劉嶸

(國(guó)際竹藤中心，北京，100102)

安鑫

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院)

韋鵬練

(廣西大學(xué)林學(xué)院)

費(fèi)本華

(國(guó)際竹藤中心)

偏光顯微鏡下毛竹材纖維細(xì)胞的分類1)

劉嶸

(國(guó)際竹藤中心，北京，100102)

安鑫

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院)

韋鵬練

(廣西大學(xué)林學(xué)院)

費(fèi)本華

(國(guó)際竹藤中心)

為更快捷簡(jiǎn)便地研究毛竹(Phyllostachysedulis(Carr.) J. Houz.)材纖維細(xì)胞特性，通過(guò)分析毛竹纖維細(xì)胞的偏光顯微鏡圖像，對(duì)照電子顯微鏡的壁層結(jié)構(gòu)形貌，提出了一種簡(jiǎn)單的分類方法。對(duì)纖維細(xì)胞特征進(jìn)行定性分析后，依據(jù)厚壁層數(shù)量將竹纖維細(xì)胞分為3種類型，并將側(cè)方纖維帽分為3個(gè)區(qū)域，統(tǒng)計(jì)各類型纖維細(xì)胞在各區(qū)域內(nèi)的分布規(guī)律。此分類方法可作為一種簡(jiǎn)單快速的篩選和預(yù)判手段，有助于對(duì)纖維細(xì)胞進(jìn)行更深層次的研究。

偏光顯微鏡；毛竹；細(xì)胞壁；竹纖維；細(xì)胞分類

毛竹生長(zhǎng)迅速、資源豐富，且易于可持續(xù)管理，是一種性能優(yōu)異、用途廣泛的木質(zhì)材料，其主要組成與利用部分是纖維細(xì)胞，它的微觀構(gòu)造與性質(zhì)決定了竹材的物理力學(xué)等宏觀表現(xiàn)[1]。國(guó)內(nèi)外對(duì)竹纖維細(xì)胞壁的解剖結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分、微纖絲排布以及壁層分布規(guī)律等進(jìn)行了大量的研究[2-4]。實(shí)際上毛竹纖維細(xì)胞之間特征不盡相同，進(jìn)行細(xì)胞壁深入研究時(shí)也不宜對(duì)它們一概而論，因此有必要對(duì)竹纖維細(xì)胞進(jìn)行快速分類。偏光顯微鏡(PLM)制樣簡(jiǎn)單且使用方便，在晶體光學(xué)性質(zhì)研究方面頗具優(yōu)勢(shì)，而竹材纖維具有相應(yīng)的晶體特性，可以借助偏光顯微鏡研究其微細(xì)結(jié)構(gòu)與特征[5]。筆者根據(jù)毛竹纖維細(xì)胞的PLM圖像特征，定性分析細(xì)胞形態(tài)與厚壁層數(shù)等分布規(guī)律，并進(jìn)行了簡(jiǎn)單分類，為深入研究毛竹纖維細(xì)胞特性提供一種簡(jiǎn)便易行的觀測(cè)與篩選分類方法。

1 材料與方法

4年生毛竹，采自安徽省黃山市的太平公益林場(chǎng)，從竹稈露出地面記為第1節(jié)，取第10節(jié)中部作為試驗(yàn)材料。

PLM和LM(普通光鏡)試樣制作：竹塊軟化后，用滑走切片機(jī)(M2000R)制成厚度為10 μm的橫縱切片；小竹條用等量的CH3COOH和H2O2混合液在試管中浸泡，于60 ℃水浴鍋中加熱18 h后取出，用蒸餾水洗至pH=7.0，得到離析后的單根纖維。切片與單根纖維均制成臨時(shí)封片。

FEG-SEM試樣制作：5 mm (長(zhǎng))×10 mm (寬)×10 mm(厚)竹塊，一組用常規(guī)電鏡制樣方法(干燥)，另一組先經(jīng)冷熱交替處理，再進(jìn)行干燥，最后用導(dǎo)電膠貼于樣品托上離子濺射鍍膜。

樣品載玻片在普通光鏡下觀察，再將相同樣品載玻片置于偏光顯微鏡(ML9000，MEIJI)載物臺(tái)上，起偏角度數(shù)設(shè)為90°，檢偏角為0°，外接CCD攝像頭；噴金后的樣品在場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(XL 30 ESEM FEG，F(xiàn)EI Company, Hillsboro, OR)下觀察。試驗(yàn)環(huán)境條件為室溫(20±3)℃，濕度(65±5)%。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLM下纖維細(xì)胞特征

