金榮 鄔超 王文藝 鄧明琴 楊曉紅

·論 著·

維吾爾族飼鴿者肺患者外周血Notch4基因甲基化分析

金榮1鄔超2王文藝2鄧明琴2楊曉紅2

目的 通過檢測維吾爾族飼鴿者肺外周血Notch4基因甲基化程度探討其臨床意義。方法 根據(jù)納入及排除標(biāo)準連續(xù)收集2015-2016年在新疆喀什病例資料及血樣標(biāo)本(總納入60例，其中20例確診維吾爾族飼鴿者肺患者為病例組，同期20例維吾爾族飼養(yǎng)鴿子未發(fā)病者為陰性對照組，同期20例維吾爾族未飼養(yǎng)鴿子健康體檢者為正常對照組。對所收集血樣標(biāo)本進行常規(guī)提取DNA，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，PCR 擴增，體外轉(zhuǎn)錄和 RNase A特異性酶切，并行基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)檢測Notch4基因甲基化情況。結(jié)果 檢測Notch4片段的CpG位點總數(shù)6個(CpG_1，CpG_2/3，CpG_4，CpG_ 5，CpG_6)，CpG_1,CpG_ 4，CpG_ 5，CpG_ 6在三組樣本中的甲基化率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CpG_2/3在三組樣本甲基化率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。病例組CpG_2/3甲基化率高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，病例組與陰性對照組CpG_2/3甲基化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 Notch4基因甲基化通過炎癥反應(yīng)及信號通路調(diào)控肺纖維的發(fā)生發(fā)展。

Notch4基因；飼鴿者肺；DNA甲基化；維吾爾族

飼鴿者肺(PBL)是外源性過敏性肺泡炎(EAA)的一種，由于鴿子的糞便、羽毛等蛋白成分被吸入人體后，肺組織對此產(chǎn)生的強烈的免疫反應(yīng)而引發(fā)的肺泡炎[1]。研究發(fā)現(xiàn)與遺傳及免疫相關(guān)聯(lián)的HLA(人類白細胞抗原)在本病的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用[2]。HLA中的HLA Ⅲ類基因所編碼的蛋白產(chǎn)物和非經(jīng)典的基因所編碼的蛋白產(chǎn)物則與炎癥應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。作為新近定義的Notch4基因，它在 HLA-Ⅲ區(qū)域著絲粒末端成長，屬于 Notch中的成員之一。有研究證實Notch4在肺纖維化、肺損傷、變異性鼻炎的形成及發(fā)展過程中起重要作用。同時，PBL發(fā)病依賴于宿主吸入鴿子羽毛、皮屑等脫落物后[3[4]，其中Notch信號通路可能是參與調(diào)控的關(guān)鍵因素[5]。PBL作為一種免疫介導(dǎo)的肺纖維化損傷的EAA，和Notch相關(guān)研究密不可分，可能的機制為其編碼的分子的重要生物學(xué)功能與纖維化、炎癥應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。前期我們用Illumina 法對4例維吾爾族PBL患者和4例維吾爾族飼養(yǎng)鴿子未發(fā)病者進行了全基因組甲基化初篩分析，發(fā)現(xiàn)PBL患者Notch4基因存在異常甲基化，現(xiàn)我們擴大樣本量對維吾爾族PBL患者外周血Notch4進行甲基化分析。

資料與方法

一、研究對象

連續(xù)收集2015 -2016年在新疆喀什有鴿子接觸史，確診的PBL患者20例為病例組，其中男11例，女9例，平均年齡(52.72±12.45)歲，以上患者均符合HP的診斷標(biāo)準。目前較常用的是Schuyler等[6]學(xué)者提出的過敏性肺炎的診斷標(biāo)準作為PBL的診斷參考。選取同期20例維吾爾族有鴿子接觸史未發(fā)病者為陰性對照組，其中男8例，女12例，平均年齡(53.27±14.22)歲；選取同期20例維吾爾族無鴿子接觸史健康體檢者為正常對照組，其中男10例,女10例,平均年齡(53.13±11.03)歲。3組之間性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.097，P=0.091；F=0.016，P=0.984)。所有受試者均簽署經(jīng)新疆區(qū)醫(yī)院倫理委員會(編號：2012048)認證的知情同意書。

