梁志婷，鄧建強(qiáng)，王自奎，沈禹穎，王先之

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草業(yè)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，甘肅 蘭州 730020)

隴東旱塬區(qū)不同糧草輪作模式下土壤細(xì)菌群落組成特征

梁志婷，鄧建強(qiáng)，王自奎，沈禹穎，王先之*

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，草業(yè)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，甘肅 蘭州 730020)

以隴東旱塬區(qū)冬麥-休閑-大豆(W-F-S)、冬麥-油菜-箭筈豌豆(W-R-V)和冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿(W/F-L-L)糧草輪作系統(tǒng)為對(duì)象，基于16S rRNA基因序列擴(kuò)增子測(cè)序，研究了3種輪作模式下耕層土壤(0～10 cm及10～20 cm)細(xì)菌群落組成特征。結(jié)果表明，3種輪作模式下，土壤細(xì)菌群落中占優(yōu)勢(shì)的菌門為變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)；土壤細(xì)菌群落屬組成中以紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes)、出芽菌屬(Gemmata)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、Adhaeribacter菌屬和Balneimonas菌屬等與固氮相關(guān)的菌屬為主。W-F-S輪作模式下土壤特異優(yōu)勢(shì)菌屬為紫色桿菌屬(Janthinobacterium)和溶桿菌屬(Lysobacter)，該類菌屬與胞囊線蟲的防治有關(guān)，間接揭示了該輪作模式可能抑制土傳病害發(fā)生；W-R-V輪作模式下歐文氏菌屬(Erwinia)豐度較高，主要與前茬油菜根系殘留相關(guān)；W/F-L-L輪作模式下鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)豐度較高，與苜蓿生長的少免耕措施有關(guān)。0～10 cm土層細(xì)菌多樣性表現(xiàn)為W-F-S>W/F-L-L>W-R-V，10～20 cm土層表現(xiàn)則呈與之相反趨勢(shì)。本研究從細(xì)菌群落組成和功能角度，闡釋了包含豆科牧草的糧草輪作系統(tǒng)促進(jìn)生物固氮、阻隔病害傳播的微生物學(xué)機(jī)理，可為隴東旱塬區(qū)建立合理草田輪作制度和維持良好土壤生態(tài)環(huán)境提供理論依據(jù)。

黃土高原；微生物；大豆；箭筈豌豆；苜蓿

隴東黃土高原是我國典型雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)之一，也是甘肅省冬小麥主產(chǎn)區(qū)。該地區(qū)以冬小麥為主的谷物連作方式及化肥的不合理施用致使土壤有機(jī)質(zhì)含量降低[1-2]，造成作物產(chǎn)量低而不穩(wěn)，影響區(qū)域內(nèi)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展[3]。豆科作物與禾谷類作物合理輪作是傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的精華，是提高農(nóng)田土壤質(zhì)量的栽培耕作方式之一[4]。國內(nèi)外生產(chǎn)實(shí)踐證明豆科作物可以通過充分利用其生物固氮特性來提高土壤肥力，減少化肥投入，保持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定[5-7]。研究表明，通過合理輪作可增加作物種類，豐富地上、地下生物多樣性，從而改善土壤微生態(tài)環(huán)境[8-9]。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分，其群落結(jié)構(gòu)和多樣性主要受植物物種組成和土壤養(yǎng)分狀況的影響[10]。不同作物釋放的根系分泌物不同，其土壤微生物群落生長代謝和群落結(jié)構(gòu)存在差異[11]。細(xì)菌是土壤微生物中分布最廣，數(shù)量最多的部分[12]，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，是土壤養(yǎng)分變化的敏感指標(biāo)之一[13]。近年來，研究微生物群落組成及多樣性一直是揭示植物-微生物互作機(jī)制的熱點(diǎn)問題[14]。不同輪作模式對(duì)土壤微生物的影響不盡相同，因此確定合理輪作模式對(duì)促進(jìn)當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

