陳姝承，孫慧敏，李素，劉平黃，馬吉飛，仇華吉

1 天津農(nóng)學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384 2 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069

針對豬瘟病毒E2蛋白的嵌合豬源化單克隆抗體的表達及抗病毒活性鑒定

陳姝承1,2，孫慧敏2，李素2，劉平黃2，馬吉飛1，仇華吉1,2

1 天津農(nóng)學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384 2 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069

陳姝承, 孫慧敏, 李素, 等. 針對豬瘟病毒E2蛋白的嵌合豬源化單克隆抗體的表達及抗病毒活性鑒定. 生物工程學報,2017, 33(8): 1235–1243.

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豬瘟 (Classical swine fever，CSF) 是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種烈性傳染病，常造成巨大的經(jīng)濟損失，是世界動物衛(wèi)生組織要求必須申報的動物疫病之一。豬瘟的病原是豬瘟病毒 (Classical swine fever virus，CSFV)，CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白由衣殼蛋白 (C) 和囊膜糖蛋白 (Erns、E1、E2) 構(gòu)成。E2蛋白是CSFV主要的保護性抗原，可以誘導機體產(chǎn)生中和抗體，從而抵抗CSFV的感染。此前，本團隊制備了一株針對CSFV E2蛋白的鼠源單克隆抗體HQ06。文中將HQ06抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因與豬源恒定區(qū)基因嵌合后克隆至真核表達載體，利用中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞制備一株針對 CSFV E2蛋白的嵌合豬源化單克隆抗體 cHQ06。應(yīng)用ELISA、Western blotting試驗證實了cHQ06與CSFV E2蛋白具有良好的反應(yīng)性；中和試驗結(jié)果表明cHQ06可以中和CSFV。綜上所述，本研究應(yīng)用CHO細胞穩(wěn)定表達了具有良好反應(yīng)性和中和活性的針對CSFV E2蛋白的嵌合豬源化單克隆抗體cHQ06，為研究CSFV E2蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及開發(fā)新型的CSFV診斷和治療制劑奠定基礎(chǔ)。

豬瘟病毒，單克隆抗體，基因工程抗體，嵌合表達，懸浮培養(yǎng)

豬瘟 (Classical swine fever，CSF) 是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種烈性傳染病，常造成巨大的經(jīng)濟損失，該病被世界動物衛(wèi)生組織 (OIE) 列為必須申報的一類動物疫病[1]。CSF的病原是豬瘟病毒 (Classical swine fever virus，CSFV)，CSFV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長約 12.3 kb，是黃病毒科瘟病毒屬的成員[2]。該基因組僅編碼一個大的開放閱讀框，其編碼一個由3 898個氨基酸組成的多聚蛋白。該多聚蛋白被宿主細胞編碼的信號肽酶和自身編碼的蛋白酶Npro、NS2及NS3切割為4種結(jié)構(gòu)蛋白 (C和Erns、E1、E2) 及8種非結(jié)構(gòu)蛋白 (Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B)[3-4]。

衣殼蛋白C和糖蛋白Erns、E1、E2是CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白[5]。E2為Ⅰ型跨膜蛋白，其氨基端為胞外區(qū)，羧基端為跨膜區(qū)，將E2蛋白錨定在囊膜上[6]。E2蛋白在病毒生命周期中有重要作用，影響病毒吸附[7]、組織嗜性[8]和病毒毒力[9]。此外，E2是CSFV的主要保護性抗原蛋白，誘導機體產(chǎn)生中和抗體來抵抗病毒的感染[10]。E2蛋白在氨基端有B、C、D、A四個抗原結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成兩個獨立的抗原區(qū)，按B/C和A/D的順序排列 (aa 690–800 和 766–865)[11-13]。

E2蛋白的抗原特性已經(jīng)被許多單克隆抗體所鑒定[14-16]。在本實驗室前期的工作中，我們制備了一株鼠源E2蛋白單克隆抗體HQ06，它可以特異性識別CSFV C株和石門株E2蛋白的線性表位，該單克隆抗體重鏈為免疫球蛋白 G(IgG) 1型、輕鏈為к型[17]。

