周文君，郭日紅，鄧明田，王鋒，張艷麗

南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 江蘇省家畜胚胎工程實驗室，江蘇 南京 210095

RS-1提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的人乳鐵蛋白基因敲入效率

周文君，郭日紅，鄧明田，王鋒，張艷麗

南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 江蘇省家畜胚胎工程實驗室，江蘇 南京 210095

周文君, 郭日紅, 鄧明田, 等. RS-1提高 CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的人乳鐵蛋白基因敲入效率. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(8):1224-1234.

Zhou WJ, Guo RH, Deng MT, et al. RS-1 enhanced the efficiency of CRISPR-Cas9 mediated knock-in of human lactoferrin. Chin J Biotech, 2017, 33(8): 1224-1234.

嘗試?yán)肅RISPR-Cas9系統(tǒng)敲除山羊基因組中β-乳球蛋白 (BLG) 基因，以實現(xiàn)在BLG基因座敲入人乳鐵蛋白 (hLF) 基因，并進(jìn)一步探討了不同濃度RAD51蛋白激活劑 (RS-1) 對同源重組效率的影響。首先針對山羊BLG的第一外顯子設(shè)計并構(gòu)建了sgRNA和Cas9共表達(dá)載體pCas9-sgBLG，將該載體轉(zhuǎn)染至山羊耳成纖維細(xì)胞，利用 PCR和 T7EN1法驗證了其基因組編輯活性；然后進(jìn)一步構(gòu)建了 BLG基因打靶載體pBHA-hLF-NIE (包含NEO/EGFP)；將該打靶載體與pCas9-sgBLG載體共轉(zhuǎn)染至山羊耳成纖維細(xì)胞，分別用0、5、10和20 μmol/L RS-1處理細(xì)胞，分析了綠色熒光蛋白的表達(dá)效率；同時用800 μg/mL G418對不同濃度RS-1處理后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，挑取EGFP陽性細(xì)胞克隆，進(jìn)一步通過PCR和測序鑒定hLF定點敲入的陽性細(xì)胞克隆。結(jié)果顯示：設(shè)計的sgRNA編輯山羊BLG位點的效率為25%-31%；報告基因的表達(dá)效率提示RS-1可以促進(jìn)基因敲入效率的提高，其效率與RS-1濃度呈正相關(guān)，20 μmol/L RS-1處理組的效率是對照組的3.5倍；利用G418篩選hLF敲入陽性細(xì)胞克隆后，當(dāng)RS-1濃度為0-10 μmol/L時，hLF敲入效率隨著RS-1濃度增加而升高，在10 μmol/L時陽性克隆率最高為32.61%，然而在20 μmol/L時敲入陽性克隆率下降至22.22%，且衰老細(xì)胞克隆增多。以上結(jié)果表明，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以實現(xiàn)在山羊耳成纖維細(xì)胞中敲除BLG基因和敲入hLF基因，且適宜濃度的RS-1可以顯著提升基因敲入效率，本試驗為高效利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)獲得基因敲入的細(xì)胞提供了參考依據(jù)。

CRISPR-Cas9，RS-1，β-乳球蛋白，同源重組，人乳鐵蛋白，山羊耳成纖維細(xì)胞

基因編輯技術(shù)現(xiàn)已成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中最熱門的技術(shù)之一，其中的串聯(lián)間隔重復(fù)序列 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/相關(guān)蛋白 9 (Cas9)系統(tǒng)[1]被眾多研究者用于基因組定點編輯等多種用途，被Science雜志評為2015年十大科學(xué)突破之首。其中，CRISPR-Cas9系統(tǒng)首先被發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌和古細(xì)菌的Ⅱ型 CRISPR/Cas系統(tǒng)中，其作為“獲得性免疫系統(tǒng)”可以抵御外來病毒入侵[2]，現(xiàn)被應(yīng)用于真核生物細(xì)胞和個體的基因編輯[3-5]。由sgRNA引導(dǎo)的Cas9核酸內(nèi)切酶可以在基因組中引入雙鏈斷裂 (Double-stranded break，DSB)，其可以通過非同源末端連接 (Nonhomologous end joining，NHEJ) 和同源修復(fù) (Homology-directed repair，HDR) 兩種途徑修復(fù)[6-7]。利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)和同源重組模板可以高效敲入外源基因，因此該系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因動物細(xì)胞和個體的研究與生產(chǎn)中[8-10]。

