王祎，湯繼華，付延磊，許恒，譚金芳,2，韓燕來(lái)*

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南鄭州450002；2河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002；3省部共建小麥玉米國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002）

不同氮水平下玉米苗期根系形態(tài)和氮吸收量的QTL定位

王祎1,2,3，湯繼華3，付延磊1，許恒3，譚金芳1,2，韓燕來(lái)1,2,3*

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南鄭州450002；2河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450002；3省部共建小麥玉米國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450002）

【目的】玉米的根系形態(tài)與氮素吸收能力關(guān)系密切，利用單片段代換群體對(duì)玉米苗期根系形態(tài)相關(guān)性狀和植株氮吸收量進(jìn)行QTL定位，可為進(jìn)一步精細(xì)定位并克隆控制玉米低氮下優(yōu)異根系形態(tài)和氮吸收的主效QTL奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳缘什町愶@著的兩親本許178和綜3構(gòu)建的150個(gè)玉米單片段代換系(SSSL)群體作為研究材料，進(jìn)行水培試驗(yàn)。以Ca(NO3)2作為氮源，設(shè)置高氮(4mmol/L NO3–)和低氮(0.05mmol/L NO3

–)兩個(gè)處理，培養(yǎng)20d后分根、冠收獲植株，測(cè)定生物量和氮含量。通過(guò)WinRHIZO根系分析系統(tǒng)獲得根系的總根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根直徑和根尖數(shù)等指標(biāo)。根據(jù)代換系與親本許178表型值的T-test結(jié)果，利用該群體SSR遺傳連鎖圖譜，在P≤0.001條件下定位所調(diào)查性狀的QTL?！窘Y(jié)果】高氮條件下SSSL群體除了根直徑與總根長(zhǎng)和根尖數(shù)沒(méi)有顯著相關(guān)性以外，其它各性狀之間均顯著或極顯著正相關(guān)，并且植株氮吸收量也與根系各性狀呈顯著或極顯著正相關(guān)；低氮條件下，除了根直徑以外，植株氮吸收量與其他根系性狀均呈極顯著正相關(guān)，并且地上部和根部氮累積量均與根表面積的相關(guān)性最大。在高氮條件下共檢測(cè)到102個(gè)QTL位點(diǎn)，包括40個(gè)根形態(tài)相關(guān)QTL、34個(gè)植株生物量QTL和28個(gè)氮吸收量QTL；在低氮條件下共檢測(cè)到85個(gè)QTL位點(diǎn)，包括47個(gè)根形態(tài)QTL、22個(gè)植株生物量QTL和16個(gè)氮吸收量QTL。所檢測(cè)到的根形態(tài)相關(guān)QTL與生物量和氮積累量QTL成簇存在，同一QTL區(qū)間多同時(shí)檢測(cè)到根形態(tài)QTL和氮吸收量QTL。高氮條件下，在代換系1428、1376、1282、1266和1473的代換區(qū)間上檢測(cè)到高氮特異的QTL簇，同時(shí)包括多個(gè)根形態(tài)和氮吸收量QTL，貢獻(xiàn)率從–43%到84%。低氮下，在代換系1419和1314的代換區(qū)間上同時(shí)檢測(cè)到低氮特異的多個(gè)根形態(tài)和氮吸收量QTL，貢獻(xiàn)率從–32%到55%?！窘Y(jié)論】單片段代換系1419和1314所包含的代換片段bnlg182—bnlg2295和umc1013—umc2047檢測(cè)到多個(gè)低氮特異的QTL，并且這兩個(gè)區(qū)間在前人的研究中均有玉米氮效率相關(guān)QTL檢測(cè)到，說(shuō)明該區(qū)間包含有玉米根系形態(tài)和氮吸收量的主效QTL，在玉米氮高效吸收中可能起重要作用。

玉米；單片段代換系；根系形態(tài)；QTL；低氮脅迫

玉米是全球最重要的多用途作物之一，廣泛應(yīng)用于糧食、飼料、化工、生物能源等行業(yè)。為保證國(guó)家糧食安全，我國(guó)在《國(guó)家糧食安全中長(zhǎng)期規(guī)劃綱要》中明確提出到2020年需要新增糧食1000億斤，其中需要新增玉米650億斤，占全國(guó)新增糧食的65%，因此玉米在我國(guó)未來(lái)糧食生產(chǎn)中的地位舉足輕重。我國(guó)玉米高產(chǎn)育種已取得了重大成就，超高產(chǎn)記錄不斷突破。不容忽視的是，目前的玉米高產(chǎn)記錄都是高肥高水條件下獲得，同樣為提高玉米產(chǎn)量，我國(guó)農(nóng)田的氮肥投入量大、氮肥利用率低，不但嚴(yán)重制約我國(guó)玉米產(chǎn)量和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的進(jìn)一步提高，而且成為導(dǎo)致河流和湖泊富營(yíng)養(yǎng)化的重要因素之一[1]。因此，提高玉米的氮素利用率、培育氮高效品種，從而在適當(dāng)降低施氮量的條件下維持較高產(chǎn)量水平，對(duì)實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境保護(hù)意義重大[2]。