為了克服產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞不穩(wěn)定且抗性易丟失等問題，在本研究中，我們利用單細胞克隆技術(shù)獲得HQ06重鏈 (HC)、輕鏈 (LC) 的基因，將其與豬源抗體恒定區(qū)基因相融合，克隆至真核表達載體，并在CHO細胞上穩(wěn)定、高效表達針對CSFV E2蛋白的嵌合豬源化單克隆抗體 (cHQ06)。通過檢測實驗證實cHQ06與CSFV E2蛋白具有良好的反應(yīng)活性。而且，通過中和試驗證實其可以抑制CSFV的感染。因此，本研究證明，針對CSFV E2蛋白的嵌合豬源化單克隆抗體cHQ06可以穩(wěn)定、高效表達，為研究 CSFV E2蛋白結(jié)構(gòu)、功能以及開發(fā)新型的 CSFV診斷和治療制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和質(zhì)粒

人胚腎細胞 (HEK293T)、豬腎細胞 (PK-15)購自美國標準菌種收藏中心；中國倉鼠卵巢細胞 (CHO) 購于中國科學院細胞庫。懸浮HEK293細胞由哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司提供。CSFV石門株在PK-15細胞中傳代并用Reed-Muench公式計算病毒滴度[18]。慢病毒載體pFUGW及輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G由 Addgene提供。表達抗體重鏈和輕鏈的真核表達質(zhì)粒pcDNA-HC和pcDNA-LC由哈爾濱獸醫(yī)研究所豬烈性傳染病創(chuàng)新團隊保存。

1.2 主要試劑

Prime STAR?HS DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、DNA 上樣緩沖液等購自TaKaRa公司；目的質(zhì)粒特異性引物由博仕生物公司合成。HiTrap Protein A HP預裝柱 (5 mL) 購于GE Healthcare公司；分子量為10 kDa的超濾管購于Merck公司。辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的兔抗豬免疫球蛋白 G(IgG) H&L (Abcam 公司)；鼠抗豬 IgG (BD Pharmingen公司)；HRP標記的山羊抗鼠的IgG、3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB) 底物、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)、伊文斯藍 (Evans blue)、異硫氰酸熒光素 (FITC) 標記的 IgG均購于Sigma-Aldrich公司。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pcDNA-HC和pcDNA-LC質(zhì)粒為模板，擴增cHQ06重鏈 (HC) 和輕鏈 (LC) 基因。瓊脂糖凝膠電泳鑒定核酸分子量正確后，將目的條帶膠回收并于37 ℃酶切4 h，將其與同樣酶切后的pFUGW質(zhì)粒載體于16 ℃連接8 h，制備重組質(zhì)粒pFUGW-HC和pFUGW-LC。引物序列見表1。

1.4 共表達 cHQ06抗體重鏈和輕鏈的細胞系的構(gòu)建

將質(zhì)粒pFUGW-HC和pFUGW-LC以及輔助質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，制備表達抗體HC和LC的慢病毒。將重組慢病毒按照感染復數(shù) (MOI) 為 10感染CHO細胞。48 h之后對細胞計數(shù)，應(yīng)用有限稀釋法篩選單細胞克隆，收取其上清用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗 (DAS-ELISA) 進行檢測，通過檢測結(jié)果篩選出cHQ06抗體細胞系。

表1 cHQ06-HC和cHQ06-LC特異性引物序列Table 1 Specific primer sequences for amplifying cHQ06-HC and cHQ06-LC

1.5 cHQ06的表達和純化

收集CHO-cHQ06細胞系培養(yǎng)上清，使用制備型液相層析系統(tǒng) ?KTA explorer 對抗體進行純化。蛋白洗脫后應(yīng)用非還原性8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 檢測抗體組裝，并應(yīng)用Western blotting等方法分析cHQ06的組裝以及與兔抗豬IgG的反應(yīng)性。

