仉薇，侯力丹，宋潔，張爽，李蕓，李晶，孫蕾，范文輝，劉文軍

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081

一種更靈敏的特異性檢測H9亞型禽流感抗體的間接ELISA方法的建立

仉薇1,2，侯力丹3，宋潔1,2，張爽1，李蕓1，李晶1，孫蕾1,2，范文輝1，劉文軍1,2

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081

仉薇, 侯力丹, 宋潔, 等. 一種更靈敏的特異性檢測H9亞型禽流感抗體的間接ELISA方法的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2017,33(8): 1253–1264.

Zhang W, Hou LD, Song J, et al. Establishment of a high sensitive indirect ELISA for detecting specific antibodies against H9 subtype avian influenza virus. Chin J Biotech, 2017, 33(8): 1253–1264.

H9亞型禽流感在全球范圍內(nèi)廣泛流行，控制其傳播需監(jiān)測H9亞型禽流感病毒的感染情況及疫苗的免疫效果。為了建立便于檢測且靈敏特異的 H9亞型禽流感抗體間接 ELISA方法，本實(shí)驗(yàn)利用不同亞型之間變異較大的H9亞型禽流感病毒HA蛋白的頭部球狀區(qū)作為包被抗原，確定了最佳復(fù)合封閉液和抗體稀釋液，提高了其特異性。結(jié)果顯示建立的ELISA方法靈敏度高于血凝抑制試驗(yàn) (HI)，且與H3N2、H5N2、H7N9亞型流感病毒及新城疫病毒 (NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒 (IBV)、雞傳染性法氏囊病毒 (IBDV) 和產(chǎn)蛋下降綜合征病毒 (EDSV) 的陽性血清均無交叉反應(yīng)。另外，利用該方法及HI試驗(yàn)對200份臨床雞血清樣本進(jìn)行檢測，兩種檢測方法的符合率達(dá)97%，且存在較高的相關(guān)性 (R2=0.981 1)。

H9亞型，禽流感病毒，血凝素蛋白，間接ELISA，血凝抑制試驗(yàn)

流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，根據(jù)核蛋白抗原性的不同分為A、B、C三型及在牛體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的 D型流感病毒[1]。A型流感病毒的影響范圍及危害最大[2]，可引起禽類、哺乳動(dòng)物及人類流感的發(fā)生。A型禽流感病毒根據(jù)其致病性高低可分為高致病性禽流感病毒(High-pathogenicity avian influenza virus，HPAIV)和低致病性禽流感病毒 (Low-pathogenicity avian influenza virus，LPAIV)[3-4]。H9亞型禽流感病毒屬于LPAIV，可以引起家禽、水禽、野鳥等發(fā)生禽流感[5-7]，是全世界分布最廣的亞型[8]，主要在亞洲、中東和北非等地流行，以產(chǎn)蛋減少及混合感染為特征，造成了養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9-11]。除此之外，H9亞型禽流感病毒偶爾也感染人類，在中國大陸、中國香港、伊朗、孟加拉國和埃及等地都有分散病例[15-17]，給人類的公共衛(wèi)生安全帶來了潛在的威脅。疫苗是目前控制流感的主要手段。因此及時(shí)準(zhǔn)確地評估禽流感疫苗的免疫效果，并監(jiān)測H9亞型禽流感病毒的流行情況是防控工作的重中之重[12]。