二、資料收集

受試者均接受問卷調(diào)查，內(nèi)容包括：性別、年齡、種族、吸煙史、鴿子接觸史(接觸時間、飼養(yǎng)種類、數(shù)量)等，既往史及家族史。

三、實驗方法

1 DNA制備：采用QIAGEN公司的DNA抽提試劑盒，嚴格按照試劑盒操作說明進行。取上 1 μg DNA樣本，配置0.8%瓊脂糖凝膠，以條帶不小于20kb，且電泳的主條帶無明顯降解視為合格基因組DNA 電泳；另用DNA分光光度計質(zhì)檢，合格樣本為A260/A280=1.7-2.1，且總量不小于 2μg。質(zhì)檢合格的樣品，將DNA濃度調(diào)整為75ng/μL，并于-20℃儲存?zhèn)溆?見圖1)。

圖1 DNA提取圖

2 重亞硫酸鈉修飾：DNA采用美國ZYMO公司生產(chǎn)的DNA甲基化試劑盒，嚴格按照試劑盒操作說明進行。

3 檢測Notch4基因：查閱UCSC數(shù)據(jù)庫，Notch4基因位點的代碼是cg00366603，該實驗的引物設(shè)計是由Sequenom公司Epidesigner完成的，其網(wǎng)址是http://www.epidesigner.com。一般情況下只擴增200bp-600bp大小的片段。為了平衡PCR反應(yīng)條件和后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄(IVT)，該實驗采取了在正反兩個方向分別加入了相應(yīng)的引物，其中正向引物為5’端加入10mer tag，反向引物為5’端加入T7-Promoter序列。Sequenom生物公司合成已完成設(shè)計的引物，其中我們所研究的Notch4基因即cg00366603的引物具體如下所示：

檢測Notch4基因片段長度：318bp

檢測Notch4基因片段序列：

CTGCCCTTCTAAGCCTGGGGACATGGGGACCATGAGGGCTGTGGCTCAGCCAGGTCTGCCTGGGAGACCTGTGTTCTAGAATCGGCCCTGCTCCTGACTTGCCCCACTCAGGCGGTCCTCCCCCGAGGTGCTGTCTGCATGGGGTTGAATAAGATGAACCCTGAGGCCCTGCTGCTTCGCAGTGTGTGGCCCTGCTCCTTGAGGTGTGAAAGGCCAGGGAACAGGGTGCTTGCTGGGGACCTGCGGGAGGACTACAAGGCTTTCTGGTGGCCATTCCTGTGTATACAGAGGGCGGGGCTCACCAGGGCAGGCTGATCA

該序列共有6個CpG位點(即CpG_1，CpG_2/3，CpG_4，CpG_ 5，CpG_6)，本實驗研究共檢測了此6個CpG位點

表1 Notch4基因的PCR引物

PCR擴增采用SEQUENOM公司生產(chǎn)的PCR擴增試劑盒。設(shè)置PCR擴增的程序如下：起始：94℃，12 分鐘；循環(huán)1：93℃，50秒； 62℃，48秒； -0.5℃/cycle； 72℃，1 分鐘；上述總共循環(huán)10次，循環(huán)2：94℃，45秒； 56℃，48秒； 72℃，1 分鐘；上述總共循環(huán)35次最后：72℃，3分鐘； 4℃，forever，運行以上的PCR程序。PCR擴增程序完成后，配置2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，以質(zhì)檢擴增的結(jié)果。

4 堿性磷酸酶處理(Alkaline phosphatase, SAP)：采用SEQUENOM公司生產(chǎn)的MassCLEAVE Kit試劑盒，嚴格按照試劑盒操作說明進行。

5 體外轉(zhuǎn)錄 (invitro transcription，IVT) 和RNase酶切：采用SEQUENOM公司生產(chǎn)的MassCLEAVE Kit試劑盒，嚴格按照試劑盒操作進行。

6 芯片點樣及質(zhì)譜檢測使用：MassARRAYNanodispenser RS1000點樣儀將純化后產(chǎn)物點至384格式的SpectroCHIP芯片上，使用MassARRAY Compact System (SEQUENOM)進行檢測點制好的芯片。SpectroCHIP芯片使用的是MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)，然后使用EpiTYPER軟件(SEQUENOM)檢測數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)和輸出結(jié)果。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。運用Kruskal-Wallis檢驗方法對三組的甲基化率進行比較，檢驗水準采用α=0.05，即為當(dāng)P<0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。運用Mann-Whitney 檢驗方法進行三組間的兩兩比較時，因重復(fù)多次的假設(shè)檢驗將增大犯第一類錯誤的概率，因此需校正檢驗水準，校正檢驗水準α’=0.017，即P<0.017為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、甲基化結(jié)果

