丁建莉，姜昕*，馬鳴超，關(guān)大偉，趙百鎖，魏丹，曹鳳明，李力，李俊*

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081；2農(nóng)業(yè)部微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京100081；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所，哈爾濱150086）

長(zhǎng)期有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施對(duì)東北黑土真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

丁建莉1,2，姜昕1,2*，馬鳴超1,2，關(guān)大偉1,2，趙百鎖2，魏丹3，曹鳳明1,2，李力1,2，李俊1,2*

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081；2農(nóng)業(yè)部微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京100081；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所，哈爾濱150086）

【目的】分析長(zhǎng)期有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施對(duì)土壤真菌豐度、多樣性及其群落特征的影響，探討東北黑土真菌群落變化與施肥的相關(guān)性，為進(jìn)一步調(diào)節(jié)土壤微生物結(jié)構(gòu)，改善其生態(tài)功能提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳劳泻邶埥∞r(nóng)業(yè)科學(xué)院36年長(zhǎng)期定位試驗(yàn)站，選取4個(gè)不同施肥處理：不施肥處理(CK)、有機(jī)肥處理(M)、氮磷鉀無(wú)機(jī)肥處理(NPK)和有機(jī)肥配施無(wú)機(jī)肥處理(MNPK)的耕作層土壤為研究對(duì)象，以真菌ITS基因?yàn)榉肿訕?biāo)靶借助qPCR技術(shù)和Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)，研究不同施肥處理對(duì)黑土中真菌群落豐度、多樣性和組成的影響，并與土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)分析，揭示群落與施肥的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥顯著降低土壤pH，而有機(jī)無(wú)機(jī)配施可以有效緩解土壤酸化。NPK處理的ITS基因豐度顯著高于MNPK；MNPK處理的細(xì)菌/真菌比值(26.91×104)顯著大于NPK，各處理比值由高到低為MNPK>M>CK>NPK。細(xì)菌/真菌比值與土壤pH正相關(guān)；MNPK處理的真菌α多樣性指數(shù)值略大于NPK。Ascomycota和Zygomycota為土壤中主要真菌門(mén)，不同施肥處理之間真菌組成的相對(duì)豐度存在顯著差異，對(duì)照處理Ascomycota的相對(duì)豐度為45.35%，MNPK和NPK處理分別為50.93%和56.16%。有機(jī)肥有利于降低病原真菌相對(duì)豐度，具有高度侵染性的Cochliobolus在MNPK (0.41%)和M(0.39%)中的相對(duì)豐度顯著小于CK(3.25%)和NPK(2.08%)。CCA分析表明，土壤理化性質(zhì)共解釋土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化的73.3%，有效磷(貢獻(xiàn)量為32.4%，P=0.002)、銨態(tài)氮(貢獻(xiàn)量為14.8%，P=0.01)和硝態(tài)氮(貢獻(xiàn)量為16.2%，P=0.048)是3個(gè)重要的影響因子?！窘Y(jié)論】不同施肥條件下土壤真菌豐度、多樣性，以及菌群組成特征不同。與無(wú)機(jī)肥相比，有機(jī)肥無(wú)機(jī)肥配施能夠有效改善真菌群落結(jié)構(gòu)，降低真菌的豐度，增加真菌多樣性，并提高土壤pH，減緩?fù)寥浪峄?。土壤有效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量是影響黑土土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化重要因素。

施肥；真菌群落；高通量測(cè)序；土壤有效磷；土壤銨態(tài)氮；土壤硝態(tài)氮

黑土有機(jī)質(zhì)含量高、土質(zhì)肥沃，是最寶貴的土壤資源。我國(guó)東北黑土作為世界四大黑土區(qū)之一，面積達(dá)103萬(wàn)km2、占全國(guó)陸地總面積的10.7%，其中耕地面積3000萬(wàn)hm2、占全國(guó)耕地總面積的22.2%[1]，因此東北黑土在保障國(guó)家糧食安全、區(qū)域生態(tài)環(huán)境安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中具有不可替代的地位。然而由于長(zhǎng)期不合理施肥導(dǎo)致土壤質(zhì)量退化，如長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥使得黑土土壤侵蝕嚴(yán)重、土層變薄、有機(jī)質(zhì)含量下降、土壤酸化、土壤微生物活性降低等一系列問(wèn)題[2–3]。而施用有機(jī)肥是提高作物產(chǎn)量、增加土壤有機(jī)質(zhì)和改善土壤生物學(xué)性狀的有效措施[4–5]。但近五十年來(lái)我國(guó)有機(jī)肥使用量持續(xù)下降，調(diào)查數(shù)據(jù)表明，在1960、1980、2000、2010年我國(guó)有機(jī)肥施用量占總施肥量的80%、60%、30%、10%[6]。面對(duì)無(wú)機(jī)肥施用量增加，有機(jī)肥施用量逐年減少的現(xiàn)狀，我國(guó)提出了有機(jī)無(wú)機(jī)肥配施的施肥指導(dǎo)策略。研究土壤微生物生物量、群落組成等對(duì)施肥、耕作等措施的快速響應(yīng)變化，可以指示土壤質(zhì)量變化[7]。