H9亞型禽流感病毒及其抗體的檢測方法主要有：病毒的分離鑒定、血凝抑制試驗(yàn) (HI)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn) (NI)、瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、中和試驗(yàn) (NT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、RT-PCR及依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(NASBA) 等方法。其中，病毒的分離鑒定診斷比較確切[13]，是目前確診禽流感的首選方法，但該方法耗時(shí)較長，病毒從分離培養(yǎng)到最后分型需要 20 d左右，不適用于快速檢測；HI和NI是對流感病毒抗體進(jìn)行亞型鑒定的常用方法，但其靈敏度低，而且因血清中含有非特異性紅細(xì)胞凝集物質(zhì)和非特異性血凝抑制物質(zhì)，故在診斷中還需要先進(jìn)行預(yù)處理，操作過程復(fù)雜，且試驗(yàn)中需要用到大量的病毒作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，因而在制備和使用過程中存在傳播病毒的風(fēng)險(xiǎn)，需要在 P2甚至 P3級的實(shí)驗(yàn)室操作[14-15]；AGP方法操作比較簡單，結(jié)果容易判定，但其靈敏度和HI實(shí)驗(yàn)一樣偏低[14]；NT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，但其靈敏度低，操作繁瑣，不適于大批量樣品的檢測[15]。本研究建立的間接ELISA與HI試驗(yàn)有很高的相關(guān)性，且其靈敏度遠(yuǎn)高于HI試驗(yàn)，能進(jìn)行大量樣品的分析并進(jìn)行相對定量，操作中不使用病毒作為抗原，在普通的臨床實(shí)驗(yàn)室就可以熟練操作，耗時(shí)較短，可用于大批量臨床樣品血清的檢驗(yàn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌 TOP10和 BL21、原核表達(dá)載體pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存；Pfu酶、Taq酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、TMB底物顯色液購自天根生化科技 (北京) 有限公司；96孔酶標(biāo)板購自上海源葉生物科技有限公司；Ni-NTA His Bind Resin購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白預(yù)染 marker購自寶林科 (北京)生物科技有限公司；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的羊抗雞 IgG購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；H3N2、H5N2、H7N9陽性血清、H9N2禽流感滅活病毒、H9N2亞型禽流感病毒陽性血清及 SPF雞陰性血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；NDV、IBV、IBDV、EDSV陽性血清購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷中心。

1.2 包被抗原的原核表達(dá)及純化

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將H9N2禽流感病毒HA基因的頭部球狀區(qū)進(jìn)行密碼子優(yōu)化后交由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行人工合成。將人工合成的目的基因經(jīng)BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切后克隆至 pET-32a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐抗性 LB平板，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR及雙酶切鑒定。鑒定所用引物為P-F：5′-GGATCCTGCGCCACCAACCTGGGC-3′，P-R：5′-CTCGAGTTAGGTGGTATTCAGACC-3′。將菌落PCR及雙酶切鑒定陽性的克隆送至北京博邁德生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，選取測序正確的克隆提取質(zhì)粒。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組表達(dá)菌株，挑單菌落接種到10 mL氨芐濃度為50 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8-10 h，作為種子。將該種子按照1∶100接種到500 mL氨芐濃度為50 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600在 0.8-1.0之間，加入終濃度為 1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，37 ℃條件下誘導(dǎo)5 h，留取誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行SDS-PAGE鑒定目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 重組蛋白的純化與復(fù)性

用裂解液重懸菌體，超聲破碎 (400 W，超聲3 s，間歇4 s，20 min)，將得到的上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE。用 PBS (NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L，KH2PO40.24 g/L，pH 7.2)、PBST-1 (NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L，KH2PO40.24 g/L，Triton X-100 0.05%，pH 7.2)、2 mol/L尿素、1 mol/L NaCl洗滌包涵體，洗滌后的包涵體用變性劑 (8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris，pH 8.0) 進(jìn)行變性，12 000 r/min離心10 min取上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，用 Ni柱進(jìn)行親和層析純化，然后再利用Superdex 2000層析柱進(jìn)行分子篩純化，收集目的蛋白所在的洗脫峰，SDS-PAGE檢測蛋白純度。最后將純化后的變性蛋白連續(xù)緩慢地滴入到復(fù)性液中，使其復(fù)性。用BCA蛋白試劑盒檢測復(fù)性蛋白的濃度，并利用Western blotting檢測其免疫原性。