研究表明，在玉米籽粒形成中54.5%～60.6%的氮來(lái)自營(yíng)養(yǎng)體的再運(yùn)轉(zhuǎn)[3]。因此，植株前期氮吸收效率對(duì)于后期提高玉米籽粒產(chǎn)量至關(guān)重要。植物主要通過(guò)根系從外界吸收礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，有效的根系形態(tài)對(duì)培育氮吸收高效的玉米基因型、減少氮淋失非常重要[4]。許多研究表明，增加根系體積，包括根干重、根長(zhǎng)和根密度，可以提高玉米氮吸收能力和籽粒產(chǎn)量[5–6]。玉米的根系形態(tài)受土壤有效氮含量的強(qiáng)烈影響，植株通過(guò)改變根系形態(tài)更有效地從土壤中獲取氮素營(yíng)養(yǎng)。在低氮條件下，玉米的節(jié)根數(shù)目減少、總根長(zhǎng)增加，而在氮充足的土壤側(cè)根易發(fā)生和伸長(zhǎng)[7–8]。因此，可以利用玉米根系形態(tài)對(duì)土壤氮水平響應(yīng)的可塑性來(lái)提高玉米的氮吸收效率。目前數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)作圖已成為研究復(fù)雜性狀遺傳位點(diǎn)甚至確定候選基因的有力工具。許多與玉米氮效率相關(guān)性狀的QTL已經(jīng)被定位，包括氮吸收效率、氮利用效率[9]、花后氮吸收、氮再利用[1]，以及氮同化、代謝等性狀[9]。同樣，諸多控制玉米根系形態(tài)的QTL也在不同的群體中被定位和分析[10–14]。但是，這些研究多數(shù)都是對(duì)正常生長(zhǎng)條件下玉米根系形態(tài)相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位，對(duì)低氮脅迫下玉米根系形態(tài)相關(guān)性狀的QTL定位相對(duì)缺乏。

劉宗華等[15]前期研究結(jié)果表明，在大田不施氮肥條件下，綜3的產(chǎn)量降低了54%，而許178的產(chǎn)量?jī)H降低了1.2%，表明許178對(duì)低氮脅迫不敏感，而綜3對(duì)低氮脅迫表現(xiàn)敏感。本研究以綜3為供體親本，許178為輪回親本構(gòu)建的染色體單片段代換系(single segment substitution lines,SSSLs)[16]作為研究材料，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)對(duì)群體在高氮和低氮條件下根系形態(tài)相關(guān)性狀，以及氮吸收量的QTL進(jìn)行了定位。研究分析了低氮脅迫下玉米苗期根形態(tài)與氮吸收效率之間的遺傳機(jī)制，為通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇培育低氮下具有優(yōu)異根系形態(tài)的玉米基因型提供參考。

1 材料與分析

1.1 供試材料

以綜3為供體親本、許178為受體親本，經(jīng)過(guò)4個(gè)世代回交和3個(gè)世代自交，結(jié)合SSR分子標(biāo)記輔助選擇，共獲得了239份純合的單片段代換系材料，SSSL平均代換片段長(zhǎng)度為47.67cM，導(dǎo)入片段總長(zhǎng)11394.22cM，覆蓋玉米基因組67.6%[15]。利用其中的150個(gè)單片段代換系進(jìn)行玉米苗期不同氮水平下根系形態(tài)QTL檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合各株系表型值及片段所在位置，對(duì)相應(yīng)根系形態(tài)QTL進(jìn)行初步定位。

1.2 幼苗培養(yǎng)

取150個(gè)單片段代換系及親本各30粒飽滿完整的種子，以10%H2O2浸泡消毒30min，蒸餾水沖洗3～4次，置于濕潤(rùn)的紗布上催芽，然后移入干凈的石英砂中育苗，光照培養(yǎng)室日間溫度為25℃，夜間溫度為20℃。用蒸餾水培養(yǎng)至兩葉，挑取發(fā)育健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗共12株，分別移入低氮和高氮營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)，每個(gè)氮水平6株。幼苗定植于穿孔直徑為2cm、厚0.5cm的塑料板上，用海綿固定幼苗，培養(yǎng)容器采用黑色方形塑料盒(38cm×28cm× 12cm)，每盆培養(yǎng)幼苗12株，內(nèi)盛營(yíng)養(yǎng)液10L，3天更換一次營(yíng)養(yǎng)液。營(yíng)養(yǎng)液配方參考文獻(xiàn)[17]，具體如下：Ca(NO3)2·4H2O2mmol/L；K2SO40.75mmol/L；MgSO4·7H2O0.65mmol/L；KCl：0.1mmol/L；KH2PO40.25mmol/L；H3BO30.001mmol/L；MnSO4·H2O 0.001mmol/L；CuSO4·5H2O0.0001mmol/L；ZnSO4·7H2O0.001mmol/L；(NH4)6MoO24·4H2O5× 10–6mmol/L；FeSO4·7H2O0.1mmol/L；Na2EDTA 0.1mmol/L；CaCl22mmol/L(低氮處理時(shí)加入，用以補(bǔ)平Ca離子濃度)。其中低氮處理氮濃度為0.05 mmol/L，高氮水平含氮4mmol/L，共培養(yǎng)20天。