本次實驗共檢測Notch4等12個基因片段，聚類圖如下，由綠色至紅色表示甲基化程度逐漸增加，綠色代表甲基化程度為“0”，即非甲基化，紅色代表甲基化程度為“1”，即完全甲基化，中間不同顏色代表不同的甲基化水平。由圖可見研究對象間顏色參差不齊，表示基因甲基化程度存在差異。本文主要研究Notch4基因的甲基化水平，(見圖2)。

二、甲基化結(jié)果的比較

檢測Notch4片段的CpG位點總數(shù)6個(CpG_1，CpG_2，CpG_3，CpG_4，CpG_ 5，CpG_6)，CpG_1，CpG_ 4，CpG_ 5，CpG_ 6在三組樣本中的甲基化率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CpG_2/3在三組樣本甲基化率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，病例組CpG_2/3甲基化率高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但病例組與陰性對照組CpG-2/3甲基化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，陰性對照組與正常對照組CpG-2/3甲基化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05，結(jié)果(見表2，3)。

表2 Notch4基因甲基化率三組中位數(shù)(P50)及四分位間距(P25，P75)

圖2 Notch4等12個基因片段聚類圖

表3 Notch4甲基化率結(jié)果

A表示病例組，B表示陰性對照組，V表示正常對照組。

討 論

PBL是敏感個體長期反復(fù)接觸鴿子糞便、羽毛等外源性抗原后出現(xiàn)的變態(tài)反應(yīng)性疾病[7]，其發(fā)病的分子生物學(xué)機制可能與DNA甲基化相關(guān)表遺傳學(xué)機制有關(guān)。一項針對愛鴿俱樂部人員的調(diào)查發(fā)現(xiàn)飼養(yǎng)鴿子者過敏性肺炎的患病率約為8%-30%[8]。HLA基因甲基化與過敏性哮喘、SLE等多種自體免疫失衡性疾病有關(guān)系，同時有研究HLA-Ⅲ類基因某些位點甲基化，如HSP70基因的甲基化[7]可能會使HLA-Ⅲ類基因與炎癥應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，從而導(dǎo)致某些遺傳或過敏性疾病的產(chǎn)生和持續(xù)發(fā)展。同時，HP是一種間質(zhì)性肺病，肺間質(zhì)疾病的共同結(jié)局為肺纖維化[8]。我們知道PBL患者血清及肺泡灌洗液Th1相關(guān)因子過度表達，巨噬細胞被通過分泌IFN-γ及TNF-α活化的Th1進一步激活，而Notch信號通路在巨噬細胞激活、Th1/Th2失衡等方面均扮演著重要角色[9]。同時，大量針對哮喘的研究顯示，Notch信號在哮喘發(fā)病中有密切相關(guān)的作用[10],其主要參與T細胞的Th2反應(yīng)，進一步調(diào)節(jié)在哮喘發(fā)病中的促進作用。Notch4蛋白是HLA-Ⅲ類基因的一種Ⅰ類跨膜蛋白，有研究證實Notch4影響早期肺發(fā)育，主要表達于氣道上皮細胞中，在肺組織受高氧、炎癥、氣壓傷等不良因素刺激時，可為肺損傷提供依據(jù)[11]。近期也有研究證實Notch4轉(zhuǎn)錄是被糖皮質(zhì)激素受體與轉(zhuǎn)錄激活蛋白共同作用引起的[12]，這與糖皮質(zhì)激素在PBL的治療中的療效可能有關(guān)。Notch4在血管內(nèi)皮細胞中表達，在血管形成的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中也是關(guān)鍵因素之一[13]，Miniati等[14]發(fā)現(xiàn)通過激動血管內(nèi)皮細胞中 Notch4會導(dǎo)致肺血管動靜脈分流。同時Notch4蛋白通過參與TGF-β信號通路在肺纖維化中起到作用[15]。目前研究得出PBL中部分基因存在甲基化和去甲基化現(xiàn)象，包括HLA-A 基因，但仍缺乏Notch4基因甲基化的相關(guān)報道。

