張雪梅 姚文靜 趙凱 姜廷波 周博如

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱,150040)

楊樹NAC7轉(zhuǎn)錄因子基因應(yīng)答鹽脅迫表達(dá)1)

張雪梅 姚文靜 趙凱 姜廷波 周博如

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱,150040)

從小黑楊中克隆915 bp的NAC7轉(zhuǎn)錄因子基因(Potri.007G099400.1)cDNA，其編碼304氨基酸，該蛋白屬熱穩(wěn)定性較高的親水性蛋白。用RT-qPCR分析楊樹鹽脅迫條件下NAC7基因表達(dá)情況，表明該基因?qū)}脅迫具有應(yīng)答反應(yīng)，且基因主要在根部表達(dá)?？寺～@得1 062 bp的NAC7基因啟動子DNA序列，其中含有許多脅迫應(yīng)答元件，其驅(qū)動的GUS報告基因主要集中在根中表達(dá)，而在莖和葉中的表達(dá)很少，這個結(jié)果與NAC7基因表達(dá)進行RT-qPCR分析結(jié)果一致。

小黑楊；基因表達(dá)；啟動子；轉(zhuǎn)錄因子；鹽脅迫

植物的基因表達(dá)調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯調(diào)控和翻譯后調(diào)控等多種調(diào)控方式。順式作用元件與轉(zhuǎn)錄因子互作的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。轉(zhuǎn)錄因子也稱為反式作用因子，對下游基因的表達(dá)起著至關(guān)重要的作用，植物轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的不同可分為WRKY、bZIP、EIL、MYB、NAC、GATA、AP2/ERF、SBP等轉(zhuǎn)錄因子家族[2]。其中，NAC轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的且為最龐大的一類轉(zhuǎn)錄因子[3-5]，其命名來源于NAM(noapicalmeristem)、ATAF1/2 和CUC2(cup-shapedcotyledon)3個基因的首字母[6]。該家族基因的N端含有NAC結(jié)構(gòu)域的高度保守氨基酸序列，絕大多數(shù)基因含有1個NAM結(jié)構(gòu)域[7]；C端是具有高度多樣性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，能轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制活性。NAC轉(zhuǎn)錄因子能直接參與或通過調(diào)控參與干旱、高鹽應(yīng)答基因的表達(dá)，在植物處于非生物逆境脅迫時發(fā)揮重要作用[8]?；虻膯幼游挥诮Y(jié)構(gòu)基因5'端上游，能特異識別結(jié)合RNA聚合酶，并啟動下游基因的表達(dá)[9-10]，是基因工程研究中表達(dá)載體的重要組成部分[11-12]。植物啟動子包括組成型、誘導(dǎo)型和組織特異型3種類型，在植物轉(zhuǎn)基因育種中廣泛應(yīng)用[13]。因此，研究基因表達(dá)特性及其啟動子特點為明確目的基因功能具有重要意義。為探明NAC7(Potri.007G099400.1)基因應(yīng)答鹽脅迫的表達(dá)特點，本研究用RT-PCR從小黑楊(Populussimonii×P.nigra)中克隆NAC7基因cDNA片段，用RT-qPCR分析了NAC7基因在鹽脅迫條件下的相對表達(dá)量變化。并用PCR擴增了NAC7基因上游啟動子區(qū)DNA，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時侵染和組織化學(xué)染色鑒定NAC7啟動子在擬南芥中的活性。為明確NAC7基因在楊樹抗逆中的生物功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

試驗材料為培養(yǎng)1個月的小黑楊組培苗，在60%～70%相對濕度、14 h光/10 h暗、平均溫度25 ℃條件下，在水中繼續(xù)培養(yǎng)1個月后分為24組，每3組施以1種處理。分別用水(對照組)和0.15 mol/L NaCl處理0、3、6、9、12、24和36 h后，分別將樣本的根、莖、葉-80 ℃保存，用于后續(xù)RNA提取和基因表達(dá)分析，所有處理和對照均包含3個生物重復(fù)。