1.3 根系性狀的測(cè)定

培養(yǎng)20天后，每個(gè)重復(fù)取生長(zhǎng)一致的4株幼苗，蒸餾水沖洗干凈，用剪刀剪下根系，WinRHIZO根系分析系統(tǒng)分別測(cè)定單株玉米的總根長(zhǎng)(TRL,cm)、根尖數(shù)(RTN)、根體積(RV,cm3)、根表面積(RSA, cm2)、根直徑(RAD,mm)。將新鮮根和莖葉分別置于105℃烘箱殺青30min，然后80℃烘干，測(cè)定地上部干重(SDW)、根干重(RDW)。

1.4 氮含量的測(cè)定

植株烘干粉碎后，采用H2SO4–H2O2進(jìn)行消化，通過(guò)流動(dòng)注射儀測(cè)定氮含量。植株氮累積量計(jì)算：

地上部氮累積量(SNU，mg)=地上部干重(g)×地上部氮含量(mg/g)；

根氮累積量(RNU，mg)=根部干重(g)×根部氮含量(mg/g)。

1.5 QTL 定位

利用SPSS19.0軟件對(duì)各染色體片段代換系和雙親本根系相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將輪回親本的觀察值作為對(duì)照，通過(guò)方差分析和T檢驗(yàn)比較各SSSL與許178之間的差異，以P≤0.001時(shí)，認(rèn)為該代換片段上有相關(guān)QTL存在；當(dāng)P>0.001時(shí)，認(rèn)為在該代換片段上沒(méi)有相關(guān)QTL的存在[18]。參照Eshed和Zamir的方法[19]估算各QTL的加性效應(yīng)值和加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率，加性效應(yīng)值=(SSSL表型值–許178表型值)/2，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率=加性效應(yīng)值/許178表型值×100%。

QTL命名遵循Mc Couch等[20]制定的原則，QTL名稱中前面的字母為鑒定性狀的英文詞首的縮寫(xiě)，第1個(gè)數(shù)字為QTL所在染色體的編號(hào)，第2個(gè)數(shù)字為該性狀在該染色體上的QTL序號(hào)。

1.6 QTL 代換作圖

參照Paterson等[20]的方法，如果在含有重疊代換片段的不同染色體片段代換系中同時(shí)檢測(cè)到同一性狀的QTL，且遺傳效應(yīng)方向一致，則認(rèn)為該QTL存在于代換片段的重疊區(qū)段上；如果在一個(gè)染色體片段代換系中檢測(cè)到QTL的存在，而在代換片段具有重疊關(guān)系的另一個(gè)染色體片段代換系中未檢測(cè)到，則認(rèn)為該QTL位于這2個(gè)代換系代換片段的非重疊區(qū)段上。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel2010和SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 高氮 (HN) 和低氮 (LN) 水平下許 178 和綜 3的根系形態(tài)Fig. 1 Root morphology of Xu178 and Zong3 under high and low nitrogen conditions

表1 不同氮水平下親本各表型值和雙因素顯著性分析Table 1 Mean values and significance of two-factor ANOVA analysis for the nine traits in the parents

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮水平下親本和 SSSL 群體各表型性狀值分析

高氮條件下，親本許178和綜3的根系形態(tài)并沒(méi)有顯著差異，但是低氮脅迫顯著增加了許178的根長(zhǎng)，其根系遠(yuǎn)大于綜3(圖1)，表明在低氮條件下許178具有明顯的根系優(yōu)勢(shì)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，高氮下兩親本除了根尖數(shù)有顯著差異外，其他根系性狀均無(wú)顯著差異(表1)。低氮條件下，氮高效親本許178的生物量顯著高于綜3，并且許178的根系性狀(總根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根直徑和根尖數(shù))大于綜3，最終導(dǎo)致許178植株總氮吸收量是綜3的2.3倍。對(duì)親本9個(gè)性狀進(jìn)行雙因素主效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，除了根直徑外，其他8個(gè)性狀氮水平的主效應(yīng)差異均達(dá)到顯著或極顯著差異，而兩親本的基因型差異在總根長(zhǎng)、根表面積和根體積上沒(méi)有達(dá)到顯著水平，但是除了根直徑外，氮水平和基因型的交互作用在兩親本間的差異均達(dá)到顯著或極顯著水平(表1)。

在兩個(gè)氮水平下，SSSL群體的9個(gè)性狀均表現(xiàn)連續(xù)變異，接近正態(tài)分布(表2)。這些性狀的變異系數(shù)從5.6%～33.9%。根直徑的變異系數(shù)較小，其他性狀的變異系數(shù)均大于20%。在兩個(gè)氮水平下，每個(gè)性狀均觀察到超親現(xiàn)象。在SSSL群體中，基因型對(duì)9個(gè)性狀的主效應(yīng)作用均達(dá)到顯著或極顯著差異。除了根干重外，氮水平及其與基因型的交互作用對(duì)其他8個(gè)性狀的作用均達(dá)到顯著水平。這些結(jié)果表明，研究所選用的SSSL群體對(duì)氮脅迫敏感，并且群體基因型差異性顯著，有利于我們利用該群體對(duì)根性狀和氮吸收相關(guān)QTL進(jìn)行定位和進(jìn)一步深入分析。