在隴東黃土高原，冬小麥?zhǔn)斋@后復(fù)種豆科牧草箭筈豌豆(Viciasativa)、飼用油菜(Brassicacampestris)及苜蓿(Medicagosativa)構(gòu)成的糧草輪作系統(tǒng)可提高作物系統(tǒng)生產(chǎn)力和水熱資源利用效率[15]。為明確不同糧草輪作體系的構(gòu)建對(duì)土壤微生物群落組成的影響，本研究以隴東旱塬區(qū)冬麥-休閑-大豆(wheat-fallow-soybean，W-F-S)、冬麥-油菜-箭筈豌豆(wheat-rapeseed-common vetch，W-R-V)、冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿(wheat/fallow-lucerne-lucerne，W/F-L-L)輪作模式為對(duì)象，采用Illumina Hiseq平臺(tái)研究了3種輪作模式下表層0～20 cm土壤細(xì)菌類群組成特征，以期解釋不同作物與土壤細(xì)菌類群間的互作關(guān)系，為建立合理的草田輪作模式提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在甘肅省慶陽市西峰區(qū)什社鄉(xiāng)蘭州大學(xué)慶陽黃土高原試驗(yàn)站(N 35°39′，E 107°51′，海拔1297 m)內(nèi)進(jìn)行。該區(qū)域是典型黃土高原雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，屬大陸性季風(fēng)氣候，春冬寒冷干燥，夏季炎熱多雨。多年平均降雨量573 mm(1961-2015年)，主要集中在7、8、9三個(gè)月。年均氣溫在8～10 ℃之間，極端最高氣溫39.6 ℃，極端最低氣溫-22.4 ℃，無霜期150～190 d，生長季255 d。供試土壤為黑壚土，質(zhì)地為粉壤土。本研究開展前，試驗(yàn)地長期種植冬小麥。0～20 cm土層基礎(chǔ)養(yǎng)分為：有機(jī)質(zhì)含量為3.63 g/kg，全氮含量為0.61 g/kg。pH值8.1，土壤容重為1.24 g/cm3。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

如圖1所示，試驗(yàn)始于2013年，設(shè)置冬麥-休閑-大豆(W-F-S)、冬麥-油菜-箭筈豌豆(W-R-V)、冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿(W/F-L-L)3種輪作模式，小區(qū)面積為4 m×5 m=20 m2，每個(gè)處理3次重復(fù)，共9個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列。供試作物分別為大豆(Glycinemax)、箭筈豌豆和紫花苜蓿。大豆播種時(shí)間為2015年4月23日，大豆行間距和株間距均為20 cm，箭筈豌豆播種時(shí)間為2015年7月11日，播量為75 kg/hm2；苜蓿的播種時(shí)間為2014年9月7日，播量為22.5 kg/hm2。各處理施氮肥為尿素、磷肥為磷酸二銨，施氮量為69 kg N/hm2，施磷量為27 kg P2O5/hm2，皆于作物播前將肥料撒施地表后耕翻入土，常規(guī)田間管理。

圖1 3種輪作模式作物種植順序Fig.1 Crop sequence of three crop rotation models

1.3 土壤樣品采集與處理

2015年9月28日分別在大豆(soybean，S)、箭筈豌豆(common vetch，V)和苜蓿(lucerne，L)生育期結(jié)束后，用內(nèi)徑40 mm的土鉆進(jìn)行耕層土壤取樣，每個(gè)小區(qū)采用5點(diǎn)“S”型取樣法，分0～10 cm和10～20 cm兩個(gè)層次，共18個(gè)樣。為避免污染，每次取樣后土鉆都用75%的酒精消毒。去除植物殘?bào)w和石礫等雜物后同層混合均勻樣品，放入滅菌袋用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。樣品于-80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物DNA提取及后續(xù)測(cè)定。

1.4 土壤微生物DNA提取和16S rRNA基因高通量測(cè)序

每個(gè)樣品稱取相當(dāng)于0.5 g干土重量的新鮮土壤。采用FastDNA?SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)試劑盒提取土壤微生物總DNA，1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA樣品是否有降解以及雜質(zhì)；NanoPhotometer分光光度計(jì)檢測(cè)樣品純度；Qubit 2.0 Flurometer檢測(cè)DNA樣品濃度。利用TE緩沖液將土壤總DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。提取DNA流程操作步驟參考試劑盒說明書。