1.1PnsNAC7基因表達(dá)的RT-qPCR分析

利用柱式植物RNA提取試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司，中國)提取總RNA。RT-qPCR反應(yīng)：用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa公司，大連，中國)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將合成的cDNA用無菌水稀釋100倍，作為后續(xù)實時定量PCR的模板。實時定量PCR在ABI7500熒光PCR儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上進行。根據(jù)楊樹數(shù)據(jù)庫中NAC7(Potri.007G099400.1)基因cDNA序列，設(shè)計引物NAC7-F：5’-GCAGCAGCAGCAAGAACAAGCAGC-3’和NAC7-R：5’-GCCACTGGGCACACATCAAGAACC-3’。以ACT、EF1為內(nèi)參，根據(jù)參考文獻(xiàn)合成引物，所有引物均由上海生物工程有限公司合成。實時定量PCR反應(yīng)體系和基因相對表達(dá)量計算參照本實驗室前期研究方法。

1.2 啟動子序列克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

用植物基因組DNA提取試劑盒提取小黑楊葉片DNA，根據(jù)Phytozome[14](https://phytozome.jgi.doe.gov/jbrowse/)毛果楊基因組序列設(shè)計正反向引物，NACPro-F：5’-GTCCACGACATCCAAAACCC-3’和NACPro-R:5’-CGTTCTTGGTGCTTTTCTTC-3’,以小黑楊DNA為模板進行PCR擴增。將目的DNA片段進行克隆，送到上海生物公司測序。將啟動子DNA片段克隆到pBI121植物表達(dá)載體,替換其中的35S啟動子構(gòu)建NACPro植物表達(dá)載體。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染擬南芥幼苗，以GUS基因為報告基因，通過組織化學(xué)染色分析NAC7基因啟動子的活性。

1.3 基因和啟動子的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast對PnsNAC7基因序列以及推測的編碼蛋白進行同源序列比對，并利用MEGA(Version 5.2)進行進化樹的構(gòu)建，將NAC7基因轉(zhuǎn)錄因子蛋白氨基酸序列放入ExPaSy在線Protparam軟件(http://web/expasy/org/protparam/)進行分析，獲得該基因蛋白分子量和等電點等理化屬性，并利用Gene Structure Display Server分析該基因的結(jié)構(gòu)。用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)及PlantCARE(http://bioinfor matics.psb.ugent.be/wetools/plantcare/html/)對擴增的PnsNAC7基因啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進行分析，預(yù)測其主要的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1PnsNAC7基因的生物信息學(xué)分析

通過RT-PCR從小黑楊中獲得NAC7基因cDNA編碼區(qū)長度為915 bp，編碼304氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為34.99 Ku，等電點為6.33，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為45.91，脂肪系數(shù)為60.39，其平均疏水性為-0.772。說明該蛋白的熱穩(wěn)定性較高，為親水性蛋白。NAC7基因含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，其中第一個內(nèi)含子中具有HSE熱脅迫應(yīng)答元件和TC-rich repeats脅迫應(yīng)答元件，可能在脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用(圖1)。

圖1 Pns NAC7基因結(jié)構(gòu)圖

小黑楊PnsNAC7與其他物種NACs氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，PnsNAC7與毛果楊(Populustrichocarpa)、胡楊(Populuseuphratica)、木薯(Manihotesculenta)、蓖麻(Ricinuscommunis)NACs氨基酸序列的同源性較高，同源性達(dá)79%～99%。而與毛葡萄(Vitisquinquangularis)、咖啡(Coffeacanephora)、大豆(Glycinemax)和芝麻(Sesamumindicum)NACs氨基酸序列的同源性較低，同源性均在70%以下(圖2)。

