王彩玲，徐栩栩，馮 娟

低劑量納曲酮治療實驗性自身反應性腦脊髓炎的初步研究

王彩玲，徐栩栩，馮 娟*

目的 通過誘導小鼠實驗性自身反應性腦脊髓炎(EAE)模型，觀察應用低劑量納曲酮(LDN)干預對EAE發(fā)病及炎癥反應的影響，從而探究LDN是否對EAE小鼠具有保護作用。方法 選取30只C57小鼠，隨機分為3組，即EAE+LDN組、EAE+PBS組及健康對照組，其中，EAE+LDN組在誘導EAE模型后給予0.2 mL的LDN (0.1 mg/kg)腹腔注射，EAE+PBS組在誘導EAE模型后給予等量的PBS腹腔注射，健康對照組為未誘導EAE組。觀察各組動物發(fā)病情況，每日監(jiān)測小鼠體重變化，對小鼠進行行為學評分，蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察各組小鼠腦組織炎性細胞浸潤情況，酶聯免疫(ELISA)法監(jiān)測血清中促炎性細胞因子水平變化。結果 LDN能有效延遲EAE小鼠的發(fā)病時間，并顯著緩解發(fā)病過程中的體重下降及神經功能障礙；HE染色可見LDN干預能有效減輕EAE小鼠腦組織中的炎癥反應，并能降低血清中促炎性細胞因子IFN-γ、IL-12、IL-17水平。結論 LDN能顯著緩解EAE模型的發(fā)病，并減輕EAE發(fā)病過程中的炎性反應。

多發(fā)性硬化；實驗性自身反應性腦脊髓炎；低劑量納曲酮；炎性反應

0 引言

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經系統(tǒng)(腦和脊髓)脫髓鞘和軸突變性為特點的炎性反應性疾病，臨床表現包括視力、運動、感覺、植物神經和認知功能的缺損，具有復發(fā)、遷延及致殘率高等特點，嚴重影響患者的身心健康[1]。多發(fā)性硬化的主要病理改變?yōu)樯窠浽獊G失，神經膠質增生，脫髓鞘和最終腦萎縮。MS的發(fā)病機制主要為CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、抗原呈遞細胞等多種細胞因子，以及趨化因子、免疫球蛋白等共同參與引起的炎癥反應。其中，CD4+T淋巴細胞在發(fā)病中發(fā)揮重要作用[2-3]。研究發(fā)現，MS患者及EAE模型體內外周血及腦脊液中存在較高濃度的IL-12、IFN-γ及IL-17，與病情呈正相關，且通過干預上述細胞因子可顯著降低動物模型的發(fā)病[4-5]。

MS一種潛在的輔助和替代治療方法為內源性阿片類物質系統(tǒng)，阿片類物質有調節(jié)自身免疫性疾病的作用，包括內源性阿片類生長因子及其受體，即甲硫氨酸腦啡肽及其核相關受體。納曲酮為阿片受體拮抗劑，低劑量納曲酮(Low-dose naltrexone，LDN)可誘導生成“阿片類物質反彈”現象。研究者認為，LDN可誘導產生一個小的、瞬態(tài)的阿片樣物質封鎖，反饋促進體內內源性阿片物質和阿片受體的上調，可以調節(jié)T淋巴細胞、星形膠質細胞和其他與MS炎癥及變性相關細胞的復制，從而調控機體的多項效應[6]。以往LDN臨床多用于戒毒治療，最新研究發(fā)現，其作為新型抗炎制劑，可顯著改善多種炎性疾病，如克羅恩病、纖維肌痛等[7-8]，然而其對MS的研究國內外存在不同的觀點，因此，本研究體外給予EAE模型LDN干預，觀察LDN對EAE動物模型發(fā)病情況及炎癥反應的影響。

1 對象與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 C57小鼠購于北京華阜康實驗動物中心，體重15～16 g，適應性喂養(yǎng)1周。髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG) 35-55購于上海吉爾生化公司，結核分枝桿菌 H37 Ra株購于DIFCO公司，百日咳毒素(Pertussistoxin，PTX)、完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)及LDN購于Sigma公司。鼠IFN-γ、IL-12、IL-17酶聯免疫試劑盒均購于Ebioscience公司。