羊乳，作為牛乳的一種替代品，有著較之前者更高的乳脂和蛋白含量。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG) 是羊乳中主要的乳清蛋白，也是羊乳中引起人體過敏反應(yīng)的主要過敏原之一[11]。酶水解、加熱并不能減少BLG蛋白過敏原性，反而會增加人體的過敏反應(yīng)，發(fā)酵工藝由于會產(chǎn)生新的副產(chǎn)物，也無法有效減少其過敏原性[12-13]。人乳鐵蛋白 (Human lactoferrin,hLF) 是一種多功能糖蛋白，具有促進(jìn)鐵吸收、抗菌、抗病毒、抗癌和抗氧化等多種生物學(xué)功能，是一種十分理想的食物添加劑和藥物[14-16]。在山羊BLG基因座中敲入hLF基因既可以去除山羊乳中的過敏原，又能增加羊乳中的營養(yǎng)成分，使其更加“人源化”。然而目前利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除山羊BLG基因、同時定點整合hLF基因的相關(guān)研究鮮見報道。

研究表明，RAD5l是有絲分裂細(xì)胞中催化DNA同源重組修復(fù)過程中同源配對的唯一蛋白因子，其通過介導(dǎo)DNA鏈配對和鏈交換而參與了DNA同源重組修復(fù)[17]。RAD51蛋白激活劑(RAD51 stimulatory compound，RS-1) 可激活RAD51蛋白活性且使得RAD51蛋白與DNA的結(jié)合更加穩(wěn)定[18]，可讓同源重組的效率提升至3倍，然而過高濃度的RS-1具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[19]。目前關(guān)于 RS-1在山羊體細(xì)胞中提高基因編輯效率的研究未見報道。

因此，本試驗嘗試?yán)肅RIPSR-Cas9技術(shù)在山羊BLG位點精確敲入hLF，同時還探討了不同濃度RS-1對CRISPR-Cas9介導(dǎo)山羊基因組敲入效率的影響，為今后高效利用 CRIPSR-Cas9技術(shù)獲得基因編輯動物提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞

pX330質(zhì)粒 (Addgene，#42230) 由本實驗室留存；pMD-19T克隆載體購自TaKaRa公司；pHA-hLF包括hLF cDNA序列；pBC-hLF包含NEO基因和EGFP基因，宿主菌為埃希氏大腸桿菌 DH5α，60日齡雌性羔羊耳成纖維細(xì)胞，均由本實驗室保存。

1.1.2 引物

本試驗中所使用到的引物通過 NCBI的Primer Blast在線設(shè)計，引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司和南京擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定用引物Table 1 Primers for plasmid construction and detection

1.1.3 主要試劑

FBS (Gibco，26140079)、DMEM (Gibco，11965092)、Trypsin (Gibco，25200056)、G418(Gibco，11811023) 和 NeonTM100 μL 轉(zhuǎn)染試劑盒購自Life Technology公司；各種限制性內(nèi)切酶、各種分子量marker、高保真PrimerStar DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶和pMD-19T載體購自寶生物工程 (大連) 有限公司；T4 DNA連接酶、熱敏堿性磷酸酶，BbsⅠ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；純化試劑盒購自Qiagen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；其他未說明試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA設(shè)計與 pCas9-sgBLG表達(dá)載體構(gòu)建

針對山羊 BLG 基因 (NCBI，Z33881.1，8 088 bp) 的第一外顯子區(qū)域設(shè)計sgRNA，根據(jù)張鋒實驗室在線軟件 (http://crispr.mit.edu/) 設(shè)計了引導(dǎo)序列長度為20 nt的sgRNA引導(dǎo)序列，靶標(biāo)位點序列為 GGCCCTCGCCTGTGGCATC CAGG 。然后通過酶切連接將引導(dǎo)序列連接至pX330構(gòu)建成pCas9-sgBLG表達(dá)載體。