土壤DNA樣品純化后用無菌水稀釋至1 ng/μL，利用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)-805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)擴(kuò)增土壤微生物16S rRNA的V3+V4區(qū)基因片段。修飾后的通用引物含有不同的Tag標(biāo)簽用以區(qū)分不同的土壤樣品。PCR反應(yīng)體系如下：Phusion Master Mix (1X)15 μL，DNA模板(1 ng/μL)10 μL，正、反向引物(0.2 μmol/L)各3 μL，蒸餾水補(bǔ)至30 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃，3 min；(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s)，25個(gè)循環(huán)；16 ℃,10 min。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。獲得擴(kuò)增產(chǎn)物后，進(jìn)一步通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物純化效果，測(cè)定純化后PCR產(chǎn)物的濃度。將土壤樣品16S rRNA基因的PCR純化產(chǎn)物等摩爾數(shù)混合，利用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒，割膠回收目標(biāo)條帶。

使用New England Biolabs公司的NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，USA)試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit@2.0熒光計(jì)(Life Technologies，CA，USA)和安捷倫科技公司生物分析儀2100系統(tǒng)定量和文庫檢測(cè)合格后，使用Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。文庫構(gòu)建和測(cè)序均在北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2007軟件整理數(shù)據(jù)，然后用Genstat17.0進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)同一土層不同輪作模式土壤細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行方差分析，采用配對(duì)T檢驗(yàn)法檢驗(yàn)同一輪作模式不同土層土壤細(xì)菌群落組成差異。通過主成分(PCA)分析3個(gè)輪作模式下土壤細(xì)菌在屬水平的相對(duì)豐度特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品測(cè)序結(jié)果

測(cè)序得到的土壤細(xì)菌群落序列讀數(shù)和OTUS數(shù)(表1)，在相似度大于97%的水平上3個(gè)輪作模式共獲得高質(zhì)量目標(biāo)序列65355條。Cleanreadsrate值均高于80%，說明測(cè)序質(zhì)量可以反映土壤細(xì)菌群落組成情況。同一土層不同輪作模式統(tǒng)計(jì)分析表明，0～10cm土層各模式下土壤細(xì)菌的OTUS的種類數(shù)無顯著差異(P>0.05)，10～20cm土層只有W-F-S出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)；同一輪作模式不同土層統(tǒng)計(jì)分析表明，W-R-V的10～20cmOTUS的種類數(shù)差異顯著，其他各輪作模式差異不顯著(P>0.05)。比較OTUS的種類數(shù)發(fā)現(xiàn)：在0～10cm土層內(nèi)，W-F-S的OTUS種類數(shù)最多，W/F-L-L次之；在10～20cm土層內(nèi)，W-R-V的OTUS種類數(shù)最多，其次是W/F-L-L。在整個(gè)0～20cm耕層土壤中除W-F-S外，其他處理OTUS的種類數(shù)均隨著土層的加深呈增加趨勢(shì)。

表1 不同輪作模式下不同土層土壤細(xì)菌序列讀數(shù)及OTUS數(shù)

注：大寫字母表示同行之間比較，小寫字母表示同列之間比較，不同字母在0.05水平下差異顯著。下同。

Note： The differences among different soil layer are shown by capital letters in the same rotation model, differences among different rotation models are shown by small letters in the same soil layer, the significant differences atP<0.05 are shown by different letters in the Table. The same below.

2.2 土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性

在0～10 cm土層內(nèi)，土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性指數(shù)在3個(gè)輪作模式之間差異均不顯著(P>0.05)。在10～20 cm土層土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)Shannon和Simpson在W-F-S和W-R-V模式之間差異顯著(P<0.05)。W-R-V模式在兩個(gè)土層的Observed species和Shannon指數(shù)出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。由表2可以看出，在0～10 cm土層內(nèi)，土壤的細(xì)菌豐富度指數(shù)Chao1變化趨勢(shì)為W-F-S>W-R-V>W/F-L-L，Observed species變化趨勢(shì)為：W-F-S>W/F-L-L>W-R-V。土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)變化趨勢(shì)均為：W-F-S>W/F-L-L>W-R-V。在10～20 cm土層內(nèi)，土壤的細(xì)菌豐富度指數(shù)(Chao1和Observed species)、多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)變化趨勢(shì)均為：W-R-V>W/F-L-L>W-F-S。上述結(jié)果表明，0～10 cm土層，W-F-S的菌群Alpha多樣性最高，W/F-L-L次之。在10～20 cm土層，各處理土壤細(xì)菌群落組成Alpha多樣性指數(shù)呈現(xiàn)出與0～10 cm相反的趨勢(shì)。