1.2 EAE模型制備 MOG35-55與等體積的CFA混勻(H37Ra濃度為8 mg/mL)，在冰上充分混勻乳化成油包水狀乳劑，然后每只鼠于背部脊柱兩旁分4點皮下注入0.2 mL，分別于免疫第0小時及第48小時小鼠腹腔注入PTX 300 ng，建立 EAE小鼠動物模型。免疫當天為第1天。將小鼠隨機分為3組：EAE+LDN組、EAE+PBS組、健康對照組。EAE+LDN組、EAE+PBS組均給予EAE造模。EAE+LDN組：從造模第1天即給予0.2 mL的LDN (0.1 mg/kg)腹腔注射；EAE+PBS組：從造模第1天即給予等量的PBS腹腔注射，直至處死。健康對照組為健康C57小鼠，從實驗第1天開始腹腔給予0.2 mL的PBS溶液注射。

1.3 動物發(fā)病情況觀察 從免疫當天起，兩人雙盲法每天觀察小鼠狀態(tài)并測量體重，借鑒經典的Kono[9]評分標準對小鼠進行行為學評分：0分，無癥狀；1分，尾部無力；2分，后肢無力；3分，后肢完全癱瘓；4分，后肢癱瘓并累及前肢；5分，垂死或死亡。神經功能缺損癥狀介于兩標準之間者以±0.5分計算。

1.4 腦組織病理形態(tài)檢測 于發(fā)病高峰期，斷頭取小鼠腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片烘干后進行蘇木素-伊紅(HE)染色。切片于二甲苯脫蠟，梯度乙醇分化，自來水沖洗，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后，光鏡下觀察腦組織炎性浸潤情況。每只小鼠隨機選取3張切片，每張切片隨機選取3個視野，雙盲法進行炎性評分：0分，無炎性細胞浸潤；1分：少量分散的炎性細胞浸潤；2分，“血管套袖”樣炎性細胞浸潤；3分，大量“血管套袖”形成及廣泛組織炎性細胞浸潤。

1.5 細胞因子檢測 于發(fā)病高峰期，眼球取血，靜置2 h后高速離心10 000 g/min取上層血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取冰凍血清放置? ℃冰箱中，嚴格按照試劑盒說明書，應用IFN-γ、IL-12、IL-17 酶聯免疫試劑盒，檢測血清細胞因子含量。

2 結果

2.1 各組動物發(fā)病情況比較 健康對照組沒有發(fā)病，小鼠的體重穩(wěn)步上升。EAE+PBS組小鼠多于免疫后第13天開始發(fā)病，平均發(fā)病時間為(13.01±0.16) d，高峰期體重為(14.81±0.04) g。EAE+LDN組小鼠多于免疫(16.04±0.15) d開始發(fā)病，起病時間較EAE+PBS組小鼠延遲(P<0.05)，而高峰期體重為(16.40±0.04) g，體重下降較EAE+PBS組減輕(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組動物行為學評分 健康對照組沒有發(fā)病，行為學評分為0分。EAE+PBS組小鼠發(fā)病前期表現出進食減少、活動減少等癥狀，發(fā)病高峰期表現為尾部無力、后肢癱瘓，被動翻身不能，甚至出現垂死狀態(tài)，高峰期行為學評分為(3.32±0.05)分。EAE+LDN組小鼠發(fā)病前期也表現出進食減少、活動減少等癥狀，但癥狀較EAE+PBS組明顯減輕，發(fā)病高峰期表現為尾部無力，嚴重者出現后肢癱瘓，高峰期行為學評分為(1.70±0.05)分，較EAE+PBS組小鼠延緩(P<0.05)。見圖2、圖3。

