潘曉倩，成曉瑜，張順亮，趙 冰，喬曉玲，陳文華，李家鵬，曲 超，王守偉*

腌臘肉制品中乳酸菌的篩選鑒定及其在臘腸中的應(yīng)用

潘曉倩，成曉瑜，張順亮，趙 冰，喬曉玲，陳文華，李家鵬，曲 超，王守偉*

（中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

為篩選適合傳統(tǒng)腌臘肉制品的優(yōu)良乳酸菌菌株，從多種農(nóng)家自制傳統(tǒng)腌臘肉制品中分離純化出9株優(yōu)勢(shì)乳酸菌。通過(guò)發(fā)酵特性篩選，得到一株性狀優(yōu)良菌株10M-7，并制備該菌株的干粉發(fā)酵劑，以未接種發(fā)酵劑臘腸為對(duì)照，分析此發(fā)酵劑對(duì)臘腸感官品質(zhì)和微生物變化的影響。結(jié)果表明，10M-7菌株具有良好的產(chǎn)酸特性和抑菌性能。根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rRNA序列分析，鑒定其為植物乳桿菌，采用冷凍干燥法制備純種發(fā)酵劑，并制作人工發(fā)酵臘腸。發(fā)酵劑組pH值在初期便迅速下降，且始終低于對(duì)照組；發(fā)酵劑組乳酸菌迅速生長(zhǎng)繁殖，且葡萄球菌和大腸桿菌數(shù)量與對(duì)照組相比明顯降低。感官評(píng)價(jià)表明，當(dāng)添加量為104CFU/g原料肉時(shí)，能夠很好地保持和改善產(chǎn)品風(fēng)味，使產(chǎn)品整體感覺(jué)更好。

發(fā)酵劑；腌臘肉制品；乳酸菌；鑒定；應(yīng)用

傳統(tǒng)腌臘肉制品具有高鹽和低水分活度的特點(diǎn)，便于貯藏，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是中國(guó)肉制品幾千年制作經(jīng)驗(yàn)與智慧的結(jié)晶。它屬于自然條件下，經(jīng)內(nèi)源酶及特定有益微生物的作用，發(fā)生一系列生化變化而制成的一類發(fā)酵肉制品[1-2]?，F(xiàn)階段，我國(guó)傳統(tǒng)腌臘肉制品生產(chǎn)仍然存在一些不可忽視的問(wèn)題，如傳統(tǒng)農(nóng)家方式生產(chǎn)的腌臘肉制品周期長(zhǎng)，其中微生物來(lái)源復(fù)雜，難以保障產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，易受雜菌污染，而工業(yè)化生產(chǎn)腌臘肉制品為了提高生產(chǎn)效率，多采用快速烘干成熟法，喪失了腌臘肉制品的獨(dú)特風(fēng)味[3-4]。篩選優(yōu)良發(fā)酵劑菌種并制備適用于腌臘肉制品發(fā)酵劑，實(shí)現(xiàn)對(duì)腌臘肉制品發(fā)酵過(guò)程的人工控制及工業(yè)化生產(chǎn)，不僅提高了產(chǎn)品食用安全性和風(fēng)味質(zhì)量，而且克服了自然發(fā)酵過(guò)程時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，難以控制的缺點(diǎn)。