2.2 不同氮水平下 SSSL 群體各表型性狀的相關(guān)性分析

高氮條件下SSSL群體除了根直徑與總根長(zhǎng)和根尖數(shù)沒(méi)有顯著相關(guān)性以外，其它各性狀之間均呈顯著或極顯著正相關(guān)，并且各根系性狀與植株生物量均呈極顯著正相關(guān)，植株氮吸收量也與根系各性狀呈顯著或極顯著正相關(guān)(表3)。在低氮條件下，根直徑與總根長(zhǎng)、根表面積、地上部生物量之間均沒(méi)有顯著相關(guān)性，其他根系性狀之間均顯著相關(guān)。此外，低氮條件下，除了根直徑，植株氮吸收量與其他根系性狀均呈極顯著正相關(guān)性。在兩個(gè)氮水平下，均是根體積與根表面積的相關(guān)性最大(高氮條件r= 0.913，P<0.001；低氮條件r=0.927，P<0.001)。高氮條件下，地上部氮累積量與根表面積相關(guān)性最高，根系氮累積量則與根體積的相關(guān)性最高，而在低氮條件下，地上部和根系氮累積量均與根表面積的相關(guān)性最大。

表2 不同氮水平下 SSSL 群體各表型值和雙因素顯著性分析Table 2 Mean values and significance of two-factor ANOVA analysis for the nine traits in the SSSL population

2.3 不同氮條件下玉米根系形態(tài) QTL 分析

通過(guò)QTL代換作圖，對(duì)SSSL群體檢測(cè)到的根系形態(tài)QTL進(jìn)行分析。高氮水平下，在P≤0.001條件下共檢測(cè)到40個(gè)根系形態(tài)QTL，其中8個(gè)總根長(zhǎng)QTL，7個(gè)根表面積QTL，4個(gè)根直徑QTL，10個(gè)根體積QTL和11個(gè)根尖數(shù)QTL(表4)?？偢L(zhǎng)QTL主要分布在第1、3、5、7、9和10號(hào)染色體，第1染色體最多，其中qhnTRL1b表現(xiàn)為負(fù)向加性效應(yīng)，其余均表現(xiàn)為正向加性效應(yīng)。代換系1306包含的qhnTRL1c加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率最大(59.8%)。檢測(cè)到根表面積QTL與總根長(zhǎng)類似，僅有一個(gè)QTL表現(xiàn)負(fù)向加性效應(yīng)，其余均為正向，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為–23.5%～83.7%。檢測(cè)到的根直徑QTL的數(shù)量最少，均為正向加性效應(yīng)，貢獻(xiàn)率從14.1%～17.4%。檢測(cè)到的根體積的QTL均為正向加性效應(yīng)，且加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率很高，介于79.4%～125.1%，這表明在高氮水平下綜3片段的導(dǎo)入可能有利于代換系獲得更大的根系體積。與其他根系性狀不同，檢測(cè)到的10個(gè)根尖QTL中有9個(gè)表現(xiàn)負(fù)向加性效應(yīng)，貢獻(xiàn)率為–23.2%～–36.5%，只有qhnRTN7a為正向加性效應(yīng)。

低氮水平下，通過(guò)QTL代換作圖，在P≤0.001條件下共檢測(cè)到47個(gè)根系形態(tài)QTL，其中10個(gè)總根長(zhǎng)QTL，5個(gè)根表面積QTL，5個(gè)根直徑QTL，12個(gè)根體積QTL和15個(gè)根尖數(shù)QTL(表5)。其中檢測(cè)到的總根長(zhǎng)和根表面積QTL與高氮條件類似，

多為正向加性效應(yīng)，各有一個(gè)QTL為負(fù)向加性效應(yīng)。與高氮條件不同，低氮下檢測(cè)到的根直徑QTL均為負(fù)向加性效應(yīng)，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為–5.0%～–8.9%。低氮下檢測(cè)到的根尖數(shù)QTL多為正向加性效應(yīng)，僅qlnRTN4b表現(xiàn)為負(fù)向加性效應(yīng)，并且加性效應(yīng)的貢獻(xiàn)率低于高氮條件，這可能與低氮脅迫下植物根系的適應(yīng)性反應(yīng)有關(guān)。檢測(cè)到的12個(gè)根體積QTL中有3個(gè)為負(fù)向加性效應(yīng)，其中在第1染色體檢測(cè)到5個(gè)QTL。

表3 群體各表型性狀在高氮水平 (對(duì)角線上方) 和低氮水平 (對(duì)角線下方) 的 Pearson 相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson’s correlation coefficients between the traits under high N (above diagonal) and low N conditions (below diagonal) in the SSSL population

表4 高氮下玉米 SSSL 群體的根系形態(tài) QTL 及其效應(yīng)值Table 4 QTL location of the maize root morphology in the SSSL population under the high nitrogen condition