本研究采用MALDI-TOF手段檢測Notch4基因甲基化狀態(tài)，檢測Notch4片段的CpG位點總數(shù)6個。病例組甲基化率高于正常對照組甲基化率，結(jié)果顯示CpG_2/3在三組樣本甲基化率分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果表明：接觸鴿子分泌排泄物后可能提高Notch4基因CpG2/3位點基因甲基化水平，而該位點基因的甲基化水平提高會導(dǎo)致相應(yīng)基因表達發(fā)生異常，影響遺傳物質(zhì)的表觀遺傳學(xué)改變。我們知道Th1/Th2平衡失調(diào)在哮喘及PBL的發(fā)病過程中均起著非常重要的作用。有研究表明, 在支氣管哮喘模型組，Notch各亞型在肺組織中均有表達，但在T 細胞中Notch4幾乎無相應(yīng)的表達，說明可在肺發(fā)育中起作用的Notch4在外周T淋巴細胞的發(fā)育及分化中則無相應(yīng)的作用[16]，這與本項研究PBL患者Notch4異常低甲基化不相符，這是否與哮喘在Th2中占優(yōu)勢而PBL是在Th1高表達相關(guān)呢，我們分析也許PBL特異性位點的甲基化有利于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，從而激活基因轉(zhuǎn)錄，Notch4基因啟動子區(qū)甲基化可能促進Notch4基因表達，從而使Th1/Th2免疫應(yīng)答向Th1偏移。該研究還發(fā)現(xiàn)病例組與陰性對照組CpG-2/3甲基化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明在眾多的抗原接觸者中，遺傳易感性對于本病有重要作用。結(jié)合Notch4的作用及該課題的研究，我們分析Notch4在PBL中的發(fā)病機制可能通過以下作用：可能機制之一是肺纖維化的發(fā)生發(fā)展可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、信號通路等被進一步調(diào)控；過量纖維化的內(nèi)臟器官可被微血管異常、免疫異常激活所引起。其次個體長時間、高頻率、高強度的碰觸到鳥禽類家畜或者寵物的分解代謝產(chǎn)物后可以導(dǎo)致周圍細支氣管遠端、肺泡囊管以及肺泡壁組織發(fā)生超敏免疫反應(yīng)而形成EAA或HP。我們考慮若在減緩或逆轉(zhuǎn)肺纖維化的進程中通過一些手段干預(yù)Notch4基因甲基化，是否能為肺纖維化的治療提供新的方向尚需進一步探索，同時本研究可以引導(dǎo)我們進一步研究Notch4基因CpG2/3位點的甲基化過程機制，使其成為新的藥物作用靶點，隨著研究的深入，進一步闡明Notch信號通路在疾病中的分子機制，Notch4作為新的藥物靶點具有廣闊的應(yīng)用前景。

因PBL患病率低，發(fā)病原因復(fù)雜多樣，存在的診斷偏差也不可忽視，同時本研究納入的樣本量也較少，故本實驗初步明確了Notch4基因啟動子區(qū)甲基化位點，為進一步建立PBL中Notch4基因CPG位島甲基化圖譜奠定了基礎(chǔ)，對確定Notch4甲基化水平以及甲基化位點，從而找到治療PBL新的靶點具有指導(dǎo)作用。

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Methylation analysis of Notch4 gene in peripheral blood of Uygur patients with pigeon breeder’s lung

JINRong,WUChao,WANGWen-yi,DENGMing-qin,YANGXiao-hong

SchoolofMedicineofShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832002,China

Objective To detect Notch4 methylation status of peripheral blood in Uygur patients with Pigeon breeder’s lung and to explore its clinical significance. Methods The data and blood samples were enrolled as described in Kashi Prefecture from 2015 to 2016. 60 subjects included 20 cases of Uygur Pigeon breeder’s lung as the case group, 20 cases of healthy people in Uygur feeding pigeons and 20 cases of healthy people in Uygur not feeding pigeons as the control group. All the blood samples were given conventional DNA extraction, bisulfite conversion, PCR amplification, transcription in vitro and RNase A specific enzyme cut, and parallel matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry mass spectrometry technique was used to detect Notch4 gene methylation status. Results There was no significant difference in the detection of Notch4 fragment at CPG_1, CpG_4, CpG_5, or CpG_6 among the three groups (P>0.05), but it showed significance at CpG_2/3 among the three groups (P<0.05). The methylation rate of CpG2/3 of Uygur feeding pigeons lung patients and healthy Uygur people feeding pigeons was higher than the control group (P<0.05). There was no difference in the methylation rate of CpG2/3 between the Uygur feeding pigeons lung patients and the healthy Uygur people feeding pigeons (P>0.05). Conclusion Notch4 gene methylation can control the occurrence of lung fiber development by inflammation and signaling pathways.

Notch4 gene; pigeon breeder’s lung; DNA methylation; Uighur

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.09.001

國家自然科學(xué)基金項目(No 81260003)

1. 832002 新疆 石河子，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 2. 830000 新疆 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

楊曉紅，E-mail：yxh6176@126.com

2016-12-07]