早在20世紀(jì)30年代，美國(guó)就報(bào)道了發(fā)酵劑在香腸制作中的應(yīng)用，如今，發(fā)酵肉制品在歐美有著廣泛的消費(fèi)市場(chǎng)，且在肉類工業(yè)中占據(jù)著獨(dú)特的地位[5-6]。乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出來(lái)的微生物，是傳統(tǒng)腌臘肉制品中重要的優(yōu)勢(shì)菌群，與產(chǎn)品品質(zhì)有著密切的關(guān)聯(lián)[7-8]，近幾年，也有一些從腌臘肉制品中篩選肉用乳酸菌發(fā)酵劑菌株的相關(guān)報(bào)道[4,9]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可降低產(chǎn)品pH值，賦予產(chǎn)品特殊的發(fā)酵風(fēng)味，改善組織質(zhì)構(gòu)，促進(jìn)色澤與風(fēng)味的形成[10-11]。同時(shí)，某些乳酸菌能產(chǎn)細(xì)菌素，抑制腐敗菌和致病菌生長(zhǎng)繁殖[12-14]；降低產(chǎn)品中某些特定生物胺含量[15-17]；降低膽固醇，抗氧化作用[18]等。但并非所有乳酸菌都適合做發(fā)酵劑菌種，研究發(fā)現(xiàn)不同種及不同菌株乳酸菌之間的性能差異對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)具有很大影響[5,19-20]，因此真正適用于我國(guó)傳統(tǒng)腌臘肉制品的性狀優(yōu)良菌株的選育是采用人工發(fā)酵方法提升腌臘肉制品產(chǎn)品品質(zhì)的重要前提。本研究從多種農(nóng)家自制，具有良好風(fēng)味的傳統(tǒng)腌臘肉制品中分離、篩選優(yōu)勢(shì)乳酸菌，旨在篩選出性狀優(yōu)良的野生乳酸菌菌種，并將篩選出的乳酸菌接種到臘腸中，制作人工接種發(fā)酵臘腸制品，對(duì)整個(gè)發(fā)酵成熟過(guò)程的微生物特性進(jìn)行分析，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，為優(yōu)良發(fā)酵劑的研制及優(yōu)質(zhì)腌臘肉制品的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株分離材料：農(nóng)家自制傳統(tǒng)腌臘肉制品采集自廣西、湖南和四川3 個(gè)省區(qū)共20 種樣品，包括臘肉、臘腸、酸肉等腌臘肉制品。

臘腸加工用豬后腿肉、豬背脂 北京二商大紅門肉類食品有限公司；輔料：食鹽、白砂糖和香辛料 中國(guó)肉類食品綜合研究中心香辛料部。

培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（mannitol and sodium chloride agar medium，MSA）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）、MRS肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。改良MRS培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%NaCl和150 mg/kg的亞硝酸鈉。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix 天根生化科技有限公司；DNA Marker、溶菌酶 寶生物工程（大連）有限公司；通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGyTACCTTGTTACGACTT-3’） 上海立菲生物技術(shù)有限公司（北京）；pH值精密試紙（pH 5.4～7.0）；葡萄糖、亞硝酸鈉、NaCl、KCl均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜 新加坡Esco公司；PB-10型數(shù)顯酸度計(jì)、BSA822-CW型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；G154DWS高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；SCIENTZ-11L型無(wú)菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀及配套CBC鑒定卡片 北京威泰科生物技術(shù)有限公司；Primo Star生物顯微鏡 德國(guó)Zeiss公司；T100 Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc? XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；WH82絞肉機(jī) 德國(guó)賽德曼機(jī)械制造公司；OSCAR 20真空灌腸機(jī) 德國(guó)海因里希弗雷機(jī)械制造有限公司；DZ-600/2S型真空包裝機(jī) 山東小康機(jī)械有限公司；水分活度儀 瑞士Novasina公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌分離純化

在無(wú)菌條件下，取各樣品25 g，剪碎，放入無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無(wú)菌生理鹽水，放于無(wú)菌均質(zhì)器中拍打均質(zhì)后根據(jù)需要進(jìn)行梯度稀釋[21]。取1 mL樣品稀釋液于無(wú)菌平板中，倒入改良的MRS培養(yǎng)基，混勻，凝固后置于37 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落形態(tài)、大小、透明度等挑取單菌落并反復(fù)劃線純化直至獲得單菌株，挑取平板單菌落接種于MRS肉湯中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液滴加到pH 5.4～7.0精密試紙上，選取試紙顏色變黃（pH值小于5.4）對(duì)應(yīng)菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)，并保藏菌株[22]。

1.3.2 乳酸菌的篩選

根據(jù)發(fā)酵劑乳酸菌篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行以下篩選實(shí)驗(yàn)[4,23-24]：產(chǎn)酸特性實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)黏實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)、牛津杯法抑菌實(shí)驗(yàn)（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）。