2.3 不同分類水平下土壤細(xì)菌組成

在門水平上，除極少部分細(xì)菌(0.02%～0.05%)未被分類外，3種輪作模式下兩個(gè)土層土壤細(xì)菌均主要分布在25個(gè)細(xì)菌門類。圖2和圖3分別為0～10 cm和10～20 cm土層豐度前10(占總量的98%)的菌門分布。其中優(yōu)勢(shì)菌門均為酸桿菌門(33.47%～39.76%)和變形菌門(32.55%～37.60%)。在0～10 cm土層中疣微菌門(Verrucomicrobia)的豐度在W-R-V模式中顯著高于W/F-L-L模式(P<0.05)，硝化螺旋菌門豐度在W-F-S模式中顯著高于W-R-V和W/F-L-L(P<0.05)。在10～20 cm土層，W-F-S模式中酸桿菌門豐度顯著高于W-R-V模式而綠彎菌門(Chloroflexi)豐度顯著低于W-R-V模式(P<0.05)；W-R-V的放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和疣微菌門豐度顯著高于其他兩個(gè)輪作模式。其余各菌在各樣品中均有分布，相對(duì)豐度因處理不同而存在差異，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 各輪作模式下0～20 cm土壤細(xì)菌群落Alpha多樣性比較

圖2 不同輪作模式0～10 cm土層土壤在門水平上的細(xì)菌類群比較Fig.2 Comparison of bacteria groups at phylum level in soil of 0-10 cm layer under different rotation models 不同小寫字母代表不同輪作模式間的差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters represent significant differences among different rotation models (P<0.05). Proteobacteria: 變形菌門；Acidobacteria: 酸桿菌門；Bacteroidetes: 擬桿菌門；Actinobacteria: 放線菌門；Planctomycetes: 浮霉菌門；Gemmatimonadetes: 芽單胞菌門；Verrucomicrobia: 疣微菌門；Chloroflexi: 綠彎菌門；Nitrospirae: 硝化螺旋菌門；Armatimonadetes: 裝甲菌門. 下同The same below.

圖3 不同輪作模式10～20 cm土層土壤在門水平上的細(xì)菌類群比較Fig.3 Comparison of bacteria groups at phylum level in soil of 10-20 cm layer under different rotation models

圖4 不同輪作模式0～10 cm土層土壤在屬水平上的細(xì)菌類群比較Fig.4 Comparison of bacteria groups at genus level in soil of 0-10 cm layer under different rotation models Arthrobacter: 節(jié)細(xì)菌屬；Rhodoplanes: 紅游動(dòng)菌屬；Nitrospira: 硝化螺旋菌屬；Sphingomonas: 鞘脂單胞菌屬；Lysobacter: 溶桿菌屬；Janthinobacterium:紫色桿菌屬；Gemmata:出芽菌屬；Devosia:德沃斯氏菌屬；Pseudomonas:假單胞菌屬； Phenylobacterium:苯基桿菌屬；Bradyrhizobium:慢生根瘤菌屬；Erwinia:歐文氏菌屬；Bacillus:芽孢桿菌屬；Variovorax:貪噬菌屬；Balneimonas:拜納蒙納斯屬。下同The same below.

圖5 不同輪作模式10～20 cm土層土壤在屬水平上的細(xì)菌類群比較Fig.5 Comparison of bacteria groups at genus level in soil of 10-20 cm layer under different rotation models