圖2 各組動物行為學評分比較

2.3 各組動物腦組織病理比較 健康對照組小鼠的腦組織病理HE染色未見到炎性細胞的浸潤。與健康對照組相比，EAE+PBS組發(fā)病高峰期腦組織中可見大量炎性細胞浸潤，主要累及白質，小血管擴張，炎性細胞圍繞血管周圍呈“血管袖套”樣浸潤，以淋巴細胞浸潤為主，也可見膠質細胞和巨噬細胞，炎性評分為(2.88±0.13)分；EAE+LDN組小鼠炎性浸潤程度減輕，可見炎性浸潤，多散在分布，“血管袖套”樣浸潤少見，炎性評分為(1.13±0.13)分，與EAE+PBS組相比顯著降低(P<0.05)，見圖4、圖5。

2.4 各組動物血清細胞因子比較 健康對照組小鼠血清IL-12含量為(37.33±4.32) pg/mL，EAE+PBS組為(376.1±12.19) pg/mL，較健康對照組小鼠血清IL-12含量顯著升高(P<0.05)，而EAE+LDN組為(153.81±7.53) pg/mL，較EAE+PBS組顯著下降(P<0.05)。健康對照組小鼠血清IFN-γ含量為(63.93±9.32) pg/mL，EAE+PBS組為(575.31±9.23)pg/mL，較對照組顯著升高，EAE+LDN組為(349.6±9.33)pg/mL，較EAE+PBS組顯著下降(P<0.05)。健康對照組小鼠血清IL-17含量為(24.07±4.28) pg/mL，EAE+PBS組為(153.41±7.31)pg/mL，較健康對照組顯著升高(P<0.05)，而EAE+LDN組為(72.44±3.79)pg/mL，較EAE+PBS組顯著下降(P<0.05)。

圖3 各組動物發(fā)病高峰期圖片

圖4 各組動物腦組織病理比較(200×)

圖5 各組炎性評分比較

3 討論

MS是一種累及中樞神經系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)的自身免疫性脫髓鞘性疾病[10]。雖然其病因尚未明確，目前普遍認為MS中的免疫調節(jié)是多因素的，涉及遺傳易感性、表觀遺傳學、后基因組事件及環(huán)境因素[11-12]，免疫機制主要為外周異常激活的髓鞘抗原特異性CD4+T淋巴細胞穿過受損的血-腦脊液屏障(Blood-brain barrier，BBB)進入CNS，誘發(fā)異常的免疫應答級聯反應，并最終導致炎性細胞浸潤等病理改變[13]。

納曲酮是一種長效的非選擇性阿片受體拮抗劑，由環(huán)丙甲基取代二氫嗎啡酮氮位點的甲基。其主要作用是阻斷快感促進m、d阿片受體，對k阿片樣物質受體的阻斷作用較小。相比于其他阿片受體，LDN具有持續(xù)時間長、效果好、可口服、親和性高、無依賴和不產生耐受等特點，1984年被FDA批準用于治療鴉片劑成癮。1次/d體外給予LDN，能夠間斷阻斷阿片類受體，并抑制細胞增殖。已有研究證實，LDN在克羅恩病和纖維肌痛等多種自身免疫性疾病的治療中安全有效[14-15]。針對LDN對EAE模型的研究，國內外存在不同的觀點。國外有研究認為，LDN不能緩解EAE病情，但可以降低模型脊髓內的CD3+/CD4+T細胞比值[16]；還有研究顯示，低劑量的LDN可不同程度地減輕EAE病情，改善模型體內的炎癥情況[17]。用LDN治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型的小鼠，可以改善進展性EAE的結局，注射髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(MOG)建立小鼠EAE模型，每天給予0.1 mg/kg的LDN，疾病臨床發(fā)作開始的時間延遲，行為缺陷減少，小鼠的脊髓病理顯示，星形膠質細胞和脫髓鞘的面積減少。LDN治療復發(fā)緩解型的EAE小鼠表明，內源性阿片類物質抑制疾病的進展。因此，本研究通過誘導EAE模型，體外給予低劑量的LDN干預，觀察LDN對EAE模型的治療作用。