1.3.3 乳酸菌的鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

用無(wú)菌棉簽蘸取平板上純菌落，制備2.7～3.3麥?zhǔn)蠁挝粷舛鹊木鷳乙?，用VITEK 2 Compact及其配套CBC鑒定卡進(jìn)行鑒定。

1.3.3.2 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量和片段大小。采用通用引物27F和1492R，以基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rRNA序列。PCR體系（50 μL）：DNA模板2 μL、引物27F和1492R各1 μL、2×Taq PCR MasterMix 25 μL、重蒸水21 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后，送英濰捷基貿(mào)易有限公司（北京）測(cè)序，應(yīng)用BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果在GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較以鑒定菌種歸屬。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力測(cè)定

[22]的方法測(cè)定生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力。

1.3.5 干粉發(fā)酵劑的制備及活性測(cè)定

將新鮮菌液（濃度108～109CFU/mL）按2%的接種量轉(zhuǎn)接至MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18～24 h，5 000 r/min離心15 min，棄上清液，加無(wú)菌生理鹽水洗滌一次，離心棄上清液，加入原液體培養(yǎng)基體積1/10的生理鹽水將菌體懸浮，備用。凍干小瓶中加入1 mL菌體懸浮液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的脫脂乳4 mL，混合均勻后，經(jīng)過(guò)真空凍干制得菌粉。采用梯度稀釋平板法測(cè)定凍干粉活性。

1.3.6 添加發(fā)酵劑臘腸的制備

加工工藝：原料肉（剔除結(jié)締組織等）→絞肉（瘦肉與脂肪均使用8 mm孔徑孔板）→加調(diào)味料和發(fā)酵劑攪拌混合（添加量分別為102、104、106、108CFU/g肉）→膠原蛋白腸衣灌制→23 ℃、相對(duì)濕度80%條件下發(fā)酵24 h→15 ℃、相對(duì)濕度85%條件下風(fēng)干成熟→成品

對(duì)照組為未添加發(fā)酵劑的自然成熟臘腸，其他所有配方和加工工藝與添加發(fā)酵劑臘腸相同。

1.3.7 感官分析

臘腸成品真空包裝后于室溫（25 ℃）貯藏1 周平衡水分，再進(jìn)行感官分析。選擇15 位專業(yè)人員組成感官評(píng)定小組，將2 組臘腸蒸煮20 min，切成1.0 mm左右的薄片，通過(guò)盲評(píng)計(jì)分，就臘腸色澤、氣味、滋味、組織結(jié)構(gòu)和整體接受度5 方面打分，每項(xiàng)總分10 分，樣品評(píng)定之間用清水漱口[25]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of sausage

1.3.8 水分含量與水分活度的測(cè)定

水分含量測(cè)定參照GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品水分含量測(cè)定》進(jìn)行；水分活度采用水分活度儀，測(cè)定6組，取平均值。

1.3.9 鹽分測(cè)定

參照GB/T 9695.8—2008《肉與肉制品 氯化物含量測(cè)定》進(jìn)行。

1.3.10 pH值和菌相變化分析

分別于臘腸制作第0、1、4、7、12天（成品）時(shí)取樣進(jìn)行pH值和菌相變化分析。

取臘腸不同部位若干塊混合，均質(zhì)，用pH計(jì)測(cè)定其pH值，每種樣品設(shè)6 次平行重復(fù)[26]。無(wú)菌條件下取臘腸不同部位樣品25 g放于225 mL無(wú)菌生理鹽水中，均質(zhì)后梯度稀釋，接種于相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基中進(jìn)行乳酸菌、葡萄球菌和大腸桿菌平板計(jì)數(shù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如表2所示[27]。

表2 菌相分析的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件Table 2 Selective media and incubation conditions used for bacterial isolation from sausages

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

Excel 2007統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差并制圖。感官評(píng)價(jià)結(jié)果采用SPSS 17.0顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化和篩選

表3 9 個(gè)分離菌株的發(fā)酵特性Table 3 Fermentation characteristics of nine isolated strains