1.2.2 pBHA-hLF-NIE打靶載體的構(gòu)建

1 558 bp 的 5′同源臂和 1 687 bp 的 3′同源臂分別擴(kuò)增自野生型山羊基因組 BLG基因(GenBank登錄號 Z33881.1) 505–2 062 bp和2 268–3 954 bp區(qū)域。在5′同源臂添加NheⅠ酶切位點，3′同源臂添加XhoⅠ和KpnⅠ酶切位點，分別將其連接至pMD-19T載體，得到pBHA-5′和 pBHA-3′。然后使用 KpnⅠ酶切 pBHA-5′和pBHA-3′載體，回收線性化的 pBHA-5′載體和 3′同源臂，通過T4 DNA連接酶將3′同源臂連接至線性化的 pBHA-5′載體中，構(gòu)建成 pBHA-5′-3′載體。CMV-NEO-IRES2-EGFP片段從pBC-hLF質(zhì)粒上擴(kuò)增后回收，兩端添加XhoⅠ酶切位點。hLF cDNA片段從pHA-hLF質(zhì)粒通過NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后回收得到。將3′BLG同源臂、hLF cDNA片段和NEO-IRES2-EGFP片段通過酶切連接依次連接至 pBHA-5′-3′載體，最終構(gòu)建成BLG基因的打靶載體pBHA-hLF-NIE。

1.2.3 CRISPR-Cas9編輯山羊 BLG位點活性檢測

解凍第 3代山羊耳成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)液為DMEM+10% FBS+1%谷氨酰胺，待匯合度達(dá)到80%–90%的時候，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將 pCas9-sgBLG表達(dá)載體與電轉(zhuǎn)溶液和細(xì)胞混合至終濃度為1 μg/105細(xì)胞，然后在 1.6 kV、10 ms、3 pulses的參數(shù)下進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，將5×105細(xì)胞接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞，提取DNA，通過PCR擴(kuò)增sgBLG靶標(biāo)區(qū)域，產(chǎn)物回收后進(jìn)行T7E1檢測和連接T載體測序。T7E1檢測采用400 ng PCR回收產(chǎn)物，退火后使用T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ處理0.5 h，產(chǎn)物通過2.5%的瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。引物分別為T7-BLG-F和T7-BLG-R。

1.2.4 RS-1對 CRISPR-Cas9引導(dǎo)的基因敲入效率的影響

為進(jìn)一步檢測 RS-1對基因敲入效率的影響，將酶消化后懸浮的山羊耳成纖維細(xì)胞(1×105) 與 pCas9-sgBLG 表達(dá)載體 (0.5 μg) 和pBHA-hLF-NIE打靶載體 (0.5 μg) 混合進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，電轉(zhuǎn)染方法參照 1.2.3中的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)在分別含有 0、5、10和20 μmol/L RS-1的培養(yǎng)液中72 h，一方面將利用R&D流式細(xì)胞儀對進(jìn)行綠色熒光細(xì)胞計數(shù)，統(tǒng)計綠色熒光細(xì)胞比例；另一方面在RS-1處理后添加G418 (800 μg/mL) 進(jìn)行篩選，每3天更換1次培養(yǎng)液，篩選培養(yǎng)至16-20 d后，挑取EGFP陽性克隆，然后繼續(xù)用含G418 (400 μg/mL)的完全培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。收集細(xì)胞，其中1/5繼續(xù)培養(yǎng)后凍存，剩余的4/5提取DNA并用于PCR擴(kuò)增打靶區(qū)域，所有PCR鑒定后的陽性產(chǎn)物回收后進(jìn)行TA克隆并測序。PCR中所使用引物為5KI-F/R和3KI-F/R，5KI-F和3KI-R分別位于山羊BLG基因42-59 bp和4 140-4 157 bp區(qū)域，5KI-R和3KI-F分別包括部分hLF基因和EGFP 基因 (圖 1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pBHA-hLF-NIE打靶載體的構(gòu)建

將hLF cDNA片段和NEO-IRES2-EGFP片段連接至含有 5′和 3′同源臂的載體構(gòu)建成pBHA-hLF-NIE打靶載體，其結(jié)構(gòu)與打靶位置示意圖見圖1。

圖1 sgBLG靶標(biāo)位點和打靶載體示意圖Fig. 1 Scheme of sgRNA targeting BLG locus and targeting strategy. BLG: β-lactoglobulin; Ex 1: exon 1 of BLG;Ex 2: exon 2 of BLG; Ex 3: exon 3 of BLG; hLF: human lactoferrin cDNA; NEO: neomycin resistance gene; IRES:internal ribosome entry site; EGFP: enhanced green fluorescent protein; HA: homologous arm; PAM: protospacer adjacent motif. 5KI-F/R: primers used for 5′ junction PCR. 3KI-F/R: primers used for 3′ junction PCR.

