of 3 flavonoids from leaves of Crataegi Folium

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

TBE-300C高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；8823A紫外檢測(cè)器(北京艾美林科技有限公司)；TBP-5002輸液泵(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；3057便攜式記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)；DC-0506恒溫水浴槽(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters)；半制備用儀器采用LC-3000液相色譜系統(tǒng)(北京普源精電科技有限公司)；SB-5200D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

實(shí)驗(yàn)用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇為分析純(國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；高效液相色譜儀用乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher)，水為娃哈哈純凈水。

山楂葉黃酮提取物(陜西昊辰生物科技有限公司)，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%。

1.2 兩相溶劑體系及樣品溶液的制備

本實(shí)驗(yàn)中高速逆流色譜所用溶劑體系為氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)，按比例將4種溶劑置于2 L分液漏斗中，充分震蕩，靜置分層，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，使用前超聲波脫氣。

取山楂葉黃酮提取物800 mg，用上下相各15 mL溶解。

1.3 分配系數(shù)KD值的測(cè)定

取2 mg山楂葉總黃酮樣品置于2 mL試管中，加入2 mL下相，取5 μL溶液注入HPLC檢測(cè)，記錄相應(yīng)峰的峰面積為A1。加入2 mL上相于試管中，充分震蕩，靜置分層，取下相溶液5 μL注入HPLC，記錄相應(yīng)的峰面積為A2，KD= (A1-A2)/A2[15]。

1.4 高速逆流色譜分離

將高速逆流色譜溶劑體系的上相以30 mL/min注入儀器的分離柱聚四氟乙烯管中，啟動(dòng)儀器至850 r/min，以5.0 mL/min泵入流動(dòng)相，當(dāng)達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡，即流動(dòng)相從出口流出，無(wú)固定相流出時(shí)，將樣品溶液注入儀器的進(jìn)樣圈，開啟記錄儀和檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為254 nm，依據(jù)檢測(cè)器的色譜圖手動(dòng)收集流出液。

1.5 半制備液相色譜制備

將含有牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種黃酮類成分的樣品使用流動(dòng)相溶解，YMC采用YMC C18色譜柱(10.0 mm×250 mm, 5 μm)進(jìn)行二次制備，流動(dòng)相為乙腈-水(19∶81，V/V)，流速3.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.6 HPLC分析和結(jié)構(gòu)鑒定

山楂葉提取物、高速逆流色譜及半制備液相色譜所得各組分均采用HPLC進(jìn)行分析。色譜柱為Waters XBridge BEH C18柱(100 mm × 4.6 mm, 2.5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速1.0 mL/min；洗脫溶劑為乙腈和水，梯度條件為：0～3 min，13%～14%乙腈；3～15 min，14%～17%乙腈；15～15.1 min，17%～13%乙腈；15.1～20 min，13%乙腈。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC條件優(yōu)化

本文分別考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，梯度和等度液相條件洗脫對(duì)樣品分離的效果。研究結(jié)果表明，當(dāng)采用乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫，梯度條件為：0～3 min，13%～14%乙腈；3～15 min，14%～17%乙腈；15～15.1 min，17%～13%乙腈；15.1～20 min，13%乙腈時(shí)，各組分可以得到良好的分離。