1.3 間接ELISA方法的建立

1.3.1 間接ELISA的操作方法

用碳酸鹽 (pH 9.6) 稀釋純化后的目的蛋白，包被96孔酶標(biāo)板 (100 μL/孔) 4 ℃過夜，用PBST-2 (NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L，KH2PO40.24 g/L，Tween-20 0.05%，pH 7.2) 洗滌3次，之后用封閉液 (200 μL/孔)37 ℃封閉2 h，用PBST-2洗滌3次。將血清用抗體稀釋液按照一定比例稀釋后，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，用PBST-2洗滌5次。HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG用抗體稀釋液按一定比例稀釋后，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，用PBST-2洗滌5次。每孔加入100 μL TMB顯色液，37 ℃孵育15 min后加入50 μL/孔終止液 (濃度為 2 mol/L的硫酸水溶液)。最后用酶標(biāo)儀測定450 nm下的吸光值 (OD450)。

1.3.2 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化

最適抗原包被濃度及最佳血清稀釋倍數(shù)的確定：參照方陣滴定法將純化復(fù)性后的重組蛋白按照 50 ng/孔、100 ng/孔、200 ng/孔、300 ng/孔、400 ng/孔包被96孔酶標(biāo)板，H9N2亞型禽流感病毒陽性血清及 SPF雞陰性血清分別按照1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160和 1∶320稀釋，按照上述ELISA操作方法進(jìn)行操作，以陽性血清OD450的值接近1，陰性血清OD450小于0.1，且P/N值最大時(shí)的抗原包被及血清稀釋作為最適抗原包被量及最佳血清稀釋倍數(shù)。

封閉液及封閉時(shí)間的選擇：按照確定的最佳抗原包被量包被96孔酶標(biāo)板，分別以1%明膠、1% BSA、5%脫脂乳、PBS和復(fù)合封閉液 (NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L，KH2PO40.24 g/L，山羊血清50 mL/L，明膠溶液5 mL/L，酪蛋白2 g/L，蔗糖10 g/L，pH 7.2)，各200 μL對酶標(biāo)板進(jìn)行封閉，每種封閉液重復(fù)4孔，按照ELISA操作方法進(jìn)行操作，根據(jù)陰陽血清的OD450值及P/N值選擇最佳封閉液。選用最優(yōu)封閉液，改變封閉時(shí)間，分別封閉0.5 h、1 h、1.5 h和2 h，根據(jù)陰陽性血清OD450值及P/N值，選擇最佳封閉時(shí)間。

抗體稀釋液的選擇：按照確定的最佳抗原包被量包被96孔酶標(biāo)板，用復(fù)合封閉液進(jìn)行封閉，分別用1% BSA、2%脫脂乳、PBS和復(fù)合抗體稀釋液 (NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.58 g/L，KH2PO40.24 g/L，山羊血清20 mL/L，酪蛋白1 g/L，蔗糖5 g/L，Tween-20 0.05%，pH 7.2) 來稀釋血清及二抗，按照ELISA操作方法進(jìn)行操作，根據(jù)陰陽血清的 OD450值及 P/N值選擇最佳抗體稀釋液。

酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)及最適二抗孵育時(shí)間的確定：根據(jù)優(yōu)化的最佳抗原包被量、抗體稀釋倍數(shù)、封閉液及封閉時(shí)間將酶標(biāo)二抗按照1∶1 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000稀釋后加入，按照ELISA操作方法進(jìn)行操作。根據(jù)P/N值選擇最佳二抗?jié)舛?。其他條件不變，選擇最適二抗稀釋倍數(shù)孵育，改變二抗孵育時(shí)間，分別孵育0.5 h、1 h、1.5 h和2 h，根據(jù)陰陽性血清的OD450值及P/N值，篩選最佳二抗孵育時(shí)間。

1.4 臨界值的確定

取30份通過HI試驗(yàn)驗(yàn)證為陰性的臨床血清按照 1∶80稀釋并按照已經(jīng)建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測，測定 OD450。根據(jù)公式+3s計(jì)算出陽性判定值，公式中的為 HI陰性樣品的 OD450的平均值，s為 HI陰性樣品的標(biāo)準(zhǔn)方差。當(dāng)待檢血清的 OD450平均值≥+3s，則判定為陽性，當(dāng)OD450＜+2s則判定為陰性，介于二者之間則判定為可疑樣品。

