朱景樂

(國(guó)家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，鄭州，450003)

苗作云

(黃河科技學(xué)院)

張少偉

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院)

張明遠(yuǎn)

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院寒溫帶林業(yè)研究中心)

馬順興

(河南投資集團(tuán)有限公司)

3個(gè)觀賞型杜仲品種葉片生理特征的比較1)

朱景樂

(國(guó)家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，鄭州，450003)

苗作云

(黃河科技學(xué)院)

張少偉

(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院)

張明遠(yuǎn)

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院寒溫帶林業(yè)研究中心)

馬順興

(河南投資集團(tuán)有限公司)

以原陽(yáng)杜仲良種繁育圃的‘紅葉’杜仲(E.ulmoides‘Hongye’)、‘密葉’杜仲(E.ulmoides‘Miye’)、‘小葉’杜仲(E.ulmoides‘Xiaoye’)3個(gè)良種的2年生嫁接苗為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)葉片進(jìn)行顯微觀測(cè)，并測(cè)定了葉片色差值、植物色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葉片pH值，分析3個(gè)杜仲品種葉片的生理生化差異。結(jié)果表明：顯微鏡下觀測(cè)到‘紅葉’杜仲的正面含有大量的紅色細(xì)胞，其他品種均未觀測(cè)到紅色細(xì)胞；‘紅葉’杜仲的亮度(L值)為28.17、變紅度(a*值)為0.96、變黃度(b*值)為2.69，計(jì)算得到顏色指數(shù)為5.54，達(dá)到深紅級(jí)別；‘紅葉’杜仲品種葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)(wa)為1.100 9 mg·g-1、葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)(wb)為0.454 5 mg·g-1、類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(wcar)為0.445 5 mg·g-1、總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(wt)為1.555 4 mg·g-1、花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)(wA)為0.304 2 mg·g-1；葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.94 mg·g-1、果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.20 mg·g-1、蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.12 mg·g-1；pH值為5.90。方差分析表明：‘紅葉’杜仲葉片色差值、色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與其他品種間均存在顯著差異；但pH值、可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，3個(gè)品種間無(wú)差異。葉色差異的主要原因是色素種類及含量的不同。

杜仲；葉片生理特征；葉片顏色

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)樹種，也是分布范圍最廣的膠源植物[1]。除了具備極佳的藥用功能外，杜仲樹形優(yōu)美，病蟲害少，也是一種較好的園林綠化樹種。‘紅葉’杜仲(E.ulmoides‘Hongye’)是杜仲葉色突變體，是由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心于1996年從實(shí)生苗中選出的觀賞型杜仲良種之一[2]。其葉色鮮紅，花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于普通杜仲[3]。但是，關(guān)于‘紅葉’杜仲葉片生理生化特征及葉色形成機(jī)制的報(bào)道較少。本文以原陽(yáng)杜仲良種繁育圃的‘紅葉’杜仲、‘密葉’杜仲(E.ulmoides‘Miye’)和‘小葉’杜仲(E.ulmoides‘Xiaoye’)3個(gè)良種的2年生嫁接苗為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)對(duì)葉片生理生化指標(biāo)測(cè)定，分析影響杜仲葉片不同顏色的直接原因，旨在為后期新品種選育及配套高效栽培技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

3個(gè)良種的2年生嫁接苗‘紅葉’杜仲、‘密葉’杜仲、‘小葉’杜仲，取自原陽(yáng)杜仲良種繁育圃。每個(gè)品種各選擇生長(zhǎng)一致的單株3株，取其典型葉片進(jìn)行相關(guān)形態(tài)指標(biāo)及生理指標(biāo)測(cè)定。

葉片色差測(cè)定：使用CR2500型色差計(jì)(日本MINOLTA公司)測(cè)定葉片亮度(L值)、變紅度(a*值)、變黃度(b*)；每個(gè)葉片在避開葉脈處隨機(jī)選擇10個(gè)點(diǎn)，以其平均值作為該葉片平均值，3個(gè)葉片的平均值作為該單株的葉色值。利用a*、b*值計(jì)算色澤飽和度(C*)和色調(diào)角(θ)，C*=(a*2+b*2)/2，θ=arctan(b*/a*)。計(jì)算葉片顏色指數(shù)(I)，I=(180-θ)/(L*+C*)；采用紅色葡萄果實(shí)顏色指數(shù)的方法評(píng)價(jià)果實(shí)的外觀色澤，I<2為黃綠、2≤I<4為粉紅、4≤I<6為深紅、I≥6為藍(lán)黑[4]。