在屬的分類水平，除未被分類的細(xì)菌屬外(84.96%～90.38%)，0～10 cm土層各輪作模式土壤細(xì)菌相對(duì)豐度前25的細(xì)菌菌屬分布見圖4。3個(gè)模式下土壤各細(xì)菌屬所占相對(duì)豐度大小存在差異，其中硝化螺旋菌屬和紫色桿菌屬豐度在W-F-S模式顯著高于W/F-L-L模式，而CandidatusSolibacter菌屬豐度顯著低于W/F-L-L模式(P<0.05)；Flavisolibacter菌屬和苯基桿菌屬(Phenylobacterium)在W/F-L-L模式豐度顯著低于其他輪作模式(P<0.05)；紅游動(dòng)菌屬在W-F-S模式豐度高于W/F-L-L和W-R-V，且差異顯著(P<0.05)；Adhaeribacter菌屬在W-R-V模式豐度較高且差異顯著(P<0.05)。各處理前5種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬除了共有菌屬Kaistobacter屬(2.73%～3.67%)和Flavisolibacter屬(1.15%～1.90%)外，W-F-S下優(yōu)勢(shì)菌屬還包括節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter，0.90%)、紅游動(dòng)菌屬(0.85%)和紫色桿菌屬(0.77%)，W-R-V下包括節(jié)細(xì)菌屬(1.37%)、歐文氏菌屬(0.78%)和Adhaeribacter菌屬(0.66%)；W/F-L-L包括鞘脂單胞菌屬(0.83%)、紅游動(dòng)菌屬(0.60%)和Fimbriimonas菌屬(0.47%)。

在10～20 cm土層土壤內(nèi)3個(gè)輪作模式土壤細(xì)菌屬的相對(duì)豐度大小均存在差異，其中W/F-L-L模式中的紅游動(dòng)菌屬相對(duì)豐度顯著高于W-R-V模式(P<0.05)；紫色桿菌屬和Ramlibacter菌屬在W-F-S模式中相對(duì)豐度顯著高于其他模式(P<0.05)；W-R-V模式中的CandidatusSolibacter菌屬豐度顯著低于W-F-S和W/F-L-L模式，而Adhaeribacter菌屬和Iamia菌屬豐度較其他模式高且差異顯著(P<0.05)；W/F-L-L模式中出芽菌屬豐度顯著高于W-F-S和W-R-V模式(P<0.05)。Kaistobacter仍然是3種模式下的共有屬(1.63%～4.53%)，此外硝化螺旋菌屬(0.76%～1.34%)、節(jié)細(xì)菌屬(0.85%～1.81%)和紅游動(dòng)菌屬(0.75%～1.90%)也是共有菌屬。W-F-S下優(yōu)勢(shì)菌屬還包括溶桿菌屬(0.73%)；W-R-V還包括Iamia菌屬(0.51%)；W/F-L-L還包括出芽菌屬(0.99%)(圖5)。

2.4 土壤細(xì)菌屬相對(duì)豐度的主成分分析

圖6 不同輪作模式不同土層土壤在屬水平細(xì)菌相對(duì)豐度主成分分析 Fig.6 Principal component analysis of bacteria relative abundance in different soil layers under different rotation modelsS10、V10、L10分別表示W(wǎng)-F-S、W-R-V和W/F-L-L模式0～10 cm土層樣品；S20、V20、L20分別表示W(wǎng)-F-S、W-R-V和W/F-L-L模式10～20 cm土層樣品。S10, V10 and L10 respectively represent the samples of 0-10 cm soil layer in W-F-S, W-R-V and W/F-L-L models; S20, V20 and L20 respectively represent the samples of 10-20 cm soil layer in W-F-S, W-R-V and W/F-L-L.

3種輪作模式下土壤細(xì)菌物種相對(duì)豐度共提取6個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)85.82%，其中第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)貢獻(xiàn)率分別為33.85%和18.60%。從圖6中可以看出，3種輪作模式的0～10 cm均分布在PC1軸負(fù)方向，W/F-L-L模式的10～20 cm分布在正方向。W-R-V模式的0～10 cm分布在PC2軸正方向，W/F-L-L模式的0～10 cm、W-F-S和W-R-V模式的10～20 cm分布在負(fù)方向。

載荷因子反映主成分與細(xì)菌屬水平豐度的相關(guān)系數(shù)，載荷因子越高，表示該細(xì)菌屬對(duì)主成分的影響越大[16]。與第一主成分(PC1)具有較高相關(guān)性的細(xì)菌屬主要有紅游動(dòng)菌屬、Pirellula菌屬、慢生根瘤菌屬、出芽菌屬和硝化螺旋菌屬，與第二主成分(PC2)具有較高相關(guān)性的細(xì)菌屬則主要有Balneimonas菌屬、DA101菌屬、苯基桿菌屬、德沃斯氏菌屬(Devosia)和Adhaeribacter菌屬(表3)。

表3 25個(gè)細(xì)菌屬水平豐度的主成分載荷因子

注：帶*的為兩個(gè)主成分中相關(guān)性前5的細(xì)菌屬。

Note： * are the top 5 related genus of the two main components.