1.5 特異性試驗(yàn)

按照建立的間接 ELISA方法對 H3N2、H5N2、H7N9亞型的禽流感病毒及NDV、IBV、IBDV和EDSV的陽性血清進(jìn)行檢測，同時(shí)設(shè)立陽性對照 (H9N2亞型禽流感病毒陽性血清) 和陰性對照 (SPF雞陰性血清)，根據(jù)得到的OD450值判定其是否與其他亞型及其他常見禽類病毒的血清有交叉反應(yīng)。

1.6 靈敏度試驗(yàn)

挑選20例HI效價(jià)為24-25之間的陽性樣品血清，分別對其進(jìn)行16、32、64、128、256和512倍稀釋，再用稀釋后的血清分別進(jìn)行HI試驗(yàn)和間接ELISA試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)不同稀釋倍數(shù)下二者的陽性率，從而比較兩種方法的靈敏度。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

1.7.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

在同一時(shí)間，同一條件下，采用同一批次重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板，分別選取5份陽性樣品血清及陰性血清，每份血清重復(fù) 7個(gè)孔，按已建立的間接ELISA方法進(jìn)行測定。得出標(biāo)準(zhǔn)差 (s) 及平均值 ()，之后運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算變異系數(shù) (cv)。變異系數(shù)能夠衡量各觀測值的變異程度，反映各觀測值在單位均值上的離散程度。

1.7.2 批間重復(fù)性試驗(yàn)

采用不同批次重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板，在3個(gè)不同時(shí)間按已建立間接ELISA最佳反應(yīng)體系及條件測定 5份陽性樣品血清及陰性血清(每份重復(fù)4個(gè)孔) 的OD450值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差 (s)、平均值 ()，求出各樣品的變異系數(shù) (cv)。

1.8 間接ELISA與HI的相關(guān)性試驗(yàn)

取200份臨床血清樣品，分別用HI和間接ELISA對其進(jìn)行檢測，HI試驗(yàn)血凝抑制效價(jià)大于24判定為陽性，間接ELISA OD450大于陽性臨界值判定為陽性。計(jì)算二者之間的符合率，并且根據(jù)每個(gè)樣品的血凝抑制效價(jià)及間接 ELISA的OD450值，得到二者之間的相關(guān)性公式。

2 結(jié)果與分析

2.1 包被抗原的原核表達(dá)及純化

2.1.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR及酶切鑒定。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在731 bp處出現(xiàn)特異性片段的為陽性克隆 (圖1A)。將陽性克隆的質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在5 900 bp及731 bp左右有特異性條帶 (圖1B)，與預(yù)期的結(jié)果相符。測序結(jié)果表明，目的基因序列正確，且未發(fā)生堿基突變，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.1.2 重組蛋白的表達(dá)、純化與復(fù)性

重組表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，取全菌超聲破碎后的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，重組蛋白主要以包涵體的形式存在。將包涵體進(jìn)行洗滌、Ni柱親和層析及分子篩純化后，再進(jìn)行復(fù)性，得到純度極高的目的蛋白 (圖2A)。用H9N2亞型禽流感病毒陽性血清作為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG作為二抗進(jìn)行Western blotting，結(jié)果顯示，目的蛋白可以與禽流感病毒 H9N2亞型禽流感病毒陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖 2B)。

2.2 間接ELISA方法的建立

2.2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)得到的陽性血清和陰性血清OD450值及P/N值可以得出最適抗原包被濃度為200 ng/孔，最佳血清稀釋倍數(shù)為1∶80 (圖3A)，最適封閉液為復(fù)合封閉液 (圖3C)，最適封閉時(shí)間為2 h(圖3E)，最佳抗體稀釋液為復(fù)合抗體稀釋液 (圖3D)，酶標(biāo)二抗按1∶10 000稀釋時(shí)效果最好 (圖3B) 且最適的酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間為1 h (圖3F)。

圖1 菌落PCR及重組表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果Fig. 1 The results of colony PCR and restriction enzyme digestion. (A) Colony PCR. M: DNA marker; 1:negative control; 2: PCR products. (B) Recombinant plasmid digested by restriction endonucleases. M: DNA marker; 1: negative control; 2: digested products.