續(xù)表4Table4continued

2.4 不同氮條件下生物量 QTL 分析

高氮條件下，通過(guò)QTL代換作圖在P≤0.001時(shí)，SSSL群體共檢測(cè)到20個(gè)地上部干重QTL和14個(gè)根干重QTL(表6)。20個(gè)地上部干重QTL分布在除第8染色體的其余9條染色體上。其中qhnSDW1b表現(xiàn)為負(fù)向加性效應(yīng)，其余QTL均表現(xiàn)為正向加性效應(yīng)，單個(gè)QTL的加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為–40.1%～88.3%。14個(gè)根干重QTL分布在除第2、8染色體外的其他8條染色體上，其中有4個(gè)表現(xiàn)負(fù)向加性效應(yīng)，其他10個(gè)QTL為正向加性效應(yīng)。單個(gè)QTL的加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為–10.2%～42.8%。

低氮條件下，通過(guò)QTL代換作圖，在P≤0.001條件下共檢測(cè)到22個(gè)生物量QTL，地上部干重QTL和根干重QTL均為11個(gè)(表7)。其中地上部干重QTL有6個(gè)分布在第1染色體，其余分布在第3、4、5、7和10號(hào)染色體上，加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為–24.5%～59.9%，qlnSDW5的加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率最高。與地上部干重QTL分布情況類似，檢測(cè)到的根干重QTL也有5個(gè)分布于第1染色體，其余分布在第2、3、4、5和7號(hào)染色體上，單個(gè)QTL的加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為–19.2%～48.4%。

2.5 不同氮條件下植株氮累積量 QTL 分析

高氮條件下，通過(guò)QTL代換作圖，在P≤0.001條件下共檢測(cè)到13個(gè)地上部氮累積量QTL和15個(gè)根部氮累積量QTL(表8)。這些QTL中只有qhnSNU1b和qhnRNU1a表現(xiàn)為負(fù)向加性效應(yīng)。除第3和第8染色體外，其余染色體均檢測(cè)到地上部氮累積量QTL，單個(gè)QTL的加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為–42.7%～60.9%。根部氮累積量的QTL則在10條染色體上均有分布，其中第1和9染色體分別檢測(cè)到3個(gè)QTL，這些QTL的加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率為–35.5%～71.7%。

低氮條件下，共檢測(cè)到6個(gè)地上部氮累積量QTL和10個(gè)根部氮累積量QTL(P≤0.001)(表9)。6個(gè)地上部氮累積量QTL均為正向加性效應(yīng)，并且3個(gè)位于第1染色體上，單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率為33.2%～55.2%。檢測(cè)到的10個(gè)根部氮累積量QTL中有6個(gè)表現(xiàn)負(fù)向加性效應(yīng)，4個(gè)為正向加性效應(yīng)，單個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率為–27.3%～33.8%。

2.6 QTL 在染色體上的分布

兩個(gè)氮水平下檢測(cè)到的QTL在染色體上的分布如圖2所示。結(jié)果顯示，所檢測(cè)到的根系性狀和氮吸收相關(guān)QTL在玉米的10條染色體上均有分布，其中第1染色體上的QTL數(shù)目最多，第2和第8染

色體上的QTL數(shù)目最少。對(duì)低氮和高氮下分別檢測(cè)到的QTL進(jìn)行分析可以得到不同氮條件下的特異性QTL。有些染色體區(qū)間僅能在低氮水平下檢測(cè)到QTL，例如第1染色體bnlg182—bnlg2295(代換系1419的代換區(qū)間)和umc1013—umc2047(代換系1314的代換區(qū)間)區(qū)間。包含這些染色體片段的代換系很有可能只控制低氮條件下的根系形態(tài)，有利于我們發(fā)掘低氮特異的QTL。同樣，圖2結(jié)果也顯示在有些染色體區(qū)段僅檢測(cè)到高氮條件下QTL，例如，第1染色體phi001—bnlg182(bin1.03，代換系1428的代換區(qū)間)，umc1122—umc2396(bin1.06，代換系1376的代換區(qū)間)，第6染色體bnlg1043—umc1883(代換系1282的代換區(qū)間)，第9染色體的umc2078—umc1636(代換系1238的代換區(qū)間)，以及第10染色體的umc1077—umc2350(代換系1473的代換區(qū)間)。這些代換系在低氮條件下未檢測(cè)到QTL，我們將其定義為高氮特異的QTL。這兩類QTL為氮環(huán)境特異性QTL，說(shuō)明在不同氮條件下玉

米有不同的代謝機(jī)制。其余的QTL區(qū)間均同時(shí)檢測(cè)到高氮和低氮條件下的QTL。此外，從QTL在染色體上的分布可以看出，玉米氮吸收相關(guān)的QTL區(qū)間均能檢測(cè)到根系形態(tài)相關(guān)的QTL，說(shuō)明玉米根系形態(tài)與其氮吸收能力密切相關(guān)(圖2)。

表5 低氮下玉米 SSSL 群體的根系形態(tài) QTL 及其效應(yīng)值Table 5 QTL location of the root morphology in the SSSL population under the low nitrogen condition

表6 高氮條件下玉米苗期生物量 QTL 及其效應(yīng)Table 6 QTL location of plant biomass in the SSSL population under the high nitrogen condition