2.2 鹽脅迫條件下NAC7基因的相對表達(dá)量

RT-qPCR結(jié)果表明，NAC7基因在楊樹的莖和葉中表達(dá)量極少，主要集中在根中表達(dá)，經(jīng)過鹽脅迫處理后，在莖和葉中的應(yīng)答不顯著，而在根中隨著脅迫時間增長，NAC7基因的相對表達(dá)量越來越大，處理12 h時表達(dá)量達(dá)到最大值，高達(dá)118.358倍，12 h之后其表達(dá)量呈現(xiàn)減少的趨勢(表1)。以上結(jié)果表明NAC7基因表達(dá)對鹽脅迫在具有明顯的應(yīng)答反應(yīng)，且主要在根部應(yīng)答鹽脅迫，該可能在楊樹應(yīng)答過程中起著重要的作用。

表1 鹽脅迫處理后根中NAC7基因的RT-qPCR檢測

注：表中數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3 NAC7啟動子序列分析

以小黑楊的DNA為模板，以NACPro-F和NACPro-R為特異性引物進行PCR擴增，獲得長度為1 062 bp的NAC7啟動子片段。利用PLACE和Plant CARE軟件分析結(jié)果表明，該啟動子序列具有基本轉(zhuǎn)錄元件如核心元件TATA-box和控制轉(zhuǎn)錄效率及頻率的CAAT-box,另外還有AE-box、G-box和G-Box等光響應(yīng)元件， TGACG-motif茉莉酸甲酯應(yīng)答元件和GARE-motif赤霉素響應(yīng)元件以及乙烯響應(yīng)元件ERE、脫落酸響應(yīng)元件ABRE等(表2，圖3)。

圖2 小黑楊PnsNAC7基因系統(tǒng)進化樹分析

元件名稱核心序列元件功能ABRETACGTG脫落酸響應(yīng)元件AE-boxAGAAACAT/TACAAAGA光響應(yīng)元件G-BoxCACGTT光響應(yīng)元件G-boxCACGAC/CGTGAA光響應(yīng)元件BoxTTTCAAA光響應(yīng)元件EREATTTCAAA乙烯響應(yīng)元件GARE-mo-tifAAACAGA赤霉素響應(yīng)元件TGA-ele-mentAACGAC生長素應(yīng)答元件CircadianCAACAATATC參與晝夜節(jié)律調(diào)控的順式作用元件Box-W1TTGACC病菌響應(yīng)元件MBSCGGTCAMYB結(jié)合位點TGACG-motifCGGTCA茉莉酸甲酯應(yīng)答元件CAAT-boxCAAAT/CCAAT/CAAT增強子區(qū)域普通順式作用元件TATA-boxTATA啟動子核心元件

2.4 擬南芥的瞬時表達(dá)

用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥組培苗，通過組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，GUS活性在根、莖、葉中均有表達(dá)，但其活性主要集中在根部，葉中和莖中少量表達(dá)(圖4)，表明NAC7基因啟動子活性具有組織特異性，其轉(zhuǎn)錄活性主要集中在植物根部，這個結(jié)論與NAC7基因的RT-qPCR結(jié)果一致。

A、B為培養(yǎng)3周擬南芥染色結(jié)果；A.pBI121-NACPro7侵染、B.未侵染的擬南芥(陰性對照)；C、D為培養(yǎng)5周擬南芥染色結(jié)果；C.pBI121-NACPro7侵染、D.未侵染的擬南芥(陰性對照)。

圖4 瞬時轉(zhuǎn)化擬南芥GUS組織化學(xué)染色

3 結(jié)論與討論

本研究從小黑楊中克隆的NAC7基因?qū)Ω啕}脅迫具有應(yīng)答反應(yīng)，并且具有組織特異性，該基因主要在根中具有鹽脅迫應(yīng)答效應(yīng)。NAC7基因的這個表達(dá)特點是由其啟動子特點決定的。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥瞬時侵染轉(zhuǎn)化和GUS組織化學(xué)染色證明，NAC7啟動子驅(qū)動下的GUS活性在根、莖、葉中均有表達(dá)，但其活性主要集中在根部，在莖中和葉中少量表達(dá)，這與NAC7定量分析結(jié)果一致。生物信息學(xué)分析表明，NAC7蛋白質(zhì)為親水性、熱穩(wěn)定性較高的蛋白，其啟動子中含有許多脅迫應(yīng)答元件，說明NAC7基因可能在楊樹抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