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果Fig. 2 SDS-PAGE and Western blotting analysis of the recombinant protein. (A) SDS-PAGE analysis. M: protein marker; 1: expressed products before IPTG induction; 2:expressed products after IPTG induction; 3: supernatant after lysis; 4: precipitation after lysis; 5: purified recombinant protein by nickel column; 6: purified recombinant protein by molecular sieve. (B) Western blotting analysis. M: protein marker; 1: purified protein.

2.2.2 ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

用建立的 ELISA方法對 30份 HI檢測為AIV陰性的樣品血清進(jìn)行檢測，平均值為0.144，標(biāo)準(zhǔn)差為0.048 (表1)。當(dāng)OD450≥+3s時(shí)，判定為陽性，OD450＜+2s判定為陰性。根據(jù)以上公式可以確定，當(dāng) OD450≥0.289時(shí)判定為陽性，OD450＜0.240時(shí)判定為陰性，介于二者之間則判定為可疑。

2.3 間接ELISA的特異性

將H3N2、H5N2、H7N9亞型AIV陽性血清以及NDV、IBV、IBDV和EDSV的陽性血清，按已經(jīng)優(yōu)化的間接 ELISA進(jìn)行檢測，同時(shí)設(shè)立陽性對照和陰性對照。結(jié)果顯示，H3、H5及H7亞型禽流感病毒及其他常見禽類病毒的陽性血清的OD450均小于陽性判定值0.289 (表2)，表明此間接 ELISA方法具有很好的特異性。

圖3 ELISA工作條件的優(yōu)化Fig. 3 Optimized working conditions of ELISA. (A) Concentration of antigen and dilution ratio of serum. (B)Dilution ratio of HRP-conjugated antibody. (C) Blocking reagent. (D) Antibody dilution. (E) Blocking time. (F)Action time of HRP-conjugated antibody.

表1 間接ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定Table 1 Determination of the cut off value of the indirect ELISA

表2 間接ELISA的特異性Table 2 Specificity of the indirect ELISA

2.4 間接ELISA的靈敏度

將20份陽性血清按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256和 1∶512稀釋，分別進(jìn)行 HI試驗(yàn)和間接ELISA試驗(yàn)，結(jié)果顯示HI試驗(yàn)陽性率分別為 60%、35%、0%、0%、0%和 0%，而間接ELISA試驗(yàn)的陽性率分別為100%、100%、100%、100%、40%和0% (表3)。由此可見，在同一稀釋度時(shí)，間接 ELISA試驗(yàn)的陽性檢出率高于HI試驗(yàn)，間接ELISA的靈敏度高于HI。

2.5 間接ELISA的重復(fù)性

2.5.1 間接ELISA的批內(nèi)重復(fù)性

用同一批次的重組蛋白包被的96孔酶標(biāo)板對不同血清樣品進(jìn)行測定，H9變異系數(shù)在1.720%-3.964%之間 (表4)，均小于10%，說明同一樣品在同一批試驗(yàn)中變異程度小，具有較好的批內(nèi)重復(fù)性。

2.5.2 間接ELISA的批間重復(fù)性

在 3個(gè)不同時(shí)間，用不同批次的重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板檢測5份陽性樣品血清及陰性血清，變異系數(shù)在3.031%-7.077%之間 (表5)，均小于 10%。說明同一樣品在不同批次的試驗(yàn)中變異程度較小，具有較好的批間重復(fù)性。

2.6 間接ELISA與HI的相關(guān)性

選擇常規(guī)的檢測方法 HI與本研究建立的間接ELISA診斷方法同步檢測200份臨床雞血清樣品，結(jié)果顯示二者符合率高達(dá)97% (表6)。

進(jìn)一步分析200份雞臨床血清樣品的HI及間接 ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究建立的間接ELISA與HI血凝抑制效價(jià)存在很高的相關(guān)性，y=2.931 6x+2.590 7，R2=0.981 1，其中 x為 OD450值，y為HI效價(jià)取2的對數(shù)后的值 (圖4)。