2.2 Cas9在山羊耳成纖維細(xì)胞中活性檢驗

將構(gòu)建成功的pCas9-BLG電轉(zhuǎn)染至山羊耳成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72 h后收集細(xì)胞提取基因組DNA，然后使用引物T7-BLG-F/R擴(kuò)增得到622 bp的sgBLG基因組靶標(biāo)區(qū)域。PCR產(chǎn)物回收后分別進(jìn)行 T7E1檢測和連接 T載體測序。T7E1檢測結(jié)果表明，sgBLG靶標(biāo)區(qū)域存在插入和缺失等突變情況，測序結(jié)果顯示，sgBLG靶位點存在1-59 bp的缺失，提示sgBLG可以有效引導(dǎo)Cas9蛋白編輯山羊耳成纖維細(xì)胞BLG位點 (圖2)。進(jìn)一步對T7E1的酶切結(jié)果進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn) sgBLG引導(dǎo)的 Cas9編輯活性為25%-31%。

2.3 不同濃度RS-1對基因敲入效率的影響

將pCas9-sgBLG表達(dá)載體和pBHA-hLF-NIE打靶載體共轉(zhuǎn)染至山羊耳成纖維細(xì)胞，然后分別在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加 0、5、10和20 μmol/L的RS-1進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。為了減少非整合打靶載體表達(dá)的EGFP干擾，本研究將RS-1處理后的細(xì)胞傳4代后利用流式細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計綠色熒光細(xì)胞比例。結(jié)果表明，綠色熒光細(xì)胞的比例隨著RS-1濃度升高而增加，10 μmol/L和20 μmol/L RS-1處理組的綠色熒光陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組 (P＜0.05，圖 3C)。該結(jié)果表明，RS-1可以顯著提高山羊耳成纖維細(xì)胞中的外源基因敲入效率，且與濃度呈正相關(guān)。

圖2 在GEFs中檢測sgBLG編輯活性Fig. 2 Testing of sgBLG targeting activity by transfection of pCas9-sgBLG into GEFs. (A) T7E1 assay of sgBLG targeting activity. M: DNA marker. WT: wild-type. (B) Sequencing result of sgBLG target region. The sequence in blue indicates the guide sequence of sgBLG, and the sequence in red indicates the PAM.

圖3 RS-1對基因敲入效率的影響Fig. 3 Effect of RS-1 on knock-in efficiency. The goat ear fibroblasts were transfected with pCas9-sgBLG plasmid and pBHA-hLF-NIE and observed under microscopy in white field (A) and with FITC filter (B). (C) Analysis of effect of RS-1 on knock-in efficiency by flow cytometry. GFP-positive rates indicated the knock-in efficiency. The asterisk means a significant difference (P＜0.05) between two groups.

2.4 不同濃度RS-1對hLF敲入陽性細(xì)胞克隆率的影響

對共轉(zhuǎn)染后的山羊成纖維細(xì)胞分別進(jìn)行0、5、10和20 μmol/L RS-1處理后，進(jìn)一步添加G418篩選陽性細(xì)胞克隆，分別獲得EGFP陽性克隆 42、43、46和 27個。對獲得的陽性細(xì)胞進(jìn)行基因敲入效率檢測 (圖 4和表 2)，結(jié)果顯示，添加RS-1的處理組5′和3′端敲入陽性率均高于未添加的對照組，其中 10 μmol/L 濃度RS-1處理組的敲入效率最高，5′端連接陽性率從 16.67%提升至 36.69% (P＜0.05)，3′端連接陽性率從11.90%提升至32.61% (P＜0.05)。然而當(dāng)RS-1 濃度達(dá)到 20 μmol/L 時，5′和 3′端連接陽性率均出現(xiàn)下降，分別為 25.93% (P＞0.05) 和22.22% (P＞0.05)。另外，如表 2所示，本試驗中3′端連接PCR陽性克隆的5′端檢測結(jié)果均為陽性，因此以3′端連接PCR陽性克隆率來表示hLF定點敲入效率。測序結(jié)果進(jìn)一步表明，hLF基因已經(jīng)精確整合至山羊BLG基因座 (圖5)。此外，本研究中細(xì)胞經(jīng)過20 μmol/L RS-1處理后，死亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加，衰老細(xì)胞克隆數(shù)目顯著增多 (P＜0.05)。