通過(guò)梯度稀釋平板法和劃線分離，從樣品中分離出9 株耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鈉，且經(jīng)24 h液體搖床培養(yǎng)pH值小于5.4的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，其革蘭氏染色均為陽(yáng)性。菌株編號(hào)依次為9M-1、9M-3、10M-7、13M-4、13M-8、22M-1、22M-2、01105和01107。如表3所示，分離純化得到的9株菌均不產(chǎn)黏，發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣；產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)中，只有22M-2菌株產(chǎn)H2S，因此22M-2菌株不適宜作為肉制品的發(fā)酵劑菌種。培養(yǎng)24 h的pH值由低到高依次為10M-7、22M-1、13M-8、22M-2、13M-4、01105、01107、9M-3、9M-1。這9 株乳酸菌對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制作用的強(qiáng)弱程度差別較大，其中菌株10M-7效果最好。

2.2 菌株10M-7的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

圖1 10M-7的菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色圖（B）Fig. 1 Colony (A) and Gram-staining (B) of strain 10M-7

菌株10M-7來(lái)源于廣西三江地區(qū)農(nóng)家自制臘肉樣品，觀察圖1發(fā)現(xiàn)，10M-7菌株在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，37 ℃培養(yǎng)24 h后形成直徑約1 mm大小的圓形菌落，乳白色突起，表面濕潤(rùn)、有光澤，邊緣整齊；革蘭氏染色呈陽(yáng)性，細(xì)胞桿狀，單個(gè)、成對(duì)或鏈狀排列，無(wú)芽孢，接觸酶陰性，需進(jìn)一步選取CBC鑒定卡進(jìn)行生理生化鑒定。

經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定，10M-7株菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），鑒定可信度達(dá)到95%，置信水平極好，該菌株的理化及酶學(xué)特性如表4所示。

表4 菌株10M-7的生理生化鑒定結(jié)果Table 4 Identification of strain 10M-7 by CBC card

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株10M-7的PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析結(jié)果如圖2，得到一條約1 500 bp的DNA片段，符合細(xì)菌16S rRNA序列長(zhǎng)度，測(cè)序比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，菌株10M-7的16S rRNA序列與GenBank中L. plantarum MH19登錄號(hào)為FJ542291.1的序列同源性達(dá)到99%，因此，菌株10M-7的16S rRNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為植物乳桿菌，這與生理生化鑒定結(jié)果一致。該菌株已于2015年9月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 11341。

圖2 10M-7菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rRNA gene of 10M-7

2.3 菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)酸特性

圖3 菌株10M-7的生長(zhǎng)曲線（A）和產(chǎn)酸能力（B）Fig. 3 Growth curve and acid-producing capacity of strain 10M-7

將菌株10M-7在MRS肉湯中培養(yǎng)，其生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3A，0～2 h內(nèi)為延滯期，時(shí)間較短；2～12 h內(nèi)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此階段OD600nm由0.153增加至1.924，活菌數(shù)由7.49（lg（CFU/mL））增加至9.17（lg（CFU/mL））；12～30 h內(nèi)是穩(wěn)定期，之后為衰亡期?？梢?jiàn)該菌株延滯期短，穩(wěn)定期較長(zhǎng)。產(chǎn)酸曲線見(jiàn)圖3B，該菌株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，24 h內(nèi)pH值由5.8下降至4.1，其中主要是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期產(chǎn)酸較多。菌株生長(zhǎng)快、pH值的迅速降低有利于在肉制品中的快速定殖、生長(zhǎng)及產(chǎn)酸，從而抑制其他腐敗微生物的生長(zhǎng)，保證肉制品品質(zhì)[28]。

2.4 乳酸菌10M-7制作人工發(fā)酵臘腸的應(yīng)用效果

2.4.1 干粉發(fā)酵劑制備與活力測(cè)定

冷凍干燥法制得的干粉發(fā)酵劑為白色粉末，易溶于水，采用稀釋平板法測(cè)得該發(fā)酵劑活力為4.75×1010CFU/g。根據(jù)原料肉質(zhì)量，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組中需添加的干粉發(fā)酵劑質(zhì)量，使添加量依次為102、104、106、108CFU/g原料肉，未添加任何發(fā)酵劑的自然發(fā)酵臘腸為對(duì)照組。

2.4.2 感官分析

表5 感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 5 Results of sensory evaluation