表3 間接ELISA的靈敏度Table 3 Sensitivity of the indirect ELISA

表4 間接ELISA的批內(nèi)重復(fù)性Table 4 Intro-assay reproducibility of the indirect ELISA

表5 間接ELISA的批間重復(fù)性Table 5 Inter-assay reproducibility of the indirect ELISA

表6 間接ELISA與HI的符合率Table 6 Agreement between the indirect ELISA and HI test

圖4 間接ELISA與HI的相關(guān)性Fig. 4 Correlation between the indirect ELISA and HI.The prediction equation is y=2.931 6x+2.590 7, R2=0.981 1,wherex is the OD450value. and y is the logarithm of HI titer to the base 2 of an individual serum sample.

3 討論

H9亞型禽流感病毒雖然屬于低致病性流感病毒，但因其暴發(fā)給養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失卻不容小覷，H9亞型禽流感的防治問題一直是全球關(guān)注的難題。H9亞型流感病毒感染禽類后，雖然不會(huì)引起大規(guī)模死亡，但可引起輕度的呼吸道感染及產(chǎn)蛋率下降，且會(huì)破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致家禽法氏囊淋巴濾泡數(shù)量減少、胸腺萎縮退化和骨髓細(xì)胞的變性和壞死，造成疫苗接種后的免疫抑制，免疫效果不理想。另外，H9亞型流感病毒的感染還會(huì)干擾其他疫苗的免疫效果，且易引起繼發(fā)感染，最后導(dǎo)致家禽免疫力下降，死亡率上升[9-11]。H9亞型流感病毒還可能跨種間感染人類，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧虏⌒郧萘鞲胁《綶16-17]，因此，H9亞型流感病毒的防控亟待解決。國內(nèi)目前對 H9N2禽流感的防控措施主要為使用疫苗免疫，這在一定程度上控制了疫情的發(fā)展，但是個(gè)別地區(qū)仍有 H9N2疫情的發(fā)生[18-21]，因此盡早掌握養(yǎng)殖動(dòng)物的抗體水平，能更好地防控H9亞型流感病毒的傳播和蔓延。

本研究建立的間接ELISA與HI試驗(yàn)的符合率高達(dá)97%，其靈敏度明顯高于HI試驗(yàn)，且特異性較好，不與其他亞型禽流感病毒陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，與臨床常見禽類疾病陽性血清也無交叉反應(yīng)。此方法還具有較好的批內(nèi)、批間重復(fù)性，能夠在保證準(zhǔn)確性及靈敏度的前提下節(jié)約大量的時(shí)間，更有利于大規(guī)模血清樣本抗體效價(jià)的定性及定量檢測。本研究建立的間接 ELISA方法利用原核表達(dá)的重組蛋白作為包被抗原，安全性較高，重組蛋白容易獲得，能夠大大降低生產(chǎn)成本，具有良好的臨床應(yīng)用潛力。

本研究選擇H9N2亞型流感病毒HA蛋白的頭部球狀區(qū)作為包被抗原來檢測血清中的抗體[22-23]。HA是構(gòu)成病毒囊膜纖突的主要蛋白之一，在病毒吸附及穿膜過程中起著重要的作用，也是流感病毒引起機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[24-25]。HA蛋白的頭部球狀區(qū)在不同亞型之間高度變異，是HA的主要抗原決定簇，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體或引起細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞(CTL) 反應(yīng)[26]，因此選擇該區(qū)域作為包被抗原將大大提高該間接ELISA的特異性，能夠區(qū)分H9亞型與其他亞型禽流感病毒。