本研究顯示，EAE+PBS組小鼠發(fā)病前期出現進食減少、活動減少等癥狀，發(fā)病高峰期表現為尾部無力、后肢癱瘓，被動翻身不能，甚至出現垂死狀態(tài)；而EAE+LDN組小鼠發(fā)病前期也表現出進食減少、活動減少等癥狀，但高峰期癥狀較EAE+PBS組明顯減輕，發(fā)病高峰期多表現為尾部無力，嚴重者出現后肢癱瘓。EAE+LDN組小鼠起病時間較EAE+PBS組明顯延遲，高峰期體重下降也減輕，高峰期行為學評分也顯著下降。鑒于免疫因素在EAE疾病中的重要作用，本研究應用HE染色觀察顱內炎性細胞浸潤情況。腦組織HE染色可見，EAE+PBS組出現大量炎性細胞浸潤，小血管擴張，出現“血管袖套”樣浸潤；而EAE+LDN組小鼠炎性浸潤程度較輕，可見炎性浸潤，多散在分布，“血管袖套”樣浸潤少見，并且炎性評分顯著低于EAE+PBS組，提示LDN可以顯著改善EAE模型顱內炎性浸潤情況。隨后，筆者深入研究各模型體內致炎性細胞因子分泌情況，結果顯示，LDN可顯著降低IL-12、IFN-γ、IL-17含量，印證了之前行為學及組織病理學分析的結果。并且，國外有臨床研究表明，針對MS患者，應用LDN可顯著改善患者的生活質量及心理狀況，與本研究一致。Cree等[18]經過連續(xù)8周的臨床實驗，證實納曲酮4.5 mg/d是可以提高生活質量的安全劑量，而Sharafaddinzadeh等[19]報道了LDN連續(xù)17周治療的安全性，并建議關于臨床安全性應該進行更長時間的研究。有研究表明，LDN可顯著改善MS患者的疲勞癥狀，提示上調的阿片類物質系統(tǒng)和疲勞之間有潛在的聯系。Gironi等[20]報道，在LDN治療開始的1、3、6個月，β-內啡肽水平升高，LDN停藥后的1個月，β-內啡肽水平仍保持升高，但沒有報道其是否恢復到治療前的水平。本研究結果表明，LDN可通過減輕顱內炎性浸潤，減少體內Th1、Th17細胞因子分泌，明顯緩解EAE模型的發(fā)病狀況。本研究也存在很多不足，如LDN是否可以改善體內脾及CNS單核細胞中Th1、Th17失衡，以及其通過何種信號通路機制改善疾病仍然未知，需要深入研究。

綜上所述，LDN可以通過調控免疫反應改善EAE病情，為LDN在臨床中治療MS提供理論指導，但是仍有很多調控機制亟待解決。隨著對LDN作用機制的深入研究，期待其對臨床上針對MS的治療產生重要影響。

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A preliminary study of low-dose naltrexone in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis

WANG Cai-ling,XU Xu-xu,FENG Juan*

(Department of Neurology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To observe the effect of low-dose naltrexone (LDN) on the pathogenesis and the inflammatory response of mice model with the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE),and explore whether LDN had a protective effect on EAE mice.Methods Thirty C57 mice were randomly divided into EAE+LDN group,EAE+PBS group and healthy control group.EAE+LDN group was injected with 0.2 mL LDN (0.1 mg/kg) intraperitoneally,EAE+PBS group

intraperitoneal injection of equal volume of PBS,and healthy control group was unimmunized.The onset time of the disease,body weight and behavioral score were observed in the three groups.Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the infiltration of inflammatory cells in the brain tissue of mice,and the level of pro-inflammatory cytokines in serum was monitored by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).Results LDN could significantly delay the onset time of EAE mice,and alleviate the weight loss and the neurological dysfunction during the process of disease.The intervention of LDN could effectively reduce the inflammatory reaction in the brain tissue of EAE mice by HE staining and decrease the expression of IFN-γ,IL-12 and IL-17 in serum.Conclusion LDN can alleviate the symptoms of EAE model significantly,and reduce the inflammatory reaction in the process of EAE disease.

Multiple sclerosis;EAE;LDN;Inflammatory response

2017-02-24

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院神經內科，沈陽 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201708002