3 討論

玉米已成為我國(guó)種植面積最大的農(nóng)作物，但是目前其高產(chǎn)和超高產(chǎn)依賴大量的氮肥施用。如何提高玉米的氮肥利用率、減少肥料投入、保護(hù)環(huán)境已成為玉米高產(chǎn)高效的研究熱點(diǎn)和亟待解決的問(wèn)題。植物對(duì)土壤中氮素的獲取很大程度上取決于其根系形態(tài)[22]。研究者通過(guò)對(duì)不同基因型玉米進(jìn)行研究提出了玉米氮高效吸收的理想根系形態(tài)，即通過(guò)增加根體積，包括根干重、根長(zhǎng)和根密度，提高玉米氮吸收能力和籽粒產(chǎn)量[8,23]。研究表明玉米的根系形態(tài)受到土壤中有效氮含量影響，在缺氮條件下玉米節(jié)根數(shù)目降低，但是總根長(zhǎng)增加[7]。玉米通過(guò)這種根系形態(tài)的改變從土壤中獲取更多的氮素，用于植株的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究結(jié)果也顯示，在低氮條件下，代換系玉米幼苗莖葉的生物量與總根長(zhǎng)、根表面積、根體積、根尖數(shù)呈極顯著相關(guān)性，而與根直徑之間的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。并且，低氮下植株氮吸收量與總根長(zhǎng)、根表面積、根體積和根尖數(shù)均呈極顯著正相關(guān)(表3)。這些結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)對(duì)玉米根性狀相關(guān)QTL的研究有利于深入認(rèn)識(shí)玉米氮吸收的遺傳機(jī)制。

氮吸收效率和根系形態(tài)都是復(fù)雜的性狀，受基因型和環(huán)境的共同影響。目前我們對(duì)玉米氮高效和根系形態(tài)的遺傳基礎(chǔ)仍知之甚少，對(duì)于兩者之間的關(guān)系認(rèn)識(shí)不足，這也限制了基于根系形態(tài)來(lái)篩選氮高效材料或品種的效率。近來(lái)QTL作圖已經(jīng)成為確定復(fù)雜性狀的遺傳位點(diǎn)甚至候選基因的有效工具。很多氮高效相關(guān)的農(nóng)藝性狀已經(jīng)被定位，包括生物量[25]、籽粒氮吸收量[26]、吐絲后氮吸收效率以及氮再利用效率等[5]。同時(shí)，很多調(diào)控根系形態(tài)的QTL也在不同的玉米連鎖群中被定位[10–11,27–28]。例如，Burton等[27]利用三個(gè)玉米重組自交系對(duì)21個(gè)根系性狀進(jìn)行QTL定位，共定位到15個(gè)QTL，分布在8條染色體上(第6和10染色體上沒(méi)有檢測(cè)到QTL)，表型變異為0.44%～13.5%。Burton等[27]對(duì)Zhu等[13]、Lebreton等[12]研究中所定位到的QTL進(jìn)行元分析，發(fā)現(xiàn)在bin 1.03、1.04和7.03位置分別有控制初生胚根上側(cè)根長(zhǎng)度、節(jié)根數(shù)目和次生胚根數(shù)目的QTL。此外，Song等[11]利用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)方法，對(duì)含有204個(gè)材料的重組自交系根系性狀進(jìn)行QTL定位，在bin1.06檢測(cè)到平均側(cè)根長(zhǎng)度(SLL)和根冠比的QTL。本研究利用氮效率差異顯著的兩個(gè)玉米自交系構(gòu)建的單片段代換系群體對(duì)玉米苗期的根系形態(tài)和氮吸收量進(jìn)行了QTL定位分析。在高氮條件下，共檢測(cè)到40個(gè)根系性狀QTL，34個(gè)生物量QTL，以及28個(gè)氮吸收量QTL。對(duì)HN下的QTL進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有些染色體區(qū)段僅特異檢測(cè)到HN下的QTL，并且不同性狀的QLT成簇排列(圖2)，這些區(qū)段檢測(cè)到HN下QTL不少于5個(gè)，表明這些區(qū)段可能包含有高氮條件下控制玉米根系形態(tài)的主效QTL。本研究也在bin1.03(第1染色體phi001—bnlg182區(qū)間)和bin1.06(umc1122—umc2396區(qū)間)檢測(cè)到正常氮條件下根形態(tài)QTL，與Burton等[27]和Song等[11]定位到的根形態(tài)相關(guān)QTL區(qū)間有重疊。這些結(jié)果表明在這兩個(gè)QTL區(qū)間可能存在控制氮充足條件下玉米根系形態(tài)的主效QTL。目前就我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)狀而言，氮肥的施用量短期內(nèi)很難顯著降低[29]，因此，培育在正常或高肥力條件下高效吸收的品種也是提高氮效率的途徑之一[30]。在高產(chǎn)栽培條件下，隨著產(chǎn)量水平的提高，作物需氮量增加，施氮總量也會(huì)提高。但是，我國(guó)目前玉米農(nóng)田生產(chǎn)中多數(shù)農(nóng)民采用一次性基肥，不僅增加了硝酸鹽淋失的可能性，而且過(guò)高的硝酸鹽濃度也限制了根系的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而降低氮肥的吸收效率。因此，米國(guó)華等[31]提出玉米氮高效吸收的理想根構(gòu)型具有在高產(chǎn)氮肥投入條件下仍能維持正常的側(cè)根生長(zhǎng)、總根長(zhǎng)密度高，提高整體剖面氮素有效性的特點(diǎn)。本研究中所定位到的高氮特異的QTL簇對(duì)研究玉米高氮條件下氮高效吸收的遺傳機(jī)制和基因定位具有一定意義。