如表5所示，發(fā)酵劑的添加對(duì)臘腸感官品質(zhì)具有一定影響。對(duì)照組和添加發(fā)酵劑制作的人工發(fā)酵臘腸在色澤、氣味和組織結(jié)構(gòu)方面差異不顯著，當(dāng)乳酸菌添加量為104CFU/g時(shí)，產(chǎn)品滋味較好，不僅保持了傳統(tǒng)臘腸特有的臘味，還具有發(fā)酵肉制品特有的香味，咸淡適中，酸味柔和，香味濃郁，整體評(píng)價(jià)得分最高。當(dāng)添加量增加至106、108CFU/g時(shí)，滋味越來(lái)越酸，影響其整體接受度。因此，選擇添加量為104CFU/g的發(fā)酵臘腸進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.4.3 水分及鹽含量變化

表6 臘腸制作過(guò)程中水分含量、水分活度和鹽含量變化Table 6 Variations in water content, water activity and salt content during sausage production

如表6可知，隨著臘腸發(fā)酵成熟過(guò)程的進(jìn)行，水分含量和水分活度均呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，降低幅度差異不大，但添加發(fā)酵劑組臘腸的水分含量略低于對(duì)照組，水分活度下降更快。這可能與乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致產(chǎn)品pH值下降有關(guān)，pH值的降低導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)保水能力減弱，風(fēng)干速率加快[27]。隨著水分的喪失，鹽含量在成熟過(guò)程中逐漸增加，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組差異不大，鹽含量的提高有利于病原菌及腐敗菌的抑制。

2.4.4 pH值變化

圖4 臘腸制作過(guò)程中pH值變化Fig. 4 Changes in pH value during sausage production

由圖4可知，對(duì)照組和添加發(fā)酵劑的實(shí)驗(yàn)組pH值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但下降幅度不同。對(duì)照組臘腸的pH值在0～4 d略有上升，之后緩慢下降，這可能是因?yàn)樽匀话l(fā)酵前期，乳酸菌生長(zhǎng)緩慢，而此時(shí)內(nèi)源蛋白酶降解肉蛋白產(chǎn)生非蛋白氮[29]，后期乳酸菌繁殖產(chǎn)酸導(dǎo)致pH值降低。添加發(fā)酵劑的臘腸pH值在發(fā)酵成熟初期便迅速下降，0～7 d其pH值由5.92下降至5.30，這是由于人工添加發(fā)酵劑后，乳酸菌在初期便具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過(guò)短時(shí)間的適應(yīng)后便大量繁殖產(chǎn)酸，后期7～12 d其pH值由5.30下降至5.18，降幅變緩，可能是因?yàn)殡S著風(fēng)干成熟過(guò)程的進(jìn)行，其水分活度降低，抑制了乳酸菌的繁殖。

2.4.5 菌相變化分析

圖5 臘腸制作過(guò)程中菌相變化Fig. 5 Changes in bacterial populations during sausage production

圖5為添加發(fā)酵劑臘腸與對(duì)照組臘腸在整個(gè)制作過(guò)程中乳酸菌、葡萄球菌和大腸桿菌的數(shù)量變化情況。乳酸菌在0～7 d增長(zhǎng)速率較快，7～12 d變化較平穩(wěn)，且添加發(fā)酵劑的實(shí)驗(yàn)組臘腸中乳酸菌在初期增加較快，其含量始終高于對(duì)照組。葡萄球菌和大腸桿菌的變化基本呈現(xiàn)先增加然后趨于穩(wěn)定，后期略有下降的趨勢(shì)。且發(fā)酵劑組中葡萄球菌和大腸桿菌的增長(zhǎng)幅度和總量都低于對(duì)照組，這主要是由于添加發(fā)酵劑組臘腸中乳酸菌增殖速率快，很快成為優(yōu)勢(shì)菌種，競(jìng)爭(zhēng)性抑制了其他微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)乳酸菌繁殖產(chǎn)生大量乳酸，產(chǎn)品pH值下降，也會(huì)抑制葡萄球菌和大腸桿菌的繁殖[30-31]。