圖4 部分PCR篩選hLF敲入陽性細(xì)胞克隆結(jié)果Fig. 4 Partial results of PCR screening for hLF knock-in clones. (A) Partial PCR amplification results of hLF knock-in clones using primer 5KI-F/R. KI: knock-in. (B) Partial PCR amplification results of hLF knock-in clones using primers 3KI-F/R. KI: knock-in.

表2 hLF敲入陽性細(xì)胞克隆PCR篩選結(jié)果Table 2 The result of screening hLF knock-in positive cell clones by PCR

圖5 部分5′與3′連接PCR陽性細(xì)胞克隆測序峰圖Fig. 5 Partial sequencing peak diagrams of 5′ and 3′ junction PCR positive clones.

3 討論

本試驗首次使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在山羊基因組BLG基因位點定點敲入hLF cDNA序列。同時本試驗還研究了不同濃度RS-1對Cas9引導(dǎo)的敲入效率的影響。目前利用靶向性的核酸酶基因編輯技術(shù)可以快速、高效地獲得基因編輯家畜。使用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除BLG和同時插入hLF，既可以減少山羊乳的過敏原性，又保障了其營養(yǎng)價值，從而使其更加“人源化”[20]。在早期的研究中，通過顯微注射和隨機(jī)插入等方法獲得轉(zhuǎn)基因家畜的效率相對較低，存在敲入位點不夠精確和拷貝數(shù)不確定等問題[21]。隨后，研究者嘗試使用長同源臂構(gòu)建打靶載體，可以通過同源重組獲得精確基因打靶細(xì)胞系或個體。2004年，孫麗新[22]在山羊乳腺 β-酪蛋白基因座定點插入hLF cDNA；Shen等[23]將人組織型纖溶酶原激活劑突變體 (ht-PAm) 基因插入至山羊胎兒成纖維細(xì)胞 β-酪蛋白基因座；張學(xué)明[24]將膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF) 基因插入至山羊胎兒成纖維細(xì)胞 β-酪蛋白基因座；孟立[25]在山羊乳腺上皮細(xì)胞的 β-酪蛋白基因座定點插入hLF cDNA，并且體外激素誘導(dǎo)獲得了hLF蛋白。胡林勇[26]在山羊耳成纖維細(xì)胞 BLG 基因位點插入 α-乳白蛋白(ALA)，并結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因后代。然而，以上方法依然存在著試驗周期長和整合效率低等問題。

近幾年，隨著基因編輯技術(shù)的飛速進(jìn)步，ZFN、TALENs和 CRISPR-Cas9已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究和轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)。由于CRISPR-Cas9技術(shù)較之ZFN和TALENs的便捷性和高效性[27]，現(xiàn)已經(jīng)成為最熱門的基因編輯技術(shù)之一，而且已經(jīng)被應(yīng)用于反芻動物的基因打靶研究中。Jeong等[28]使用 CRISPR-Cas9技術(shù)在牛β-酪蛋白基因位點插入人胰島素 (hINS)基因。同時文獻(xiàn)表明，Cas9較之TALENs有更高的編輯效率[29]，而且張鋒實驗室改良后的Cas9蛋白具有更高的特異性[30]。本試驗的陽性細(xì)胞克隆鑒定結(jié)果表明，未經(jīng)RS-1處理的對照組，陽性率達(dá)到16.67%，顯著高于傳統(tǒng)的打靶方法[31]。Cui等[32]使用 TALENs編輯山羊 BLG位點，效率為5%–13%；宋紹征等使用TALENs和 3種藥物連續(xù)篩選的方法提升編輯效率至17%，與本研究結(jié)果相近[33]。本試驗在體細(xì)胞中的實驗結(jié)果表明，非篩選條件下基因敲入效率最高可達(dá) 14%，藥物篩選后基因敲入效率可進(jìn)一步提升至32.61%，提示CRISPR-Cas9系統(tǒng)可能是一種優(yōu)于傳統(tǒng)同源重組的打靶方法，適用于家畜體細(xì)胞的基因打靶。