表8 高氮條件下苗期玉米植株氮累積量 QTL 分析Table 8 QTL location of the nitrogen accumulation in the SSSL population under the high nitrogen condition

表9 低氮條件下苗期玉米植株氮累積量 QTL 分析Table 9 QTL location of the nitrogen contents in the SSSL population under the low nitrogen condition

本研究在低氮條件下共檢測(cè)到85個(gè)根性狀相關(guān)QTL，在第1染色體bnlg182—bnlg2295(bin1.04)和umc1013—umc2047(bin1.08)區(qū)間不僅檢測(cè)到低氮下根系形態(tài)相關(guān)QTL，而且同時(shí)檢測(cè)到低氮下生物量和氮吸收量的QTL，說(shuō)明低氮脅迫下植株氮吸收量與根系形態(tài)緊密聯(lián)系。其中，第1染色體bnlg182—bnlg2295(bin1.04)區(qū)間在Burton等[27]、Song等[11]的研究中均檢測(cè)到根系形態(tài)相關(guān)QTL。Li等[14]利用重組自交系，設(shè)置高氮和低氮水平，通過(guò)大田試驗(yàn)和水培實(shí)驗(yàn)對(duì)氮利用效率(NUE)和根系構(gòu)型(RSA)相關(guān)性狀的QTL進(jìn)行定位，共檢測(cè)到331個(gè)QTL。該研究發(fā)現(xiàn)氮吸收效率與根系構(gòu)型之間存在顯著的表型相關(guān)性。研究表明大約70%的NUE相關(guān)QTL簇與根系構(gòu)型QTL簇重疊，這表明根系構(gòu)型與氮利用率相關(guān)性狀之間有顯著的遺傳學(xué)關(guān)系，可以通過(guò)分子標(biāo)記篩選優(yōu)異的根系構(gòu)型來(lái)提高玉米的氮利用效率[14]。本研究結(jié)果也顯示，除了極個(gè)別的代換區(qū)間僅單獨(dú)檢測(cè)到氮累積量的QTL，其他絕大部分植株氮吸收量QTL都與根形態(tài)相關(guān)QTL成簇存在(圖2)。此外，Li等[14]的研究發(fā)現(xiàn)有5個(gè)重要的QTL簇對(duì)玉米獲得大的根系和更高的氮吸收效率有利，其中一個(gè)QTL簇位于染色體區(qū)間bin1.04。這一結(jié)果與我們發(fā)現(xiàn)的QTL簇區(qū)間bnlg182—bnlg2295(bin1.04)有重疊，并且在這個(gè)QTL區(qū)間同時(shí)檢測(cè)到低氮下植株氮吸收量的QTL，表明該區(qū)間很有可能包含有控制玉米氮高效的主效QTL位點(diǎn)，進(jìn)一步對(duì)包含該區(qū)段的代換系1419進(jìn)行精細(xì)定位可能獲得氮高效候選基因。Gallais等[9]通過(guò)大田和水培相結(jié)合的方法對(duì)玉米花后氮素吸收、氮再利用、籽粒產(chǎn)量、葉片硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶活性等性狀進(jìn)行了QTL定位，發(fā)現(xiàn)三個(gè)染色體位置上檢測(cè)到產(chǎn)量QTL、氮再利用QTL、GS活性QTL和一個(gè)編碼胞質(zhì)GS的基因具有一致性，并且位于第5染色體的GS位點(diǎn)能夠部分解釋玉米氮利用效率的表型變異。同時(shí)，該研究定位的QTL簇有些與本研究重要QTL簇位置接近，例如，Gallais等[9]在第1染色體的頂端區(qū)間檢測(cè)到莖稈氮再利用QTL、GDH和GS酶活性相關(guān)QTL，而我們的結(jié)果顯示在同一區(qū)段檢測(cè)到總根長(zhǎng)、植株生物量等QTL；在位于第5染色體umc1587—umc1680(代換系1328的代換區(qū)間)的QTL簇接近的位置，Gallais等[9]定位到葉片硝酸鹽含量、GS和NR活性QTL；在bin1.08位置(umc1013—umc2047區(qū)間，代換系1314)Gallais等檢測(cè)到控制整株氮再利用的QTL。此外，齊歡歡等[32]研究發(fā)現(xiàn)第1染色體的umc2217—umc1770區(qū)段與穗長(zhǎng)、穗位高和穗行數(shù)有關(guān)，這一區(qū)間與我們的QTL簇bnlg182—bnlg2295(代換系1419)部分重疊。這說(shuō)明本研究所定位到的低氮特異QTL簇可能在玉米低氮條件下氮素高效吸收中起重要作用，與氮高效吸收密切相關(guān)。此外，在一些QTL區(qū)間同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)高氮和低氮QTL，且成簇排列，這些QTL不受氮水平特異誘導(dǎo)。例如第3染色體bnlg144—umc1425區(qū)間，第7染色體umc1241—umc1642區(qū)間，第8染色體umc1724—phi080區(qū)間(圖2)。這些不同環(huán)境下檢測(cè)到的QTL簇表明玉米在不同的氮環(huán)境下具有不同的代謝機(jī)制。高、低氮特異的QTL簇對(duì)我們研究玉米適應(yīng)氮脅迫具有重要意義，有利于挖掘不同氮水平下的氮高效基因，更有針對(duì)性地開(kāi)展玉米氮高效育種。