2.1.1 纖維細(xì)胞的PLM圖像原理

纖維的PLM圖像對(duì)壁層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的定性認(rèn)識(shí)有重要意義，尹思慈等[6]利用偏光顯微鏡測(cè)定了木材纖維胞壁的纖絲角，也有研究[7]利用單根纖維縱向PLM圖像來(lái)辨認(rèn)紡織用聚酯類纖維特征，還有學(xué)者[7]通過(guò)PLM來(lái)間接估測(cè)棉纖維的成熟度。

纖維素是構(gòu)成竹纖維細(xì)胞壁的主要組分之一，是由許多D-吡喃葡萄糖苷通過(guò)1-4β苷鍵連接起來(lái)的線形高分子化合物[9]，具有能使光線的折射指數(shù)隨偏振光方向改變的晶體結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)一束普通偏振光的偏振方向，光振動(dòng)透過(guò)竹纖維后仍會(huì)進(jìn)一步透過(guò)正交偏光鏡，具有相同頻率和固定相位差的兩束折射光在顯微鏡內(nèi)產(chǎn)生光的干涉[10]，可由此觀察到竹纖維縱場(chǎng)面上外觀形態(tài)的干涉條紋。竹纖維的雙折射率決定光程差，光程差進(jìn)一步?jīng)Q定干涉條紋的顏色。此外，由Liese[11]和Wain[12]等學(xué)者提出的竹纖維精細(xì)結(jié)構(gòu)模型并結(jié)合纖維素的晶體特性可知，竹纖維細(xì)胞的橫截面上存在圓周或徑向取向，因此在正交偏光顯微鏡下將會(huì)出現(xiàn)消光黑十字叉的圖案(圖1e)。纖維縱切面上，不同位置所呈現(xiàn)的顏色段不同，但顏色分段的位置基本一致。纖維細(xì)胞縱向上各層的顏色特征較鮮明(圖1c)，纖維外緣亮度最大，這與毛竹纖維最外層細(xì)胞壁的雙折射特性有一定關(guān)系。

a、b分別為竹纖維縱切面的LM和PLM圖像(20×)；c為單根纖維的PLM圖像(20×)；d、e分別為竹纖維細(xì)胞的LM和PLM圖像(40×)。

2.1.2 纖維細(xì)胞的PLM圖像特征

毛竹莖稈主要由承力的纖維厚壁細(xì)胞和起連接作用并傳遞載荷的薄壁細(xì)胞基體組成，細(xì)胞橫切面近似圓形。圖2中，維管束厚壁細(xì)胞橫截面在偏光顯微鏡下出現(xiàn)消光黑十字叉。細(xì)胞因各壁層的折射率不同，視覺(jué)感覺(jué)有部分以胞腔為中心的同心環(huán)狀突起。

維管束中細(xì)胞壁為厚薄交替的多層結(jié)構(gòu)[13]，厚層占大部分，其纖絲角與細(xì)胞長(zhǎng)軸夾角較小，微纖絲對(duì)偏振光的雙折射率較低，出現(xiàn)圖2中較寬的暗環(huán)；而薄層纖絲角與細(xì)胞長(zhǎng)軸近乎垂直，在偏振光下有高雙折射率，觀測(cè)到細(xì)的亮環(huán)，各壁層的雙折射特性共同構(gòu)成了偏振光圖像中明暗交替的同軸圓環(huán)。各纖維帽中的細(xì)胞尺寸由導(dǎo)管附近至維管束外緣有變大的趨勢(shì)，且細(xì)胞壁層數(shù)也有增多的趨勢(shì)?？拷举|(zhì)部的細(xì)胞小，胞壁分層較少，多為單壁；而多壁層細(xì)胞主要分布在側(cè)方纖維帽外周，但在其他位置甚至是靠近后生木質(zhì)部導(dǎo)管處也有零星分布。纖維細(xì)胞在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，腔徑比逐漸減小，壁腔比逐漸增大?？拷举|(zhì)部和韌皮部處的直徑較小的纖維細(xì)胞最先成熟，細(xì)胞壁增至最大厚度[14]。

a.維管束PLM圖像(10×)(P為初生韌皮部，Px為原生木質(zhì)部，Mx為后生木質(zhì)部)； b. 側(cè)方纖維帽PLM圖像(20×)；c.側(cè)方纖維帽中間區(qū)域的纖維細(xì)胞(40×)；d. 側(cè)方纖維帽外圍靠近基本薄壁組織的細(xì)胞(60×)。