楊樹作為林木中的“擬南芥”[15]，具有適應(yīng)能力強、抗寒、抗旱、耐鹽堿等生物學(xué)特性[16]，也是重要的造林樹種和綠化樹種，鑒定楊樹抗逆基因和誘導(dǎo)型啟動子對利用基因工程改良楊樹抗逆性具有重要作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，其中很多成員對非生物脅迫具有應(yīng)答反應(yīng)，柑橘在低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫條件下NAC83基因呈現(xiàn)出差異性的表達(dá)[17]；番茄的SlNAC80的表達(dá)受低溫、干旱、高鹽和ABA的誘導(dǎo)，基因的誘導(dǎo)表達(dá)與啟動子區(qū)的順式作用元件密切相關(guān)[18]；茄子SmNAC1可能參與低溫和高鹽脅迫的耐受調(diào)節(jié)過程[19]；擬南芥NAC家族蛋白ANAC019和ANAC055可能作為轉(zhuǎn)錄激活因子來調(diào)控茉莉酸誘導(dǎo)表達(dá)[20]。啟動子是調(diào)控基因表達(dá)的順式作用開關(guān)，也是基因工程表達(dá)載體的一個重要元件，對基因調(diào)控具有重要意義[21-22]。如胡楊PeSCL7啟動子包含許多與抗逆相關(guān)的功能元件[23]，馬鈴薯SGT3基因上游2 449 bp的啟動子具有光調(diào)控相關(guān)的元件[24]，谷子膜結(jié)合NAC家族基因SiNAC啟動子參與生長素、甲基茉莉酸和氧化脅迫應(yīng)答[25]等等。本研究利用生物信息學(xué)的方法分析了NAC7基因的物理化學(xué)性質(zhì)，并通過鹽脅迫處理楊樹克隆了NAC7轉(zhuǎn)錄因子基因，以GUS基因為報告基因構(gòu)建了植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時侵染法處理擬南芥幼苗，確定了NAC7基因在根莖葉中的表達(dá)情況，為研究NAC7基因的鹽脅迫分子機制和耐鹽功能提供了依據(jù)。

[1] MICHAEL UDVARDI K, KLEMENTINA KAKAR, MAREN WANDREY, et al. Legume Transcription Factors: Global Regulators of Plant Development and Response to the Environment[J]. Plant Physiology,2007,144(2) 538-549.

[2] KASUGA MIE, QIANG LIU, SETSUKO MIURA, et al. Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor[J]. Nature Biotechnology,1999,17(3):287-291.

[3] ADDIE NINA OLSEN, HEIDI A ERNST, LEILA LO LEGGIO, et al. NAC transcription factors: structurally distinct, functionally diverse[J]. Trends in Plant Sci,2005,10(2):79-87.

[4] HISAKO OOKA, KOUJI SATOH, KOJI DOI, et al. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativa and Arabidopsis thaliana[J]. DNA Research,2003,10: 239-247.

[5] DUVAL M, HSIEH T, KIM S, et al. Molecular characterization of AtNAM: a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily[J]. Plant Molecular Biology,2002,50(2):237-248.

[6] HEIDI A ERNST, ADDIE NINA OLSEN, KAREN SKRIVER, et al. Structure of the conserved domain of ANAC, a member of the NAC family of transcription factors[J]. EMBO Reports,2004,5(3)：297-303.

[7] AIDA M, ISHIDA T, FUKAKI H, et al. Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant[J]. Plant Cell,1997,9(6):841-857.

[8] 孫利軍，李大勇，張慧娟,等.NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病和抗非生物脅迫反應(yīng)中的作用[J].遺傳，2012,34(8)：993-1002.

[9] 朱玉賢，李毅.現(xiàn)代分子生物學(xué)[M].2版.北京：高等教育出版社，2002.

[10] 王靜澄，李昊，崔東清.毛白楊PtSEP3-1基因啟動子的克隆分析及其表達(dá)載體構(gòu)建[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010,29(2)：239-244.