圖2 不同氮水平下玉米苗期根系形態(tài)及氮累積量 QTL 在染色體上的分布Fig. 2 Position of the QTLs for maize root morphology and N uptake at the seedling stage under low and high N levels

4 結(jié)論

不同氮水平下，玉米的根系形態(tài)存在顯著差異，對(duì)高、低氮條件下檢測(cè)到的特異QTL進(jìn)行分析有助于解析不同氮水平下玉米高效吸收氮素的遺傳機(jī)制。本研究在染色體區(qū)段bnlg182—bnlg2295 (bin1.04，代換系1419)、umc1013—umc2047 (bin1.08，代換系1314)區(qū)間檢測(cè)到多個(gè)低氮特異的QTL，在phi001—bnlg182(bin1.03，代換系1428)和umc1122—umc2396(bin1.06，代換系1376)等區(qū)間檢測(cè)到高氮條件下特異的QTL。這些QTL區(qū)間同時(shí)包含根系形態(tài)QTL和氮吸收量QTL，并且在前人的研究中均有玉米氮效率或根系形態(tài)相關(guān)QTL檢測(cè)到，說(shuō)明這些區(qū)間在玉米氮高效吸收中可能起重要作用，后期會(huì)對(duì)包含該區(qū)段的代換系進(jìn)行精細(xì)定位，獲得候選基因。

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Mapping of QTLs for root morphology and nitrogen uptake of maize under different nitrogen conditions

WANG Yi1,2,3,TANG Ji-hua3,FU Yan-lei1,XU Heng3,TAN Jin-fang1,2,HAN Yan-lai1,2,3*
(1 College of Resources and Environment, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Zhengzhou 450002, China; 3 State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Zhengzhou 450002, China)

【Objectives】There is astrong relationship between maize root morphology and nitrogen uptake capacity.In this study,QTLs for maize root morphology and plant nitrogen uptake were identified using single segment substitution lines(SSSLs)to provide support for fine mapping and cloning of major QTLs controlling maize root morphology and nitrogen uptake.【Methods】150maize SSSLs derived from across between aN-efficient inbred line Xu178and aN-inefficient inbred line Zong3were used for solution culture.Ca(NO3)2was used as nitrogen source and high nitrogen level(4mmol/L NO3–)and low nitrogen level(0.05mmol/L NO3–)were supplied for each line,and each Nlevel had six seedlings.After20days culture,seedlings were harvested,and the biomass and nitrogen contents of shoots and roots were analyzed respectively.Total root length(TRL),root surface area(RSA),root volume(RV),root average diameter(RAD)and root tip numbers(RTN)were determined from the root images using WinRHIZO.According to the results of the T-test of the phenotype values of SSSL and Xu178,QTLs for each trait were mapped in the SSR genetic linkage map when Pvalue was less than 0.001.【Results】Under the high Nlevel,all root traits were significantly correlated with each other except that between RAD and either TRL or RTN,and the plant nitrogen uptake was significantly correlated with all the root morphology related traits.Under the low Nlevel,all the root morphology traits were strongly correlated with plant nitrogen uptake except for RAD,and the RSA showed the most significant correlation. Under the high Nlevel,102QTLs were detected including40QTLs for root morphology traits,34QTLs for plant biomass and28QTLs for plant nitrogen uptake.Under the low Nlevel,85QTLs were detected including 47QTLs for root morphology traits,22QTLs for plant biomass and16QTLs for plant nitrogen uptake.Most of the QTLs for Nuptake coincided in cluster with those for root morphology.Several QTLs for root morphology and nitrogen uptake were mapped in the same substituted segment region.Under the high Ncondition,five high N-specific QTLs clusters containing several root morphology traits and nitrogen uptake were detected in SSSL lines of1428,1376,1282,1266and1473.The single QTL additive effect contribution was from–43%to84%. Moreover,several QTLs for root morphology and nitrogen uptake were identified in the SSSL lines of1419and 1314under the LN condition,with the additive effect contribution from–32%to55%.【Conclusions】In the present study,several LN-specific QTLs were mapped in substituted segment of bnlg182–bnlg2295in line 1419and umc1013–umc2047in line1314,in which some QTLs related to nitrogen use efficiency of maize were detected in previous researches.It was indicated that there were some major QTLs for maize root morphology and plant nitrogen uptake located in the two regions which would play important role in maize nitrogen uptake efficiency.The present research serves as abasis for the major QTLs fine-mapping and candidate genes cloning.

maize;SSSLs;root morphology;QTL;nitrogen deficiency

2016–12–13接受日期：2017–02–11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31601812）；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（KJCX2015A16）資助。

王祎（1983—），女，湖北宜城人，博士，講師，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)生理和遺傳研究。wangyi19830705@163.com

*通信作者E-mail：hyanlai@126.com