葉片正面顯微觀測(cè)：將葉片切成1 cm×1 cm小塊，使用OLYMPUS-BX51型光學(xué)顯微鏡在40倍下觀看呈色特征，并用RX100數(shù)碼相機(jī)拍照。

花色苷的測(cè)定：根據(jù)Rabino的方法(并加以改進(jìn))[5]測(cè)定。將新鮮葉片用清水洗凈去污，準(zhǔn)確稱量剪去葉脈的葉片0.1 g(精確到0.01 g)，研磨加入體積分?jǐn)?shù)為1%的HCl甲醇溶10 mL，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中5 h，不時(shí)搖蕩，取出過(guò)濾。體積分?jǐn)?shù)為1%的HCl甲醇溶液稀釋5倍后作為待測(cè)液。以體積分?jǐn)?shù)為1%的HCl甲醇溶液為對(duì)照，分別測(cè)定530、657 nm處吸光值；每個(gè)品種重復(fù)5次，每次以相同波長(zhǎng)下的2個(gè)吸光值的平均值進(jìn)行花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)(wA)計(jì)算。wA=(A530-0.25×A657)V/(W×1 000)，式中的A530為530 nm處的吸光值、A657為657 nm處的吸光值、V為提取液體積(單位為mL)、W為樣品鮮質(zhì)量(單位為g)。

葉綠素的測(cè)定：采用Fadeel的方法[6]測(cè)定葉綠素和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。稱量剪去葉脈后成熟葉片0.1 g(精確到0.01 g)，加入體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酮溶液10 mL，黑暗研磨后(4 000 r/min)離心10 min，然后取上清液用于測(cè)定445、644、662 nm處的吸光值；每個(gè)品種重復(fù)5次，每次以相同波長(zhǎng)下2個(gè)吸光值的平均值進(jìn)行光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算。

葉綠素a質(zhì)量分?jǐn)?shù)wa=(9.78×A662-0.99×A644)V/(W×1 000)；

葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)wb=(21.4×A644-4.65×A662)V/(W×1 000)；

總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)wt=wa+wb；

類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)wcar=(4.69×A445)V/(W×1 000)-0.268×(wa+wb)。

式中：A為在一定波長(zhǎng)下的吸光值；w為色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(單位為mg·g-1)；V為提取液體積(單位為mL)；W為樣品鮮質(zhì)量(單位為g)。

葉片中蔗糖、葡萄糖、果糖的測(cè)定：取整片葉子，研缽磨碎，純水定容100 mL，超聲提取1 h。采用ICS-3000離子色譜儀，AminoPac PA-10(2×250 mm)氨基酸分析柱，流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為濃度250 mmol/L的NaOH溶液。流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積25 μL。每個(gè)樣品進(jìn)行技術(shù)重復(fù)3次，以3次平均值作為可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

葉片pH值測(cè)定：根據(jù)馬樹華[7]測(cè)定葉片汁液pH值方法，取新鮮同位葉0.5 g，洗凈并晾干后剪碎研磨成勻漿，加蒸餾水30 mL，震蕩6 min后過(guò)濾，用MP522臺(tái)式酸度計(jì)測(cè)定其pH值。

數(shù)據(jù)處理：使用Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)杜仲品種葉片顏色的差異

由表1可見：方差分析結(jié)果，‘紅葉’杜仲L值和b*值，顯著低于‘密葉’杜仲和‘小葉’杜仲；而a*值和顏色指數(shù)，則顯著高于‘密葉’杜仲和‘小葉’杜仲?！t葉’杜仲的葉色a*值高于0，說(shuō)明其葉色偏紅；而其他無(wú)性系a*值均低于0，葉色均為綠色?！t葉’杜仲顏色指數(shù)為5.5，達(dá)到深紅的級(jí)別，而其他的無(wú)性系則在1.35～1.86，顯示為黃綠級(jí)別，從色差角度評(píng)價(jià)‘紅葉’杜仲與其他品種差別明顯。

表1 3個(gè)杜仲品種葉片色差值

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列數(shù)字后不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2.2 3個(gè)杜仲品種葉片顯微觀測(cè)的差異

‘紅葉’杜仲的葉片正面，在顯微鏡下放大40倍后發(fā)現(xiàn)，紅色細(xì)胞與綠色細(xì)胞相間排列，而‘小葉’杜仲、‘密葉’杜仲的葉片正面卻沒有觀測(cè)到紅色細(xì)胞。正是因?yàn)榧t綠細(xì)胞相間分布，才使得肉眼看到的‘紅葉’杜仲呈色與其他品種不同。