3 討論

3.1 不同輪作模式下土壤細(xì)菌多樣性特征

微生物多樣性反映微生物與土壤環(huán)境間的相互關(guān)系，不同輪作模式中各作物對(duì)微生物多樣性的影響不同[17]。本研究以不同豆科作物構(gòu)成的輪作模式為對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在冬麥-休閑-大豆模式下土壤0～10 cm細(xì)菌多樣性最高，這與李曉慧等[18]曾報(bào)道種植大豆更有利于土壤微生物的生長和繁殖，提高土壤細(xì)菌豐度一致。而且研究表明輪作中對(duì)土壤短期休閑處理，使土壤保持肥力，對(duì)土壤表層的微生物種群和群落組成有積極作用[19]。冬麥-油菜-箭筈豌豆模式下0～10 cm細(xì)菌多樣性最低，可能是由于此輪作模式下作物種類多，耕作頻繁而擾動(dòng)土壤生境，導(dǎo)致土壤微生物群落環(huán)境不穩(wěn)定，致使一些適應(yīng)特定環(huán)境的微生物失去活性[20]。而冬麥-油菜-箭筈豌豆和冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿模式下10～20 cm多樣性相對(duì)較高的原因是箭筈豌豆前茬油菜的直根系可以分泌有機(jī)酸，促進(jìn)了土壤難溶性的磷轉(zhuǎn)化為有效磷，改善土壤養(yǎng)分和生物體的代謝，提高土壤微生物群落活性，有增加微生物數(shù)量及其多樣性的作用[21]；而苜蓿是多年生作物，隨著生長年限增加，土壤根系累積增多，導(dǎo)致其土壤微生物多樣性較高。在0～20 cm耕層土壤中冬麥-休閑-大豆微生物多樣性表現(xiàn)最低，這可能是由于大豆種植前，土壤處于冬閑期，導(dǎo)致微生物失去繁殖所需載體[22]，這與植被覆蓋下細(xì)菌種類豐度較裸地要高的結(jié)果一致[23]。

