茅銀燕,岳顯可

·藥學(xué)研究·

基于主成分分析的不同產(chǎn)地千年健GC指紋圖譜研究

茅銀燕1*,岳顯可2

目的 采用GC指紋圖譜結(jié)合主成分分析法(PCA)對(duì)不同產(chǎn)地千年健的質(zhì)量進(jìn)行研究。方法 采用GC色譜法對(duì)所采集的不同產(chǎn)地千年健藥材進(jìn)行指紋圖譜研究，建立GC指紋圖譜共有峰模式，并進(jìn)行相似度比較和主成分分析。結(jié)果 不同產(chǎn)地的千年健藥材的GC指紋圖譜有9個(gè)共有峰；相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地千年健的成分種類上差異不大；但主成分分析結(jié)果表明，成分比例和量上差異較大。結(jié)論 GC指紋圖譜結(jié)合聚類分析和主成分分析可以對(duì)千年健的質(zhì)量進(jìn)行客觀、有效的評(píng)價(jià)。

千年健；氣相色譜法；指紋圖譜；主成分分析

0 引言

千年健為天南星科植物千年健Homalomenaocculta(Lour.)Schott的干燥根莖[1]，主產(chǎn)于云南、廣東、廣西、海南等地區(qū)。味苦、辛，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、壯筋骨等作用，可治療跌打損傷、骨折、外傷出血、四肢麻木、筋脈拘攣、風(fēng)濕腰腿痛、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、胃痛、腸胃炎、痧癥等疾病[2-3]。主要含有揮發(fā)油成分、倍半萜類化合物、生物堿類化合物、脂肪、多糖及其他類化合物，其中揮發(fā)油成分中以芳樟醇、α-蒎烯、β-蒎烯為主，芳樟醇含量最高[4-5]。千年健是我國緊缺的名貴藥材之一[6]。為更加合理有效地利用千年健資源，需全面控制其質(zhì)量。目前單一活性成分(芳樟醇)不能全面反映千年健的質(zhì)量。本研究通過GC指紋圖譜結(jié)合主成分分析，對(duì)不同產(chǎn)地千年健的質(zhì)量進(jìn)行分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent GC 7890A氣相色譜儀，Agilent DB-17毛細(xì)管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(50%苯基-50%甲基聚硅氧烷為固定相)購自美國安捷倫科技公司；數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭儀器廠)；Al-204電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；BP210S十萬分之一電子天平(Sartorius公司)。

1.2 試劑 芳樟醇(批號(hào)：111503-201603)購自食品藥品檢定研究院；乙酸乙酯(分析純)，購自廣東光華科技股份有限公司；鋼瓶裝氮?dú)?、氫氣?/p>

1.3 藥材 千年健分別采集自廣東、廣西、云南、海南等地，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司質(zhì)檢科鑒定為天南星科植物千年健的干燥根莖。具體信息見表1。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜方法 Agilent DB-17毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，交聯(lián)50%苯基-50%甲基聚硅氧烷為固定相；檢測器(FID)溫度為300 ℃；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；升溫程序：初始溫度80 ℃，以2 ℃/min的速度升溫至100 ℃，載氣氮?dú)?，分流?∶1，進(jìn)樣量1 μL。見圖1。

表1 千年健樣品信息

圖1 芳樟醇和千年健樣品GC色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芳樟醇對(duì)照品61.70 mg，于50 mL容量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容至刻度，配制成每1 mL含1.23 mg對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取千年健粉末(過二號(hào)篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞三角錐形瓶中，精密加入乙酸乙酯20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(180 W，40 kHz)30 min，放冷，補(bǔ)足失重，搖勻，離心，取上清液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批千年健藥材(批號(hào)：20160201)，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，所得共有峰模式圖譜相似度均大于0.990，RSD為0.86%，表明儀器精密性良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批千年健藥材(批號(hào)：20160201)供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h測定，所得共有峰模式圖譜相似度均大于0.990，RSD為1.24%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批千年健藥材(批號(hào)：20160201)，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定。所得共有峰模式圖譜相似度均大于0.990，RSD為1.51%，表明提取和檢測方法重復(fù)性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰的標(biāo)定 取16批千年健藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分析，得到16批千年健的HPLC色譜圖。采用國家藥典委的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析，建立共有峰模式，通過比對(duì)相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn)9號(hào)峰為芳樟醇，并確定為參比峰。平均相對(duì)保留時(shí)間和平均相對(duì)峰面積、共有峰模式圖見表2、圖2。

表2 相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積統(tǒng)計(jì)表

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 從各批次千年健的HPLC圖譜與相似度系數(shù)可以看出相似度較高，表明千年健在化學(xué)成分組成上差異不明顯。見表3。

2.6 主成分分析

2.6.1 特征值和方差貢獻(xiàn)率 由表4、圖3得知，不同產(chǎn)地千年健有3個(gè)主成分，其特征值λ1=3.753，λ2=3.184，λ3=1.230，特征值λ1的貢獻(xiàn)率為41.695%，λ2的貢獻(xiàn)率為35.373%，λ3的貢獻(xiàn)率為13.663%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為90.731%。