1.6 DAS-ELISA

將純化的鼠抗豬IgG經(jīng)1∶250稀釋，在4 ℃條件下，以每孔100 μL包被ELISA板12 h。包被完成后，每孔加入150 μL PBST清洗1次，然后將含有5% FBS的5%脫脂乳加入到ELISA孔板中，每孔100 μL，37 ℃作用2 h。將純化的cHQ06經(jīng)2倍系列稀釋加入到孔板中，于37 ℃作用1 h后，棄掉抗體，用PBST洗滌3次。將板子中的 PBST吸干，加入用辣根過氧化物酶(HRP) 標記的兔抗豬 IgG H&L (1∶4 000)，于37 ℃繼續(xù)孵育1 h。應(yīng)用PBST洗滌3次后加入TMB底物顯色，15 min后加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，最后應(yīng)用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度。

1.7 應(yīng)用間接ELISA檢測cHQ06與 CSFV E2蛋白的反應(yīng)活性

分別應(yīng)用BHK-21細胞表達的CSFV石門株E2蛋白、懸浮HEK293細胞表達的C株E2蛋白或純化的CSFV 石門株包被ELISA板，每孔包被4 ng。在4 ℃放置12 h，然后用5%脫脂乳于37 ℃封閉2 h。將純化的cHQ06經(jīng)2倍系列稀釋加入孔板中，于37 ℃孵育1 h。應(yīng)用PBST洗滌3次，加入用HRP標記的兔抗豬IgG H&L(1∶4 000)，于37 ℃孵育1 h，TMB底物顯色后應(yīng)用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度。

1.8 應(yīng)用 Western blotting檢測 cHQ06與CSFV E2蛋白反應(yīng)活性

將BHK-21細胞表達的CSFV石門株E2蛋白和懸浮的HEK293細胞表達的C株E2蛋白進行SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素 (NC)膜后，用5%脫脂乳于室溫孵育2 h。應(yīng)用PBS洗滌1次后，將NC膜放至HQ06腹水 (1∶1 000)及純化的cHQ06中，室溫孵育1.5 h。用PBST洗滌 5次，每次 5 min，洗滌完畢后，分別于HRP標記的山羊抗鼠 (1∶1 000)、兔抗豬 IgG(1∶2 500) 中室溫孵育1 h。應(yīng)用PBST洗滌后，使用多功能熒光化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)進行掃描，保存灰白圖。

1.9 病毒中和試驗

將純化的cHQ06抗體2倍系列稀釋，做6個稀釋梯度和4個重復，與每孔中100 TCID50的CSFV石門株等體積混合，于37 ℃溫箱中孵育2 h。應(yīng)用冷無水乙醇于-20 ℃冰箱中固定細胞15 min，然后將CSFV陽性血清1∶100稀釋，加入每孔，于37 ℃孵育2 h后，應(yīng)用PBS洗滌5次，每次5 min。洗滌結(jié)束后加入1∶100稀釋的FITC標記的IgG和1∶1 000稀釋的伊文斯藍，放入37 ℃溫箱，孵育1 h。孵育結(jié)束應(yīng)用PBST清洗5次，再加入1∶1 000稀釋的DAPI將細胞核染色，37 ℃放置10 min，用PBS清洗5次后，應(yīng)用熒光顯微鏡分析抗體中和效價。

1.10 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件分析所有的數(shù)據(jù)。誤差線表示圖中所有平均值()的標準偏差(s)。

2 結(jié)果與分析

2.1 cHQ06重鏈、輕鏈重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pcDNA-HC和pcDNA-LC為模板，分別應(yīng)用特異性引物分別擴增 cHQ06-HC、LC目的基因，如圖1A所示，重鏈大小為1 500 bp，輕鏈大小為 750 bp，表明目的片段已被成功克隆。重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后在1 500 bp和750 bp處出現(xiàn)特異條帶，測序結(jié)果顯示，其與目標序列一致。結(jié)果表明，質(zhì)粒pFUGW-HC和pFUGW-LC構(gòu)建成功 (圖1B)。

2.2 過表達cHQ06細胞系的篩選

將轉(zhuǎn)導后的細胞接種于96孔板中，應(yīng)用有限稀釋法篩選單克隆細胞，顯微鏡下共觀察到有26株單克隆細胞，收取其上清，應(yīng)用雙抗體夾心ELISA檢測抗體與兔抗豬IgG的反應(yīng)性。檢測結(jié)果表明，6號、21號和25號細胞克隆的培養(yǎng)上清與兔抗豬的 IgG反應(yīng)性較強，有可能為陽性細胞 (圖2A)。將這3株細胞擴大培養(yǎng)，收取上清進行純化，雙抗體夾心ELISA檢測結(jié)果顯示，6號細胞克隆的培養(yǎng)上清與兔抗豬 IgG反應(yīng)性最好，且呈劑量依賴性 (圖 2B)。