3.2 不同輪作模式下土壤細(xì)菌類群組成

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受種植作物的影響[24]，作物種類不同其土壤微生物所處環(huán)境不同，細(xì)菌組成和豐度大小有差異，不同的農(nóng)田土壤中存在共有和特異的細(xì)菌種群[25]。本研究發(fā)現(xiàn)變形菌、酸桿菌和擬桿菌在各輪作模式豐度較高，這一結(jié)果與Sapp等[26]、Liu等[27]和王伏偉等[28]對(duì)小麥和大豆土壤細(xì)菌的研究結(jié)果一致。在屬的水平，Kaistobacter屬在0～20 cm耕層豐度較高，該屬為不產(chǎn)氧光合細(xì)菌，其功能與光合作用和固氮作用緊密相關(guān)[29]，這與3個(gè)模式取樣階段均為豆科作物相符。紅游動(dòng)菌屬具有脫氮作用，是具有降解有機(jī)物及一些難以生物降解的含氮化合物功能菌，在豆科作物土壤中較常見，且在光照厭氧和黑暗好氧條件下降解效果更好[30]。本研究中冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿模式下10～20 cm紅游動(dòng)菌屬豐度最大，由于苜蓿為多年生作物，免耕下10～20 cm土層氧氣含量低于0～10 cm土層。節(jié)細(xì)菌屬是土壤常見細(xì)菌之一，為化能異養(yǎng)菌，具有脫硫、解磷和固氮作用[31]，在冬麥-油菜-箭筈豌豆模式下豐度最高，這可能與油菜根系分泌有機(jī)酸有關(guān)。0～10 cm土層土壤細(xì)菌中Flavisolibacter屬豐度表現(xiàn)較高，這可能由于其為纖維素降解菌屬，其產(chǎn)生纖維素酶水解0～10 cm土層植物凋落物的細(xì)胞壁，促進(jìn)根瘤菌侵染根系[32]。輪作系統(tǒng)可以通過增加作物多樣性改變土壤環(huán)境，抑制植物的一些土傳病害發(fā)生[33]。研究表明，某些植物能夠與微生物產(chǎn)生互作作用，對(duì)植物病害控制產(chǎn)生一定效果，同時(shí)也可能會(huì)引起某種作物感染病害[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，冬麥-休閑-大豆模式土壤中紫色桿菌屬豐度較高，該菌屬能夠通過產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶或紫色桿菌素的方式對(duì)大豆胞囊線蟲發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，有生防效果[35]。冬麥-油菜-箭筈豌豆土壤中歐文氏菌屬豐度較高，與種植油菜密切相關(guān)，歐文氏菌屬是十字花科等植物的病原菌，易引起植物器官和組織的軟腐，能夠以腐生的形式存活于土壤耕層或在植物殘?bào)w中存活并越冬[36-37]。研究結(jié)果揭示了在隴東旱塬區(qū)冬麥后復(fù)種大豆、箭筈豌豆改善土壤肥力的同時(shí)，提示在有大豆加入的輪作土壤中對(duì)胞囊線蟲防治效果較好、油菜參與的輪作系統(tǒng)中需關(guān)注軟腐病的發(fā)生。冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿土壤中鞘脂單胞菌屬和Fimbriimonas菌屬豐度較高，此二菌均具有固氮和脫氮特征，在維持氮平衡方面起重要作用[38]。劉丹丹等[39]在連作根圍土壤發(fā)現(xiàn)鞘脂單胞菌屬類群數(shù)量增加。Fimbriimonas菌屬為需氧、嗜溫且非運(yùn)動(dòng)性細(xì)菌，適宜低營養(yǎng)濃度環(huán)境生存[40]，而苜蓿是二年生，較箭筈豌豆和大豆地上、地下生物量大，對(duì)土壤擾動(dòng)頻率低，所以Fimbriimonas菌屬在冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿0～10 cm土層中豐度較高。在10～20 cm土層土壤，硝化螺旋菌屬豐度表現(xiàn)相對(duì)較高，這可能與其參與土壤氮循環(huán)，適宜在低碳和氮土壤中生存相關(guān)聯(lián)[41]。冬麥-休閑-大豆模式下溶桿菌屬豐度較高，該菌與大豆胞囊線蟲的卵和胞囊發(fā)育有關(guān)，其中抗生素溶桿菌有效防治大豆銹病[42]，因此有大豆參加的輪作可以很好地抑制有關(guān)病蟲害。冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿模式豐度表現(xiàn)較高的出芽菌屬為厭氧氨氧化菌，適宜養(yǎng)分含量較低環(huán)境，促進(jìn)氮循環(huán)[43]，在非根際土壤豐度較高[44]。

3.3 不同輪作模式對(duì)土壤細(xì)菌屬水平物種豐度的影響

因子載荷用來反映微生物群落的生理特征，是其群落組成和功能多樣性的具體表現(xiàn)[45]，同時(shí)結(jié)合主成分分析可以解釋不同處理土壤微生物群落組成不同。本研究中紅游動(dòng)菌屬、出芽菌屬和硝化螺旋菌屬與第一主成分相關(guān)性較高，這與相對(duì)豐度結(jié)果相一致。研究發(fā)現(xiàn)慢生根瘤菌屬具備溶無機(jī)磷酸鹽的能力，接種該菌株可提高大豆光合作用色素含量[46]，在非根際土壤豐度較高。Pirellula菌屬為專性好氧菌參與土壤氮循環(huán)，在0～10 cm土壤中較豐富。因此，在第一主成分它們相關(guān)性較高。本研究中，Balneimonas菌屬、DA101菌屬、苯基桿菌屬和德沃斯氏菌屬與第二主成分相關(guān)性較高。Balneimonas菌屬是與豆科植物相關(guān)的根瘤菌屬；DA101菌屬好氧，一般在表土層豐度較高，可利用植物生物代謝有機(jī)碳過程中的化學(xué)能[47]。苯基桿菌屬和德沃斯氏菌屬均為固氮菌，屬于好氧細(xì)菌常見于土壤表層[48]。但目前為止，德沃斯氏菌屬在土壤中的具體功能還鮮有報(bào)道?？傮w來看，與第一、第二主成分相關(guān)性較高的菌屬均與生物固氮性能有關(guān)，這與本研究采用的輪作模式中均包含豆科作物相吻合。