在ELISA實(shí)驗(yàn)中，封閉液和抗體稀釋液的選擇對整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗起到了關(guān)鍵性的作用。本研究對封閉液及抗體稀釋液進(jìn)行了優(yōu)化，首次采用了特異性的復(fù)合封閉液和抗體稀釋液。該復(fù)合封閉液與抗體稀釋液與傳統(tǒng)單一成分的封閉液和抗體稀釋液相比，封閉效果更為特異、完全，能夠有效封閉非特異性顯色反應(yīng)，減少了因封閉不完全造成的假陽性。即使陰性血清稀釋倍數(shù)較低 (4倍)，經(jīng)該復(fù)合封閉液封閉后其OD450值仍低于0.1，優(yōu)于其他幾種傳統(tǒng)的單一封閉液。原因可能是該復(fù)合封閉液中含有山羊血清，而本ELISA方法中所用二抗為HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG，若包被抗原與二抗之間存在非特異性反應(yīng)，則反應(yīng)位點(diǎn)可被山羊血清提前封閉，避免了包被抗原中某些成分與二抗直接發(fā)生反應(yīng)造成的非特異性顯色。另外，在封閉液和抗體稀釋液中還添加了蔗糖，蔗糖能夠增強(qiáng)包被抗原的穩(wěn)定性。

本研究對 200份臨床雞血清樣品分別利用間接 ELISA和 HI方法進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)大部分HI效價(jià)相同的血清樣本在 ELISA試驗(yàn)中的OD450(相同稀釋倍數(shù)下) 值接近。進(jìn)一步對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整合，發(fā)現(xiàn)將HI效價(jià)取2的對數(shù)后的值與間接ELISA得到的OD450值呈線性相關(guān)，y=2.931 6x+2.590 7，R2=0.981 1，其中x為OD450值，y為HI效價(jià)取2的對數(shù)后的值。因此，用本方法可以根據(jù)ELISA得到的OD450值，初步估算其對應(yīng)的HI效價(jià)。

本研究建立的ELISA方法具有良好的臨床應(yīng)用前景，在后續(xù)的研究中，我們將采用該ELISA方法對大規(guī)模的臨床樣品 (例如：同一亞型的不同毒株的感染血清) 進(jìn)行檢測，將獲得的數(shù)據(jù)與HI結(jié)果比對，驗(yàn)證方法的可靠性。同時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，增強(qiáng)ELISA試劑盒的穩(wěn)定性，以期盡早獲得穩(wěn)定、靈敏、快速且便于臨床應(yīng)用的產(chǎn)品。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Establishment of a high sensitive indirect ELISA for detecting specific antibodies against H9 subtype avian influenza virus

Wei Zhang1,2, Lidan Hou3, Jie Song1,2, Shuang Zhang1, Yun Li1, Jing Li1, Lei Sun1,2,Wenhui Fan1, and Wenjun Liu1,2

1 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081, China

H9 subtype avian influenza virus causes worldwide epidemic, resulting in enormous economic losses of poultry production. In the present study, an indirect ELISA method was established for more accurate and specific detection.The recombinant protein of the globular head domain of HA of H9 subtype avian influenza virus was used as antigen.Specific blocking buffers and dilution buffers were determined to increase the sensitivity and specificity. The sensitivity of ELISA was higher than that of hemagglutination inhibition (HI) test. The coating antigen is very specific and no cross-reactivity with positive serum against H3N2, H5N2 and H7N9 subtype influenza viruses, Newcastle disease virus,avian infectious bronchitis virus, avian infectious disease virus, and egg drop syndrome virus. Two hundred of clinical sera samples were examined. The results indicate the coincidence rate between ELISA and HI test reached 97%. In addition,there was a positive correlation between OD450values and the logarithm of HI titer to the base 2 of an individual serum sample (R2=0.981 1).

H9 subtype, avian influenza virus, hemagglutinin, indirect ELISA, hemagglutination inhibition test

December 16, 2016; Accepted: February 13, 2017

s：Wenhui Fan. Tel: +86-10-64807503; E-mail: fanwenhui78@aliyun.com Wenjun Liu. Tel: +86-10-64807497; E-mail: liuwj@im.ac.cn

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時(shí)間：2017-02-20

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