[11] 李姍姍，遲彥，李凌飛，等.啟動子克隆方法研究進展[J].中國生物工程雜志，2005,25(7)：9-16.

[12] BENFEY P N, REN L, CHUA N H. Combinatorial and synergistic properties of CaMV 35S enhancer subdomains[J]. The EMBO Journal,1990,9(6):1685-1696.

[13] 魏晶，毛偉華，林擁軍，等.一個新水稻組成型啟動子的克隆與功能鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012,31(2)：139-146.

[14] JINPU J, HE Z, LEI K, et al. PlantTFDB 3.0: a portal for the functional and evolutionary study of plant transcription factors[J]. Nucleic Acids Research,2014,42(Database issue):1182-1187.

[15] 林元震，張志毅，郭海，等.楊樹葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)基因啟動子的克隆與分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009,28(3)：445-449.

[16] 姚葉，唐琪，李江艷，等，楊樹基因啟動子的克隆及功能研究進展[J].山東林業(yè)科技，2012,42(5)：122-124.

[17] 郭文芳，劉德春，楊莉，等，柑橘抗逆基因NAC83的克隆與表達(dá)[J].園藝學(xué)報，2015,42(3)：445-454.

[18] 劉輝，王濤濤，張俊紅，等，番茄NAC轉(zhuǎn)錄因子SlNAC80的克隆及表達(dá)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2015,30(1)：77-83.

[19] 邵帥，徐嶺賢，王紹輝，等，茄子SmNAC1基因的克隆與表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報，2014,41(5)：975-984.

[20] QINGYUN BU, HONGLING JIANG, CHANG BAO LI, et al. Role of the Arabidopsis thaliana NAC transcription factors ANAC019 and ANAC055 in regulating jasmonic acid-signaled defense responses[J]. Cell Research,2008,18(7):756-767.

[21] 杜皓，丁林云，何曼林，等.受多逆境誘導(dǎo)表達(dá)的GhWRKY64基因啟動子克隆與功能分析[J].作物學(xué)報，2015，41(4)：593-600.

[22] 楊曉娜，趙昶靈，李云，等.啟動子序列克隆和功能分析方法的研究進展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010,25(2)：283-290.

[23] 馬洪雙，夏新莉，尹偉倫.胡楊SCL7基因及其啟動子片段的克隆與分析[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011,33(1)：1-10.

[24] 崔同霞，白江平，魏桂民，等.馬鈴薯SGT3基因表達(dá)及其啟動子功能分析[J].草業(yè)學(xué)報，2014，23(2)：196-206.

[25] SWATI PURANIK, RANJIT PRASAD BAHADUR, PREM S, et al. Molecular cloning and characterization of a membrane associated NAC family gene, SiNAC from foxtail millet[Setariaitalica(L.) P. Beauv.][J]. Mol Biotechnol,2011,49(2):138-150.

Expression Analysis ofNAC7 Transcription Factor Gene fromPopulussimonii×P.nigrain Response to Salt Stress//

Zhang Xuemei, Yao Wenjing, Zhao Kai, Jiang Tingbo, Zhou Boru

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(8)：6-9，13.

The 915 bp cDNA fragment ofNAC7 transcription factor gene (Potri.007G099400.1) was cloned fromPopulusnigra, which encodes 304 amino acids. The expression analysis ofNAC7 gene in poplar under salt stress by RT-qPCR showed that the gene had response to salt stress. The 1 062 bp DNA fragment ofNAC7 gene promoter was cloned, which contained many stress responsive elements, theGUSgene driven byNAC7 gene promoter mainly expressed in root, while the expression was rarely in leaves and stems, and the result was consistent with RT-qPCR ofNAC7 gene.

Populussimonii×P.nigra; Gene expression; Promoter; Transcription factor; Salt stress

張雪梅，女，1991年11月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail:1608901012@qq.com。

周博如，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)),副教授。E-mail:boruzhou@yahoo.com。

2017年3月20日。

S722.3+6

1)國家“863”課題(2013AA102701)。

責(zé)任編輯：潘 華。