4 結(jié)論

在隴東旱塬冬小麥后采用不同的豆科作物復(fù)種輪作方式下，土壤0～10 cm細(xì)菌多樣性以W-F-S模式下最高，W-R-V最低；10～20 cm土層表現(xiàn)出相反趨勢(shì)。3種輪作模式下細(xì)菌群落組成接近，土壤細(xì)菌大部分為與固氮有關(guān)的菌如紅游動(dòng)菌屬、出芽菌屬和硝化螺旋菌屬等；W-F-S模式中與防治胞囊線蟲有關(guān)的紫色桿菌屬和溶桿菌屬豐度較高；W-R-V模式土壤中發(fā)現(xiàn)病原菌歐文氏菌屬的出現(xiàn)可能受前茬油菜的根系殘留影響；W/F-L-L模式土壤中菌屬以固氮作用為主。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過冬麥后復(fù)種大豆、箭筈豌豆，或采用小麥-苜蓿輪作模式可改善隴東旱塬區(qū)土壤肥力，并揭示了防治某些土傳植物病害的微生物機(jī)理。

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Differences in soil bacterial community composition among three forage-crop rotations on the Longdong Loess Plateau

LIANG Zhi-Ting, DENG Jian-Qiang, WANG Zi-Kui, SHEN Yu-Ying, WANG Xian-Zhi*

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-Ecosystems,CollegeofPastoralAgriculturalScienceandTechnology,NationalDemonstrationCenterforExperimentalGrasslandScienceEducation,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

We analyzed the composition of the soil bacterial community in two topsoil layers (0-10 cm and 10-20 cm) under three crop-forage rotation models; winter wheat-fallow-soybean (W-F-S), winter wheat-forage rapeseed-common vetch (W-R-V), and winter wheat/fallow-lucerne (W/F-L-L). The soil bacterial community was analyzed by sequencing 16S rRNA gene amplicons. The results indicated that the dominant phyla in the topsoil were Proteobacteria and Acidobacteria under all three rotation models. The dominant genera in the topsoil under the three rotation models wereRhodoplanes,Gemmata,Nitrospira,Bradyrhizobium,Adhaeribacter, andBalneimonas. The bacterial communities in the topsoil under the W-F-S rotation sequence were dominated byJanthinobacteriumandLysobacter, which were related to the prevention and control of soybean cyst nematode, and were closely associated with soil-borne pathogen resistance under the W-F-S rotation. The dominant genus in topsoil in the W-R-V rotation wasErwinia, which was related to rapeseed, and that in the W/F-L-L rotation sequence wasSphingomonas, which was indicative of no- or low-tillage during alfalfa planting. The rotations could be ranked, from highest bacterial alpha-diversity to lowest, as follows W-F-S>W/F-L-L>W-R-V in the 0-10 cm topsoil layer; and W-R-V>W/F-L-L>W-F-S in the 10-20 cm topsoil layer. This study reveals the mechanisms by which nitrogen fixation is promoted and soil-borne pathogens are inhibited in various crop-forage rotation systems, from the perspective of the bacterial community composition and function. The results of this study have important theoretical value for maintaining a healthy soil ecological environment and for establishing successful forage-crop rotation systems on the Longdong Loess Plateau.

Loess Plateau; microorganism; soybeans; common vetch; lucerne

10.11686/cyxb2017048

http://cyxb.lzu.edu.cn

2017-02-16；改回日期：2017-04-19

甘肅省草原技術(shù)推廣總站項(xiàng)目，國家科技支撐計(jì)劃(2014BAD14B006)和教育部重大科技項(xiàng)目(313028)資助。

梁志婷(1990-)，女，甘肅蘭州人，在讀碩士。E-mail:liangzht15@lzu.edu.cn*通信作者Corresponding author. E-mail:wangxianzhi@lzu.edu.cn

梁志婷, 鄧建強(qiáng), 王自奎, 沈禹穎, 王先之. 隴東旱塬區(qū)不同糧草輪作模式下土壤細(xì)菌群落組成特征. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(8): 180-191.

LIANG Zhi-Ting, DENG Jian-Qiang, WANG Zi-Kui, SHEN Yu-Ying, WANG Xian-Zhi. Differences in soil bacterial community composition among three forage-crop rotations on the Longdong Loess Plateau. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(8): 180-191.