2.3 cHQ06豬源抗體活性的檢測

將純化后的6號細胞克隆的培養(yǎng)上清 (濃度為1 mg/mL) 進行非還原性的SDS-PAGE分析，結(jié)果表明 cHQ06抗體可成功組裝成為 160 kDa大小的蛋白，與豬源抗體蛋白的分子量一致 (圖3A)。為了進一步證明cHQ06抗體是否是豬源化抗體，我們應(yīng)用 8%非還原性 SDS-PAGE進行Western blotting試驗，在160 kDa處檢測到抗體蛋白，這表明，cHQ06可以和抗豬IgG抗體反應(yīng)(圖3B)。以上結(jié)果證明，cHQ06抗體成功組裝，并且可被兔抗豬 IgG識別，已成功獲得豬源化的E2蛋白單克隆抗體。

圖1 重組質(zhì)粒pFUGW-HC和pFUGW-LC的構(gòu)建Fig. 1 Construction of recombinant plasmids pFUGW-HC and pFUGW-LC. (A) Amplification results of cHQ06 heavy chain and light chain by RT-PCR; 1–3: the gene of HC and LC; 4: negative control. (B) Identification of plasmids pFUGW-HC and pFUGW-LC; 1: pFUGW-HC; 2: pFUGW-LC; 3: pFUGW.

圖2 cHQ06細胞系的篩選Fig. 2 Screening of cHQ06 cell line. (A) Screening of positive cell clones of cHQ06 using double-antibody sandwich ELISA. (B) Reactivity of different cell clones of cHQ06 with rabbit anti-pig IgG in a dose-dependent manner.

圖3 cHQ06豬源抗體活性的檢測Fig. 3 Activity measurement of porcinized antibody cHQ06. (A) The generation of cHQ06 was examined using SDS-PAGE. (B) The reactivity of cHQ06 and rabbit anti-pig IgG was examined using Western blotting.

2.4 cHQ06反應(yīng)性的鑒定

應(yīng)用間接 ELISA和 Western blotting驗證cHQ06抗體和 CSFV E2蛋白的反應(yīng)性。間接ELISA結(jié)果表明，cHQ06抗體與不同表達系統(tǒng)表達的E2蛋白均具有良好的反應(yīng)性，并且呈劑量依賴性 (圖 4A)。為了進一步證明 cHQ06抗體的特異性，應(yīng)用 Western blotting試驗檢測CSFV C株和石門株E2蛋白與cHQ06抗體的反應(yīng)性，并用鼠源HQ06 (濃度為1 mg/mL) 作為陽性對照。結(jié)果表明，cHQ06抗體識別CSFV E2蛋白的能力強于親本抗體HQ06 (圖4B)，綜上所述，cHQ06抗體與CSFV E2蛋白有良好的反應(yīng)性。

2.5 cHQ06抗體對豬瘟病毒的中和作用

HQ06可以識別 CSFV E2蛋白表面的772LFDGTNP778表位[19]。為了鑒別 cHQ06是否具有中和病毒的能力，將CSFV以100 TCID50與等體積的2倍系列稀釋cHQ06抗體進行孵育，然后感染PK-15細胞，48 h后進行間接免疫熒光試驗 (IFA)。結(jié)果顯示，在 1∶2、1∶4和 1∶8的cHQ06稀釋孔中，未檢測到CSFV的特異性熒光灶，且在1∶16的cHQ06稀釋孔中，只檢測到少量熒光灶，這表明，cHQ06中和效價為1∶12 (圖5)。

圖4 cHQ06抗體的反應(yīng)性檢測Fig. 4 Detection of the reactivity of cHQ06 with the CSFV E2 protein. (A) Indirect ELISA. (B) Western blotting.