3 結(jié) 論

從多種農(nóng)家自制的傳統(tǒng)腌臘肉制品中分離純化出9 株耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)6% NaCl和150 mg/kg亞硝酸鈉的優(yōu)勢(shì)乳酸菌，通過(guò)研究其生長(zhǎng)產(chǎn)酸特性及抑菌特性等，從中篩選得到1 株性狀優(yōu)良的乳酸菌10M-7，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定確定該菌株為植物乳桿菌（L. plantarum）。通過(guò)冷凍干燥制得該菌株的純種發(fā)酵劑，并制作人工發(fā)酵臘腸，以未添加發(fā)酵劑的傳統(tǒng)臘腸作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該發(fā)酵劑的添加能迅速降低產(chǎn)品發(fā)酵初期pH值，有效減少發(fā)酵成熟過(guò)程中大腸桿菌和葡萄球菌數(shù)量；水分含量、水分活度和鹽含量與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。感官評(píng)價(jià)顯示，當(dāng)添加量為104CFU/g原料肉時(shí)，臘腸成熟后，不僅保持了傳統(tǒng)臘腸特有的風(fēng)味，還具有發(fā)酵肉制品特有氣味。產(chǎn)品色澤、風(fēng)味、組織結(jié)構(gòu)各方面的評(píng)分與對(duì)照相比均無(wú)顯著性差異，且滋味方面，發(fā)酵劑組被描述為咸淡適中，酸味柔和，香味濃郁，較好地保持和改善了產(chǎn)品風(fēng)味，整體感覺(jué)更好。

因此，實(shí)驗(yàn)中分離得到的植物乳桿菌適合作為傳統(tǒng)臘腸的發(fā)酵劑菌株，提高了產(chǎn)品的食用安全性，很好地保持和改善了產(chǎn)品風(fēng)味，為傳統(tǒng)臘腸乃至傳統(tǒng)腌臘肉制品發(fā)酵劑的研制提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。關(guān)于該菌株在其他傳統(tǒng)腌臘肉制品中的應(yīng)用及與其他菌種結(jié)合開(kāi)發(fā)復(fù)配發(fā)酵劑還需進(jìn)一步研究。

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Screening and Identification of Lactic Acid Bacteria from Cured Meat Product and Its Application in Sausage

PAN Xiaoqian, CHENG Xiaoyu, ZHANG Shunliang, ZHAO Bing, QIAO Xiaoling, CHEN Wenhua, LI Jiapeng, QU Chao, WANG Shouwei*
(China Meat Research Center, Beijing 100068, China)

In order to screen lactic acid bacterial strains (LAB) with good performance for the fermentation of traditional cured meat products, nine strains of LAB were isolated and purified from home-made cured meat products. Out of these nine isolates, strain 10M-7 was selected for its good fermentation properties and it was prepared into a starter culture by freezedrying method. Effects of the starter culture on sensory quality and microbial growth in fermented sausage were examined using naturally fermented sausage without any starter cultures as a control. The results showed that strain 10M-7 had good acid production performance and antibacterial properties, and it was identified as Lactobacillus plantarum according to its morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence alignment. The pH value of LAB-fermented sausage decreased apparently during the early fermentation period, which was always lower than that of the control. LAB in artificially fermented sausage grew rapidly and the numbers of Staphylococcus and Escherichia coli were significantly lower than those in the control group. Addition of the starter culture at 104CFU/g raw meat could retain and improve the flavor of sausages so that the group exhibited better overall sensory acceptance.

starter culture; traditional cured meat products; lactic acid bacteria; identification; application

10.7506/spkx1002-6630-201716009

TS251.1

A

1002-6630（2017）16-0057-07

潘曉倩, 成曉瑜, 張順亮, 等. 腌臘肉制品中乳酸菌的篩選鑒定及其在臘腸中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 57-63. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716009. http://www.spkx.net.cn

PAN Xiaoqian, CHENG Xiaoyu, ZHANG Shunliang, et al. Screening and identification of lactic acid bacteria from cured meat product and its application in sausage[J]. Food Science, 2017, 38(16): 57-63. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716009. http://www.spkx.net.cn

2016-11-03

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303082）

潘曉倩（1987—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锱c肉制品質(zhì)量安全。E-mail：go_ahead123@163.com *通信作者：王守偉（1961—），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槿馄芳庸ぜ夹g(shù)。E-mail：cmrcwsw@126.com