目前關(guān)于提高同源重組效率的研究表明，通過同步細(xì)胞周期，基因沉默和添加不同的化學(xué)物質(zhì)可以提升同源重組效率[34-37]。添加化學(xué)物質(zhì)法作為一種簡單便捷的方法被眾多研究者所采用，常見的化合物分為兩類：一類為NHEJ途徑中關(guān)鍵酶抑制劑，如SCR7[19,34-35]；另一種為HDR途徑中關(guān)鍵酶的激活劑，如RS-1[19,36]。研究報道，在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加SCR7可以提升CRISPR-Cas9引導(dǎo)的敲入效率，在人和小鼠細(xì)胞細(xì)胞系上可以提升至 4–5倍[34]，在小鼠胚胎上可以提高17%–30%[35]。但同時也有文獻(xiàn)表明，SCR7并不能顯著提高胚胎中CRISPR-Cas9引導(dǎo)的同源重組效率[36]。本試驗嘗試在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)基中添加不同濃度的RS-1，以探究其對同源重組效率的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，同源重組效率隨著RS-1濃度的升高而增加，在20 μmol/L時效率最高，約14%。Pinder等[19]在不同細(xì)胞系中使用RS-1來提升CRISPR-Cas9引導(dǎo)的敲入效率，其結(jié)果表明，RS-1濃度在0–20 μmol/L時，同源重組效率與濃度正相關(guān)，與本結(jié)果一致。

在陽性細(xì)胞克隆鑒定結(jié)果中，RS-1濃度在0–10 μmol/L時，hLF敲入陽性克隆率與RS-1濃度呈正相關(guān)。然而，當(dāng)RS-1濃度升高至20 μmol/L時，hLF敲入陽性克隆率下降至22.22%，與流式檢測結(jié)果相反。這可能是由于20 μmol/L RS-1對于山羊耳成纖維細(xì)胞有著較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致處理后的細(xì)胞在 G418篩選時的存活率下降。同時本試驗還觀察到，20 μmol/L RS-1處理組的細(xì)胞在RS-1處理72 h后貼壁數(shù)明顯少于對照組；此外20 μmol/L處理組獲得的細(xì)胞克隆數(shù)最少，這一現(xiàn)象與Pinder等[19]發(fā)現(xiàn)的RS-1的濃度≥10 μmol/L時會出現(xiàn)較強(qiáng)的細(xì)胞毒性的現(xiàn)象一致。因此，適宜濃度的 RS-1可以顯著提升CRISPR-Cas9介導(dǎo)的山羊基因組打靶效率，但RS-1濃度過高時會降低打靶效率。

總之，本試驗采用CRISPR-Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)了在山羊BLG位點定點敲入hLF基因。同時，本試驗還首次使用RS-1來促進(jìn)山羊耳成纖維細(xì)胞的同源重組效率，發(fā)現(xiàn)其在10 μmol/L時獲得的hLF敲入效率最高，但在20 μmol/L時具有較強(qiáng)細(xì)胞毒性，反而會降低hLF敲入效率。該研究為今后高效利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)獲得基因敲入的家畜提供了參考依據(jù)。

REFERENCES:

[1] Brouns SJJ, Jore MM, Lundgren M, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense inprokaryotes. Science, 2008, 321(5891): 960–964.

[2] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012,337(6096): 816–821.

[3] Cong L, Ran FA, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science,2013, 339(6121): 819–823.

[4] Wang HY, Yang H, Shivalila CS, et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.Cell, 2013, 153(4): 910–918.

[5] Guo RH, Wan YJ, Xu D, et al. Generation and evaluation of Myostatin knock-out rabbits and goats using CRISPR/Cas9 system. Sci Rep, 2016,6: 29855.

[6] Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet, 2010, 11(9): 636–646.

[7] Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 827–832.

[8] Wang XL, Yu HH, Lei AM, et al. Generation of gene-modified goats targeting MSTN and FGF5 via zygote injection of CRISPR/Cas9 system. Sci Rep, 2015, 5: 13878.

[9] Lv QY, Yuan L, Deng JC, et al. Efficient generation of myostatin gene mutated rabbit by CRISPR/Cas9. Sci Rep, 2016, 6: 25029.