圖5 用中和試驗檢測cHQ06抗體對CSFV的中和作用Fig. 5 Neutralizing activity of cHQ06 against CSFV infection determined by neutralization test. Scale bars represent 400 μm.

3 討論

在蛋白純化方面，我們使用制備型液相層析系統(tǒng)?KTA explorer純化抗體蛋白，現(xiàn)已有很多應(yīng)用?KTA純化蛋白的報道[24-25]。傳統(tǒng)的蛋白純化方法費時、費力，且蛋白容易降解，洗脫效果不佳。?KTA explorer相比于傳統(tǒng)純化蛋白的方法更高效，可在短時間內(nèi)，在大量流入樣品的情況下，根據(jù)紫外峰值快速精準地收取純化的目的蛋白，最大程度地避免抗體蛋白的降解。

在中和試驗中，我們應(yīng)用 IFA進行檢測，確定了該抗體的中和效價。試驗方法參考了歐盟豬瘟診斷標準操作手冊，該抗體在 1 mg/mL濃度下的中和效價為1∶12，中和效價不高，可能是由于單克隆抗體只能識別一個抗原表位，所以中和效價偏低。

我們已經(jīng)證實了該抗體的反應(yīng)性和抑制病毒復制的能力，并且有較好的親和力。因此，cHQ06在檢測方面的應(yīng)用具有很高的研究價值。在下一步研究中，我們計劃應(yīng)用cHQ06抗體建立競爭ELISA檢測方法，為開發(fā)新型CSFV抗體檢測試劑奠定基礎(chǔ)。

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在知識經(jīng)濟時代，教育是實現(xiàn)社會主義現(xiàn)代化的基礎(chǔ)，肩負著提高勞動者素質(zhì)和培養(yǎng)專門人才的重要任務(wù)。在鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略中，師生首先要對鄉(xiāng)村振興的地位與作用、意義與內(nèi)涵有較深的認識與了解；第二要有吃苦的工作精神和踏實的干勁；第三要有良好的理論水平和自覺的動手能力；第四要具有與鄉(xiāng)村干部和廣大農(nóng)民進行溝通的能力；第五要有團隊精神。只有這五點做到了，才能做好做實鄉(xiāng)村振興中的事情，而這正是同學們綜合素質(zhì)的體現(xiàn)。

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(本文責編 陳宏宇)

Expression and antiviral activity of a chimeric porcinized monoclonal antibody (cHQ06) against E2 protein of classical swine fever virus

Shucheng Chen1,2, Huimin Sun2, Su Li2, Pinghuang Liu2, Jifei Ma1, and Huaji Qiu1,2

1 College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China 2 Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Harbin 150069, Heilongjiang, China

Classical swine fever (CSF), one of OIE-listed diseases, is a highly contagious and economically important disease of pigs. Classical swine fever virus (CSFV) is the causative agent of CSF. The capsid (C) protein and the glycoproteins Erns, E1 and E2, are structural components of the virus. E2 is the most immunogenic protein of the CSFV glycoproteins, inducing neutralizing antibodies that provide protection against lethal CSFV challenge. In a previous study,we developed a murine MAb HQ06 against the E2 protein of CSFV. In this study, the variable region genes from HQ06 and constant regions gene of swine antibody are fused and cloned into the eukaryotic expression vectors to establish a cell line which can stably express a chimeric porcinized MAb (cHQ06) against E2 in CHO cell. The purified cHQ06 antibody protein was determined to be successfully generated, which exhibited high reactivity between cHQ06 and the E2 protein of CSFV by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blotting. More importantly, we investigated the neutralizing activity of cHQ06 against CSFV. In conclusion, this study generated cHQ06 for efficient and stable production which can be used against to develop novel diagnostic assays, investigate the structure and function of the E2 protein and generate novel preparations of diagnosis and treatment.

classical swine fever virus, monoclonal antibody, genetic engineering antibody, chimeric expression, suspension culture

June 24, 2017; Accepted: July 25, 2017

s：Huaji Qiu. Tel/Fax: +86-451-51051708; E-mail: huajiqiu@hvri.ac.cn Jifei Ma. Tel: +86-22-23784590; E-mail: hbmjfts@126.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31672537).

國家自然科學基金(No. 31672537) 資助。