2.2 HSCCC分離條件的優(yōu)化及上樣量的考察

本文分別考察了不同比例的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5，V/V)、正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(1∶1.6∶1∶1.6，V/V)、乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5，V/V)、氯仿-甲醇-水(4∶3∶2，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶0.5，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)、氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶2，V/V)體系對(duì)高速逆流色譜分離的影響。結(jié)果表明，當(dāng)采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶5∶1∶5，V/V)、正己烷-乙酸乙酯-乙醇V水(1∶1.6∶1∶1.6，V/V)、乙酸乙酯-正丁醇-水(4∶1∶5，V/V)體系時(shí)， 牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷主要集中于下相，3種化合物被快速洗脫出，未能實(shí)現(xiàn)有效的分離。當(dāng)采用氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶0.5，V/V)體系時(shí)，3種化合物洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分離效率較低。增加正丁醇的含量，洗脫時(shí)間縮短，當(dāng)正丁醇增至氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶2，V/V)時(shí)，溶液不能分層，無(wú)法進(jìn)行分離。當(dāng)正丁醇降至氯仿-甲醇-水-正丁醇(4∶3∶2∶1.5，V/V)時(shí)，3種化合物可以與其他色譜峰實(shí)現(xiàn)良好的分離，但由于3種化合物的KD值接近，即使調(diào)整逆流色譜分離的流速或者轉(zhuǎn)速，3種化合物色譜峰均被同時(shí)洗脫出出來(lái)，見圖2。因此，本文采用半制備液相色譜對(duì)3種化合物進(jìn)行二次分離制備。

圖2 山楂葉總黃酮的高速逆流色譜圖Fig.2 Chromatogram of total flavonoids from Crataegi Folium by HSCCC

本文基于分離效率考察了不同上樣量的山楂葉總黃酮提取物對(duì)逆流色譜分離的影響，結(jié)果表明，上樣量增加至800 mg時(shí)，仍可以實(shí)現(xiàn)牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3個(gè)峰與其他色譜峰的逆流色譜分離，得到含有上述3種化合物的混合物98.6 mg。

2.3 半制備液相色譜分離

本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例的乙腈-水體系對(duì)牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種化合物分離效率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)采用YMC C18色譜柱(10.0 mm×250 mm, 5 μm)進(jìn)行二次制備，流動(dòng)相為乙腈-水(19∶81，V/V)，流速3.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm時(shí)，3種化合物可以實(shí)現(xiàn)基線分離，最終制備得到3種化合物的純度均高于98%。制備圖見圖3，液相色譜圖見圖4。

圖3 逆流色譜粗分物的半制備液相分離色譜圖Fig.3 Chromatogram of pre-HPLC of total flavonoids separated by HSCCC

圖4 山楂葉中黃酮類化合物的HPLC分析圖Fig.4 HPLC chromatogram of flavonoids from Crataegi Folium

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：ESI-MS,m/z433.3 [M+H]+, 431.1 [M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 13.16( 1H, s, 5-OH), 6.90 (2H, d,J=6.4 Hz, H-3′, 5′), 6.77 (1H, s, H-3), 6.26 (1H, s, H-6), 4.69 (1H, d,J=9.9 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 181.7 (C-4), 163.7 (C-2), 162.7 (C-7), 161.0 (C-5), 160.3 (C-4′), 156.5 (C-9), 129.6 (C-2′), 128.8 (C-6′), 121.5 (C-1′), 115.7 (C-3′), 115.7 (C-5′), 104.7 (C-8), 104.1 (C-10), 102.4 (C-3), 98.2 (C-6), 81.7 (C-5″), 78.5 (C-3″), 73.3 (C-1″), 70.8 (C-2″), 70.4 (C-4″), 61.1 (C-6″)。與文獻(xiàn)[16]的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定為牡荊素。

化合物2：ESI-MS,m/z465.2 [M+H]-, 463.1 [M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.64 (1H, s, 5-OH), 10.84 (1H, s, 7-OH), 7.67 (1H, dd,J=2.0, 8.4 Hz, H-6′), 7.54 (1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.82 (1H, d,J=8.4 Hz, H-6′), 6.41 (1H, d,J=1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d,J=1.6 Hz, H-6), 5.38 (1H, d,J=8.0 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.3 (C-4), 164.5 (C-7), 161.1 (C-5), 156.2 (C-9),156.1 (C-2), 148.4 (C-4′), 144.7 (C-3′), 133.4 (C-3),121.9 (C-6′), 121.0 (C-1′), 115.8 (C-5′), 115.1 (C-2′), 103.7 (C-10), 101.8 (C-1″), 98.7 (C-6), 93.5 (C-8), 75.7 (C-5″), 73.1 (C-3″), 71.1 (C-2″), 67.8 (C-4″), 60.0 (C-6″)。與文獻(xiàn)[17]的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定為金絲桃苷。