[10] Platt RJ, Chen SD, Zhou Y, et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell, 2014, 159(2): 440–455.

[11] Sharma S, Kumar P, Betzel C, et al. Structure and function of proteins involved in milk allergies. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 2001, 756(1/2):183–187.

[12] Ehn BM, Allmere T, Telemo E, et al.Modification of IgE binding to β-lactoglobulin by fermentation and proteolysis of cow's milk. J Agr Food Chem, 2005, 53(9): 3743–3748.

[13] Ehn BM, Ekstrand B, Bengtsson U, et al.Modification of IgE binding during heat processing of the cow’s milk allergen β-lactoglobulin. J Agr Food Chem, 2004, 52(5):1398–1403.

[14] L?nnerdal B, Iyer S. Lactoferrin: molecular structure and biological function. Annu Rev Nutr,1995, 15: 93–110.

[15] González-Chávez SA, Arévalo-Gallegos S,Rascón-Cruz Q. Lactoferrin: structure, function and applications. Int J Antimicrob Ag, 2009,33(4): 301.e1–301.e8.

[16] van der Strate BWA, Beljaars L, Molema G, et al.Antiviral activities of lactoferrin. Antivir Res,2001, 52(3): 225–239.

[17] Baumann P, West SC. Role of the human RAD51 protein in homologous recombination and double-stranded-break repair. Trends Biochem Sci,1998, 23(7): 247–251.

[18] Jayathilaka K, Sheridan SD, Bold TD, et al. A Chemical compound that stimulates the human homologous recombination protein RAD51. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(41): 15848–15853.

[19] Pinder J, Salsman J, Dellaire G. Nuclear domain‘knock-in’ screen for the evaluation and identification of small molecule enhancers of CRISPR-based genome editing. Nucleic Acids Res, 2015, 43(19): 9379–9392.

[20] Sun BX, Hou WW, Ouyang HS. Transgenic animal bioreactor. Animal Sci Vet Med, 2000,17(3): 18–20 (in Chinese).孫博興, 侯萬文, 歐陽紅生. 轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器. 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué), 2000, 17(3): 18–20.

[21] Tan WF, Proudfoot C, Lillico SG, et al. Gene targeting, genome editing: from Dolly to editors.Transgenic Res, 2016, 25(3): 273–287.

[22] Sun LX. The production of gene-targeting at GEF β-casein gene locus with human lactoferrin gene and analysis of gene integrate site[D]. Shanghai:East China Normal University, 2004 (in Chinese).孫麗新. hLF基因打靶山羊胎兒成纖維細(xì)胞株的建立及其整合位點的分析[D]. 上海: 華東師范大學(xué), 2004.

[23] Shen W, Lan GC, Yang XY, et al. Targeting theexogenous htPAm gene on goat somatic cell beta-casein locus for transgenic goat production.Mol Reprod Dev, 2007, 74(4): 428–434.

[24] Zhang XM. Human gdnf gene knock-in at beta-casein locus in bovine fetal fibroblast cells and production of gene-targeted blastocysts by SCNT[D]. Hohhot: Inner Mongolia University,2009 (in Chinese).張學(xué)明. 人gdnf在牛胎兒成纖維細(xì)胞β-casein基因座的定位整合及基因打靶克隆囊胚的制備[D].呼和浩特: 內(nèi)蒙古大學(xué), 2009.

[25] Meng L. Studies on construction of specific gland expressional vector of hLF and modified fibroblast cell line[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2010 (in Chinese).孟立. 人乳鐵蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞株的建立[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[26] Hu LY. Gene targeting toward β-lactoglobulin gene in goat[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2012 (in Chinese).胡林勇. 靶向山羊 β-乳球蛋白基因的基因打靶研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2012.

[27] Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014, 157(6): 1262–1278.

[28] Jeong YH, Kim YJ, Kim EY, et al. Knock-in fibroblasts and transgenic blastocysts for expression of human FGF2 in the bovine β-casein gene locus using CRISPR/Cas9 nuclease-mediated homologous recombination. Zygote, 2015, 24(3): 442–456.