圖2 偏光顯微鏡下的毛竹纖維細(xì)胞

2.2 纖維細(xì)胞分類統(tǒng)計(jì)

為統(tǒng)計(jì)維管束中細(xì)胞壁的壁層分布特征，參考Gritsch和Murphy[15]提出的分類方法，根據(jù)厚壁層數(shù)將毛竹纖維細(xì)胞分為3種類型(圖3)。第一類為Ⅰ型單厚壁型，只有一層厚壁，僅觀測(cè)到一層較寬的黑環(huán)；第二類為Ⅱ型細(xì)胞，厚壁層數(shù)在2～4層范圍內(nèi)；第三類為Ⅲ型多厚壁細(xì)胞，這類細(xì)胞可觀察到超過(guò)4層的厚壁層。

與同類型細(xì)胞在電子顯微鏡下的壁層形貌對(duì)比發(fā)現(xiàn)，PLM與SEM的觀測(cè)結(jié)果一致，但前者效果更直觀。用常規(guī)方法制樣的竹塊，在電子顯微鏡下也能觀察到Ⅰ型和Ⅱ型的細(xì)胞形貌，但對(duì)于Ⅲ型細(xì)胞的尋找有難度。SEM樣品經(jīng)冷熱交替處理后，部分壁層間發(fā)生剝離，方能看到多壁層結(jié)構(gòu)；此外，由于不確定是否所有的壁層之間都完全發(fā)生剝離，因而無(wú)法準(zhǔn)確判斷細(xì)胞壁層數(shù)量。相比之下，通過(guò)PLM則獲得纖維細(xì)胞的外觀形態(tài)和結(jié)晶特征的圖像，且制樣相對(duì)簡(jiǎn)單，在合適的參數(shù)設(shè)置和高分辨率下，Ⅲ型細(xì)胞的多壁層結(jié)構(gòu)和相應(yīng)晶體特性可得到較好的體現(xiàn)。

將側(cè)方纖維帽分為3個(gè)區(qū)域，統(tǒng)計(jì)3種類型的纖維細(xì)胞在各區(qū)域的分布規(guī)律。如圖4所示，Ⅱ型細(xì)胞在圖中3個(gè)區(qū)域均有分布，在區(qū)域2中占主體。Ⅰ型單層厚壁細(xì)胞在韌皮部和木質(zhì)部附近分布最多，在其他區(qū)域也有極少量分布。Ⅲ型多壁層細(xì)胞主要集中在纖維帽的外緣，與少量Ⅱ型細(xì)胞共同構(gòu)成區(qū)域3。

3 結(jié)論與討論

毛竹材纖維細(xì)胞的PLM圖像特征很大程度上體現(xiàn)了纖維的外觀形態(tài)和整體結(jié)晶特性，以細(xì)胞厚壁層數(shù)對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行分類與統(tǒng)計(jì)，是對(duì)竹纖維細(xì)胞特征的一種簡(jiǎn)單直觀分析方法。3種類型纖維細(xì)胞在各區(qū)域內(nèi)的分布規(guī)律為：Ⅲ型多厚壁層細(xì)胞(壁層≥5)主要集中在纖維帽的外圍，但在其他位置甚至是靠近后生木質(zhì)部導(dǎo)管處也有零星分布。Ⅱ型細(xì)胞(壁層為2～4層)主要分布在區(qū)域2中，Ⅰ型單層厚壁細(xì)胞在韌皮部和木質(zhì)部附近分布最多。