2.3 3個(gè)杜仲品種光合色素的差異

由表2可見：方差分析結(jié)果，‘小葉’杜仲wa、wt，顯著高于‘密葉’杜仲和‘紅葉’杜仲；3個(gè)杜仲品種wb，無(wú)顯著差異；‘紅葉’杜仲的wcar，顯著高于‘小葉’杜仲和‘密葉’杜仲。3個(gè)品種的wa/wb，‘小葉’杜仲顯著高于‘密葉’杜仲和‘紅葉’杜仲?！t葉’杜仲wA、wcar，顯著高于‘密葉’杜仲和‘小葉’杜仲；‘紅葉’杜仲的wA/wt為0.195 6、wcar/wt為0.286 6，顯著高于另外2個(gè)品種。由此結(jié)果可知，wA、wcar較高，且wA/wt和wcar/wt較大，是‘紅葉’杜仲葉片呈紅色的主要原因。

‘小葉’杜仲 ‘紅葉’杜仲 ‘密葉’杜仲

圖1 3個(gè)杜仲品種的顯微觀測(cè)(40倍)

杜仲wa/wbwt/wcarwcar/wt‘小葉’杜仲(2.82±0.23)b(4.64±0.51)b(0.2177±0.0272)a‘密葉’杜仲(2.53±0.11)a(4.29±0.52)b(0.2360±0.0312)a‘紅葉’杜仲(2.43±0.08)a(3.52±0.39)a(0.2866±0.0320)b

杜仲wcar/mg·g-1wA/mg·g-1wA/wt‘小葉’杜仲(0.3847±0.0166)a(0.1649±0.0138)a(0.0925±0.034)a‘密葉’杜仲(0.3634±0.0586)a(0.1408±0.0218)a(0.0917±0.021)a‘紅葉’杜仲(0.4455±0.0535)b(0.3042±0.0232)b(0.1956±0.026)b

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列數(shù)字后不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.4 3個(gè)杜仲品種葉片中可溶性糖和pH值

植物葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷合成有重要作用，而葉片pH值可對(duì)花色苷顏色產(chǎn)生影響。由表3可見：3個(gè)品種間的pH值和可溶性糖均無(wú)顯著差異，說(shuō)明葉片花色苷的呈色與這些條件無(wú)關(guān)，主要葉色差異的原因是色素種類及含量的差異。

表3 3個(gè)杜仲品種葉片可溶性糖和pH值測(cè)定結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

3 結(jié)論與討論

‘紅葉’杜仲的葉片正面在顯微鏡下放大40倍后發(fā)現(xiàn)，紅色細(xì)胞與綠色細(xì)胞相間排列，而‘小葉’杜仲與‘密葉’杜仲的葉片正面卻沒有觀測(cè)到紅色細(xì)胞。

葉片顏色是一個(gè)復(fù)合性狀，通過(guò)表色系統(tǒng)法可對(duì)葉片顏色進(jìn)行量化，增加了準(zhǔn)確性及可比性，在研究植物的葉色遺傳變異中發(fā)揮重要作用[8]。但該方法在植物葉片顏色測(cè)定中應(yīng)用尚為普及，國(guó)內(nèi)朱書香、葛雨萱等研究植物色素含量與葉色參數(shù)的關(guān)系中有所涉及[9-10]。本研究得到‘紅葉’杜仲的葉片色差值與其他品種存在極顯著差異，其葉片顏色指數(shù)為5.5，可以達(dá)到深紅級(jí)別，而其他品種均為綠色級(jí)別。

3個(gè)品種間的pH值和可溶性糖均無(wú)顯著差異，說(shuō)明葉片花色苷的呈色與這些條件無(wú)關(guān)，主要葉色差異的原因是色素種類及含量的差異。本研究與龐秋穎等[11]在槭樹屬研究得到樹冠外圍的葉片花色素苷顯著高于樹冠內(nèi)部，但二者間的細(xì)胞液pH值及可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)則沒有顯著差異的結(jié)果類似。彭少兵等[3]研究得到，在8—9月份，紫葉杜仲葉片細(xì)胞液pH值均大于綠葉杜仲葉片細(xì)胞液pH值，而可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與花色素苷相關(guān)性不強(qiáng)。

植物葉片最終呈色，與葉綠素、類胡蘿卜素及花色苷等質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著的正相關(guān)關(guān)系；普通葉片呈現(xiàn)綠色或黃色，是由于葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)所占比例不同；而紅(紫)色植物葉色中起決定性作用的呈色物質(zhì)，是花色苷[12]。本文研究得到，‘紅葉’杜仲的wA和wcar較高，且wA/wt和wcar/wt也分別高于其他品種，此為‘紅葉’杜仲葉色特殊的直接原因。

[1] 李芳東，杜紅巖.杜仲[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2001.