[29] Liu C. The study on efficiency of CRISPR/Cas9 and TALENs mediated gene targeting at dairy goat β-casein locus[D]. Hohhot: Inner Mongolia University, 2016 (in Chinese). 劉暢. CRISPR/Cas9與 TALENs介導(dǎo)奶山羊 β-酪蛋白位點基因打靶效率的比較研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古大學(xué), 2016.

[30] Slaymaker IM, Gao LY, Zetsche B, et al.Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science, 2016, 351(6268):84–88.

[31] Shen W, Yang ZT, Deng JX. Production of mammary gland bioreactor by gene targeting of somatic cells. Chin J Biotech, 2003, 19(6):767–770 (in Chinese).沈偉, 楊正田, 鄧?yán)^先. 體細(xì)胞基因打靶制備動物乳腺生物反應(yīng)器的策略與應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2003, 19(6): 767–770.

[32] Cui CC, Song YJ, Liu J, et al. Gene targeting by TALEN-induced homologous recombination in goats directs production of β-lactoglobulin-free,high-human lactoferrin milk. Sci Rep, 2015, 5:10482.

[33] Song SZ, Zhu MM, Yuan YG, et al. BLG gene knockout and hLF gene knock-in at BLG locus in goat by TALENs. Chin J Biotech, 2016, 32(3):329–338 (in Chinese).宋紹征, 朱孟敏, 袁玉國, 等. 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶介導(dǎo)的山羊 β-乳球蛋白基因敲除和人乳鐵蛋白基因定點整合. 生物工程學(xué)報,2016, 32(3): 329–338.

[34] Chu VT, Weber T, Wefers B, et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol, 2015, 33(5):543–548.

[35] Maruyama T, Dougan SK, Truttmann MC, et al.Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat Biotechnol,2015, 33(5): 538–542.

[36] Song J, Yang DS, Xu J, et al. RS-1 enhances CRISPR/Cas9- and TALEN-mediated knock-in efficiency. Nat Commun, 2016, 7: 10548.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

RS-1 enhanced the efficiency of CRISPR-Cas9 mediated knock-in of human lactoferrin

Wenjun Zhou, Rihong Guo, Mingtian Deng, Feng Wang, and Yanli Zhang

Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

This study aims to knock out the goat β-lactoglobulin (BLG) gene using CRISPR-Cas9 system and knock in human lactoferrin (hLF) at the BLG locus, and further study the effect of RAD51 stimulatory compound (RS-1) on homologous recombination efficiency. First, we designed an sgRNA targeting the first exon of goat BLG gene and constructed a co-expression vector pCas9-sgBLG. This sgRNA vector was then transfected into goat ear fibroblasts (GEFs),and the target region was examined by T7EN1 assay and sequencing. Second, we constructed a targeting vector pBHA-hLF-NIE including NEO and EGFP genes based on BLG gene locus. This targeting vector together with pCas9-sgBLG expression vector was co-transfected into GEFs. Transfected cells were then treated with 0, 5, 10 and 20 μmol/L RS-1 for 72 h to analyse the EGFP expression efficiency. Next, we used 800 μg/mL G418 to screen G418-resistent cell clones, and studied hLF site-specific knock-in cell clones by PCR and sequencing. The editing efficiency of sgBLG was between 25% and 31%. The EGFP expression efficiency indicated that the gene knock-in efficiency was improved by RS-1 in a dose-dependent manner, which could reach 3.5-fold compared to the control group.The percentage of positive cells with hLF knock-in was increased to 32.61% when 10 μmol/L RS-1 was used. However,when the concentration of RS-1 increased to 20 μmol/L, the percentage of positive cells decreased to 22.22% and resulted in an increase of senescent cell clone number. These results suggested that hLF knock-in and BLG knock-out in GEFs were achieved by using CRISPR/Cas9 system, and optimum concentration of RS-1 could improve knock-in efficiency, which provides a reference for efficiently obtaining gene knock-in cells using CRISPR/Cas9 in the future.

CRISPR-Cas9, RS-1, β-lactoglobulin, homologous recombination, hLF, goat ear fibroblasts

March 16, 2017; Accepted: June 5, 2017

Yanli Zhang. Tel: +86-25-84395381; E-mail: zhangyanli@njau.edu.cn

Supported by: National Major Special Program of Breeding of Transgenic Organisms New Variety (No. 2014ZX08008-004).

國家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項 (No. 2014ZX08008-004) 資助。