化合物3：ESI-MS,m/z463.2 [M-H]-.1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 12.75 (1H, s, 4′-OH), 7.58 (1H, dd,J= 6.0, 2.0 Hz, H-6′), 7.57 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2′), 6.89 (1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.41 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6), 5.46 (1H, d,J= 7.2 Hz, H-1″)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 177.8 (C-4), 164.7 (C-7), 161.7 (C-5), 156.8 (C-9), 156.5 (C-2), 148.9 (C-4′), 145.3 (C-3′), 133.7 (C-3), 122.0 (C-6′), 121.6 (C-1′), 116.6 (C-5′), 115.7 (C-2′), 103.7 (C-10), 101.4 (C-1″), 99.2 (C-6), 94.0 (C-8), 77.9 (C-5″), 76.8 (C-3″), 74.5 (C-2″), 70.3 (C-4″), 61.3 (C-6″)。與文獻(xiàn)[18]的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定為異槲皮苷。

3 討論

本文采用高速逆流色譜結(jié)合半制備液相色譜技術(shù)，對(duì)山楂葉中含量較低的牡荊素、金絲桃苷、異槲皮苷3種黃酮類成分進(jìn)行分離純化，得到高純度的單體。研究結(jié)果表明，高速逆流色譜具有樣品無(wú)損失、無(wú)污染、高效、快速、粗提物進(jìn)樣、大制備量分離和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合于復(fù)雜組分樣品的前處理和富集。制備液相色譜具有分離效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢(shì)，而對(duì)組分較雜的樣品，該方法分離效率較低，樣品前處理嚴(yán)格。在本研究中將逆流色譜作為富集手段，增大了樣品上樣量，極大提高了富集效率。同時(shí)，結(jié)合制備液相色譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了低含量化合物的快速制備。采用高速逆流色譜與制備液相色譜技術(shù)結(jié)合，可發(fā)揮二者的優(yōu)勢(shì)，為復(fù)雜樣品中高純度化合物的分離提供參考。

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Preparation of reference substances of vitexin, hyperoside and isoquercitrin from Crataegi Folium extract

WEN Lei1, LIN Yun-liang2, GAO Hong-mei2, LI Feng2, JIANG Jiao-jiao1, SONG Xiang-yun2, FU Rui-ming2, WANG Dai-jie2*

(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China; 2. Shandong Analysis and Test Center,Shandong Provincial Key Laboratory of TCM Quality Control, Jinan 250014 China)

∶Three low content flavonoids, such as vitexin, hyperoside and isoquercitrin from Crataegi Folium were rapidly separated and purified by high-speed counter-current chromatography (HSCCC) combined with pre-HPLC. The total flavonoids from Crataegi Folium were firstly separated by HSCCC, with a solvent system of chloroform/methanol/water/n-butanol (4∶3∶2∶1.5,V/V), flow-rate of 5.0 mL/min, rotation speed of 850 r/min, detection wavelength of 254 nm. A mixed component was separated from crude flavonoids, containing vitexin, hyperoside, and isoquercitrin. Then, the mixture was separated by pre-HPLC and vitexin, hyperoside, and isoquercitrin were obtained, with the purity over 98%, respectively, as determined by HPLC. Experimental results show that it is an efficient method for separation of low content flavonoids with high purities from Crataegi Folium by HSCCC combined with pre-HPLC.

∶Crataegi Folium; vitexin; hyperoside; isoquercitrin; HSCCC; pre-HPLC

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.003

2017-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金((81473298, 21506119)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GZX219003)；山東省三院聯(lián)合基金(ZR2016YL006)

文蕾 (1992—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化與活性研究。

*通信作者，王岱杰。E-mail: wangdaijie@126.com

R284.2

A

1002-4026(2017)04-0013-06