a、b、c分別為類型Ⅰ、類型Ⅱ和類型Ⅲ的示意圖；d、e、f分別為類型Ⅰ、類型Ⅱ和類型Ⅲ的偏光顯微鏡圖像；g、h、i分別為類型Ⅰ、類型Ⅱ和類型Ⅲ的掃描電鏡圖像。

圖3 毛竹纖維細(xì)胞分類

圖4 側(cè)方纖維帽中各類型細(xì)胞的分布

相比其他能觀測(cè)到毛竹細(xì)胞壁多層結(jié)構(gòu)特征的工具而言，偏光顯微鏡使用便捷，制樣簡(jiǎn)單，竹纖維的整體結(jié)晶特性得到較好的體現(xiàn)。但是在對(duì)獲得的偏光顯微鏡圖片進(jìn)行后期處理與分析的過(guò)程中，對(duì)圖像清晰度與顏色呈現(xiàn)等有一定的要求，尤其是統(tǒng)計(jì)細(xì)胞類型時(shí)需要較高的圖像分辨率。本實(shí)驗(yàn)中，區(qū)域1由于細(xì)胞過(guò)于密集，部分的邊界清晰度不夠，給壁層識(shí)別與數(shù)量統(tǒng)計(jì)帶來(lái)一定難度。另外，研究與分類統(tǒng)計(jì)對(duì)象可以延伸至竹間不同部位的更多細(xì)胞。再者，對(duì)于樣品處理、偏光參數(shù)調(diào)整和選擇輔助波片等方面還須進(jìn)一步探討，對(duì)竹纖維縱切面以及基本組織中薄壁細(xì)胞的研究也有待深入。

[1] 江澤慧．世界竹藤[M]．北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2007:221-245.

[2] FEI B H, GAO Z M, WANG J, et al. Biological, anatomical, and chemical characteristics of bamboo[M]. New York: Academic Press,2016:283-306.

[3] PARAMESWARAN N, LIESE W. On the fine structure of bamboo fibres[J]. Wood Science Technology,1976,10(4):231-246.

[4] 安鑫,楊淑敏,劉嶸，等.基于SR-WAXS技術(shù)的竹材纖維素晶胞模型研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2016,36(11)：3704-3708.

[5] 阮錫根，江澤慧，陶靈虎.用結(jié)晶學(xué)的觀點(diǎn)研究纖維細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及形成機(jī)理[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001,29(2):1-3.

[6] 尹思慈，阮錫根，孫成志，等.應(yīng)用偏光顯微鏡測(cè)定木材纖維胞壁的纖絲角[J].林業(yè)科學(xué)，1986,22(2):209-212.

[7] 胡惠強(qiáng).采用偏振光顯微鏡定性分析聚酯類纖維[D].上海：東華大學(xué)，2014.

[8] 宋鈞才.偏振光測(cè)定棉纖維成熟度[J].纖維標(biāo)準(zhǔn)與檢驗(yàn)，1988(2):27-29.

[9] 裴繼誠(chéng)，楊淑蕙.植物纖維化學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2014:162-183.

[10] 張之翔.用電磁理論說(shuō)明各向異性晶體的基本光學(xué)現(xiàn)象[J].大學(xué)物理，2009,28(1):15-17.

[11] LIESE W. Research on bamboo[J]. Wood Science and Technology,1987,21(3):189-209.

[12] WAI N N， NANKO H， MURAKAMI K. A morphological study on the behavior of bamboo pulp fibers in the beating process[J]. Wood Science and Technology,1985,19(3):211-222.

[13] PARAMESWARAN N, LIESE W. Ultrastructural aspects of bamboo cells[J]. Cellulose Chemistry and Technology,1980,14:587-609.

[14] MURPHY R J, ALVIN K L. Fiber maturation in the bambooGigantochloascortechinii[J]. IAWA Journal,1997,18(2):147-156.

[15] GRITSCH C S, KLEIST G, MURPHY R J. Developmental changes in cell wall structure of phloem fibres of the bamboo Dendrocalamus asper[J]. Annals of Botany,2004,94(4):497-505.

Classifying Fiber Cells in Moso Bamboo with PLM//

Liu Rong

(International Center for Bamboo and Rattan, Beijing 100102, P. R. China);

An Xin

(Research Institute of Forestry, CAF);

Wei Penglian

(Guangxi University);

Fei Benhua

(International Center for Bamboo and Rattan)

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(8)：57-60,65.

The experiment was conducted to make an easy tryout in the characteristics of bamboo fiber cells research. Polarization light microscope (PLM) images of bamboo fiber cells were analyzed comparing with the morphology of multilayered cell wall structure by field-emission gun scanning electron microscope (FEG-SEM). A simple method of cell classification was proposed to compile statistics of regional distribution of each type of fiber cells, thus lateral fiber caps were divided into three categories and three regions, respectively, according to the number of thick wall layers of each cell.

Polarizing light microscope (PLM); Moso bamboo; Cell wall; Bamboo fiber; Cell classification

1)國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31370563)。

劉嶸，女，1988年6月生，國(guó)際竹藤中心，博士研究生。E-mail：rowan_lr@163.com。

費(fèi)本華，國(guó)際竹藤中心，研究員。E-mail：feibenhua@icbr.ac.cn。

2017年3月6日。

S781

責(zé)任編輯：戴芳天。