圖2 不同產(chǎn)地千年健HPLC指紋圖譜疊加圖

編號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16DZS11．000———————————————0．998S20．9951．000——————————————0．999S30．9961．0001．000—————————————0．999S40．9961．0001．0001．000————————————1．000S51．0000．9950．9960．9961．000———————————0．998S60．9930．9880．9890．9890．9931．000——————————0．993S70．9940．9890．9900．9910．9941．0001．000—————————0．994S80．9980．9930．9930．9940．9980．9930．9941．000————————0．996S91．0000．9950．9960．9961．0000．9930．9940．9981．000———————0．998S100．9860．9980．9970．9970．9860．9790．9810．9840．9861．000——————0．995S110．9961．0001．0001．0000．9960．9890．9910．9940．9960．9971．000—————1．000S120．9961．0001．0001．0000．9960．9890．9900．9930．9960．9971．0001．000————0．999S130．9961．0001．0001．0000．9960．9890．9900．9940．9960．9971．0001．0001．000———1．000S141．0000．9950．9960．9961．0000．9930．9940．9981．0000．9870．9960．9960．9961．000——0．998S150．9890．9990．9980．9980．9890．9820．9830．9870．9891．0000．9980．9980．9980．9901．000—0．996S160．9880．9980．9980．9970．9880．9810．9820．9860．9881．0000．9970．9980．9970．9891．0001．0000．995DZ0．9980．9990．9991．0000．9980．9930．9940．9960．9980．9951．0000．9991．0000．9980．9960．9951．000

表4 特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖3 碎石圖

由表5、圖4可知，第1主成分主要反映4、7、8、9(芳樟醇)號(hào)峰信息，第2主成分主要反映1、3、5、6號(hào)峰信息，第3主成分主要反映2號(hào)峰信息。

2.6.2 不同產(chǎn)地千年健的綜合評(píng)價(jià) 以篩選的各主成分方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，對(duì)不同產(chǎn)地千年健主成分得分、綜合得分進(jìn)行分析，并對(duì)不同產(chǎn)地千年健質(zhì)量進(jìn)行排名，結(jié)果見表6。

表5 初始因子載荷矩陣

圖4 載荷圖

編號(hào)產(chǎn)地主成分1主成分2主成分3綜合得分排名S15海南0．18380．65300．04710．88401S14廣西-0．00730．24260．31710．55252S16廣東-0．13350．6363-0．02120．48173S11海南0．5855-0．0787-0．05930．44754S10廣西-0．22950．6762-0．04180．40495S9廣西0．5458-0．32960．13930．35556S2云南0．2753-0．0509-0．06350．16097S1云南0．3266-0．29210．12260．15718S12海南0．2803-0．1143-0．16030．00579S5福建0．1149-0．21210．0790-0．018210S13福建0．2530-0．1536-0．1463-0．046811S4廣東-0．0945-0．0738-0．1670-0．335212S3廣東-0．0808-0．0836-0．1727-0．337113S6福建-0．3676-0．31750．1463-0．538814S8福建-0．7582-0．1982-0．0232-0．979715S7云南-0．8938-0．30400．0037-1．194216

3 討論

千年健是我國傳統(tǒng)中藥，臨床上運(yùn)用千年健補(bǔ)腎壯骨、化瘀通絡(luò)、止痹痛等作用治療股骨頭缺血性壞死具有明顯的療效[7]；配合土茯苓、露蜂房可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]；配合狗脊、川續(xù)斷等可治療腰間盤突出癥[9]。國家已經(jīng)將千年健列入重點(diǎn)推薦發(fā)展品種。

指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，在中藥鑒別與質(zhì)量控制中起到重要的作用。主成分分析通過降維技術(shù)，根據(jù)貢獻(xiàn)率大小篩選幾個(gè)代表性的綜合指標(biāo)代替多個(gè)原始變量，化繁為簡。本研究通過GC指紋圖譜結(jié)合主成分分析，對(duì)不同產(chǎn)地千年健揮發(fā)油中的主要成分進(jìn)行分析，從色譜圖及相似度分析中，未發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地千年健藥材有明顯區(qū)別，說明化學(xué)成分組成無太大區(qū)別；主成分分析篩選3個(gè)主成分，并以相應(yīng)主成分貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，對(duì)不同產(chǎn)地千年健主成分得分、綜合得分進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)化學(xué)組分含量存在較大區(qū)別，且同一產(chǎn)地的藥材質(zhì)量并不統(tǒng)一，低緯度產(chǎn)千年健藥材質(zhì)量多優(yōu)于高緯度產(chǎn)的千年健藥材。

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GC fingerprint combined with principal component analysis in the study forHomalomenaoccultafrom different habitats

MAO Yin-yan1*,YUE Xian-ke2

(1.Hangzhou Xiaoshan Hospitol of TCM,Hangzhou 311201,China;2. Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310006,China)

Objective To assess the quality ofHomalomenaoccultafrom different habitats by GC fingerprint combined with principal component analysis (PCA).Methods GC method was used to determine the fingerprints ofHomalomenaoccultafrom different habitats.The common peaks were confirmed;similarity comparison and principal component analysis were performed.Results There were 9 common peaks of GC chromatographic fingerprints ofHomalomenaoccultafrom different habitats.The fingerprint similarity evaluation indicated that theHomalomenaoccultafrom different habitats had the same composition,but the principal component analysis indicated that the samples had different quantity proportion of ingredients.Conclusion GC fingerprint combined with PCA can objectively and effectively assess the quality ofHomalomenaoccultafrom different habitats.

Homalomenaocculta;GC;Fingerprint;Principal component analysis (PCA)

2016-11-23

1.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，杭州 311201;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310006

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201708017