[2] 杜紅巖，胡文臻，俞銳.杜仲產(chǎn)業(yè)綠皮書：中國(guó)杜仲橡膠資源與產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告[M].北京：中國(guó)社會(huì)文獻(xiàn)出版社，2013.

[3] 彭少兵，張春賀，任利益，等.紫葉杜仲葉色變異研究[J].浙江林業(yè)科技，2013，33(3)：61-66.

[5] RABINO I， MANCINELLI A L. Light， temperature， and anthocyanin production[J]. Plant Physiology，1986，81(3)：922-924.

[6] Fadeel A A. Location and properties of chloroplasts and pigment determination in roots[J]. Physiologia Plantarum，1962，15(1)：130-146.

[7] 馬樹華.四種北方闊葉樹苗木對(duì)汽車尾氣污染的生理反應(yīng)及抗性評(píng)價(jià)[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2004.

[8] 李保會(huì)，張芹，史寶勝，等.不同葉齡七葉樹葉片面積、葉色及主要物質(zhì)含量變化研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30(5)：32-35.

[9] 葛雨萱，王亮生，周肖紅，等.香山黃櫨葉色和色素組成的相互關(guān)系及時(shí)空變化[J].林業(yè)科學(xué)，2011，47(4)：38-42.

[10] 朱書香，楊建民，王中華，等.4種李屬彩葉植物色素含量與葉色參數(shù)的關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào)，2009，29(8)：1663-1669.

[11] 龐秋穎，卓麗環(huán).槭樹樹冠秋季變色過(guò)程中葉片生理指標(biāo)的空間差異[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35(6)：16-17，20.

[12] 陳璽中.全紅楊呈色物質(zhì)機(jī)理研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

Leaf Physiological Characteristics of Three OrnamentalEucommiaulmoidesOliver Varieties//

Zhu Jingle

(Paulownia Forestry Research and Development Centre, State Forestry Administration, Zhengzhou 450003, P. R. China);

Miao Zuoyun

(Huanghe Science and Technology College);

Zhang Shaowei

(Henan Vocational College of Agriculture);

Zhang Mingyuan

(Research Center of Cold Temperate Forestry, CAF);

Ma Shunxing

(Henan Investment Group Corporation Ltd.)

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(8)：10-13.

With the leaves ofEucommiaulmoides‘Hongye’,E.ulmoides‘Miye’ andE.ulmoides‘Xiaoye’ of two-year-old grafted saplings cultured in a nursery in Yuanyang, under a microtelescope, we studied the leaf physiological characteristics including the chromatic aberration value, pigment content, soluble sugar content and pH value. There were a large number of red cells on the front ofE.ulmoides‘Hongye’ leaf while there was no red cell on the other two varieties. Sluminance (L value) ofE.ulmoides‘Hongye’ was 28.17. Its redness degree (a*value) was 0.96, and the yellowness degree (b*value) was 2.69. The color index of ‘Hongye’ was 5.54, which was in crimson level. The content of chlorophyll a (wa) inE.ulmoides‘Hongye’ leaf was 1.100 9 mg·g-1, that of chlorophyll b (wb) was 0.454 5 mg·g-1, carotenoid content (wcar) was 0.445 5 mg·g-1, and total chlorophyll content (wt) was 1.555 4 mg·g-1. The contents of anthocyanins (wA), glucose, fructose, and sucrose were 0.304 2, 2.94, 1.20, and 2.12 mg·g-1, respectively. The pH value was 5.90. According to variance analysis, the chromatic aberration value and pigment content were significantly different betweenE.ulmoides‘Hongye’ and other varieties while there was no significant difference of pH value and soluble sugar content among three varieties. The leaf color difference among the three varieties could be explained by the difference of pigment types and contents.

EucommiaulmoidesOliver; Leaf physiological characteristics; Leaf color

1)中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院中央級(jí)公益性科研院所基本業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(CAFYBB2014QA037)；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(162102110090)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD21B0502)。

朱景樂，男，1982年5月生，國(guó)家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，副研究員。E-mail：zhujingle1982@126.com。

張明遠(yuǎn)，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院寒溫帶林業(yè)研究中心，工程師。E-mail：sourplum@163.com。

2017年4月24日。

S718.4

責(zé)任編輯：張 玉。