關(guān)于施肥對(duì)土壤微生物影響的研究報(bào)道很多，有機(jī)肥與無(wú)機(jī)肥配施會(huì)提高土壤微生物生物量碳氮、土壤酶活[8]。真菌作為土壤微生物中的重要組成部分，在土壤生態(tài)中具有不可忽視的地位，與土傳病害、植物互作、分解有機(jī)物質(zhì)等密不可分[9–10]，因此探究施肥對(duì)土壤真菌的影響具有重要意義。研究表明施入氮肥會(huì)降低真菌的生物量[11]，降低多樣性和改變真菌的組成結(jié)構(gòu)[12–13]；相對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，真菌有更強(qiáng)的吸收氮素和磷素的能力[14]。無(wú)機(jī)肥減少菌根真菌的生長(zhǎng)，而糞肥增加菌根真菌的生長(zhǎng)[15]。施有機(jī)肥土壤理化性質(zhì)與常規(guī)農(nóng)田沒(méi)有顯著差異，但生物量高于常規(guī)農(nóng)田，且菌根真菌量增加[16]。在溫室試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，生物有機(jī)肥可以降低土壤真菌的數(shù)量，尤其是病原真菌的數(shù)量，降低作物病害發(fā)病率，且改變真菌的組成結(jié)構(gòu)[17]。高通量測(cè)序技術(shù)可進(jìn)行環(huán)境中所有微生物群落的研究，獲得數(shù)據(jù)量大，能更真實(shí)地揭示微生物群落的復(fù)雜性和多樣性，極大的促進(jìn)環(huán)境中不可培養(yǎng)微生物以及痕量菌的更深入研究[18–19]。本課題組的Zhou等[20]借助高通量測(cè)序技術(shù)研究不同施氮量和不同量氮、磷肥配施對(duì)東北黑土真菌群落結(jié)構(gòu)變化的影響，發(fā)現(xiàn)氮肥和氮、磷肥配施可增加真菌數(shù)量，降低真菌多樣性，改變真菌群落結(jié)構(gòu)的組成。本研究首次應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究長(zhǎng)期有機(jī)肥無(wú)機(jī)肥配施條件下東北黑土真菌群落結(jié)構(gòu)是如何演變的，及其與土壤理化性質(zhì)的偶聯(lián)關(guān)系。

真菌核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列分析技術(shù)已被應(yīng)用到物種屬內(nèi)、近緣屬間乃至科內(nèi)研究系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[21]。由于ITS的序列分析能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間的堿基對(duì)差異，且序列片段較小、易于分析，目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中[22]。本研究選取4個(gè)施肥處理，探討長(zhǎng)期有機(jī)無(wú)機(jī)配施和單施無(wú)機(jī)肥條件下，真菌微生物豐度、多樣性和組成的演變規(guī)律，及其與土壤理化性質(zhì)的偶聯(lián)關(guān)系。借助qPCR技術(shù)和Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)，以真菌ITS基因?yàn)榉肿訕?biāo)靶探討以上問(wèn)題。研究結(jié)果將為東北黑土建立合理施肥制度，維持土壤肥力，調(diào)節(jié)土壤微生物結(jié)構(gòu)，改善其生態(tài)功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院長(zhǎng)期定位試驗(yàn)站進(jìn)行，試驗(yàn)站位于黑龍江省哈爾濱市(45°40'N，126°35'E)，地勢(shì)平坦，屬于松花江二級(jí)階地，海拔151m，無(wú)霜期135d，年均氣溫3.5℃，年降水量533mm。該試驗(yàn)站1979年成立，自次年起，按小麥–大豆–玉米順序輪作，2015年為玉米季。本文選取4個(gè)施肥處理：不施肥處理(CK)；有機(jī)肥處理(M)；施氮肥、磷肥和鉀肥的無(wú)機(jī)肥處理(NPK)；有機(jī)肥配施無(wú)機(jī)肥處理(MNPK)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。氮、磷、鉀肥分別為尿素、重過(guò)磷酸鈣、硫酸鉀。氮、磷、鉀肥小麥季和玉米季施用量為N150kg/hm2、P2O575 kg/hm2、K2O75kg/hm2；大豆季施用量為N75 kg/hm2、P2O5150kg/hm2、K2O75kg/hm2。有機(jī)肥為馬糞，施用量為18600kg/hm2。基礎(chǔ)土壤理化性質(zhì)(1980年)：pH7.22、有機(jī)質(zhì)含量26.7g/kg、全氮1.47g/kg、全磷1.07g/kg、堿解氮151.1mg/kg、速效鉀200mg/kg、有效磷51.0mg/kg。

1.2 樣品采集

玉米收獲季(2015年9月)取5—25cm的耕層土壤，在每個(gè)小區(qū)隨機(jī)抽取10個(gè)點(diǎn)取樣，去除土壤中雜草石塊等雜質(zhì)，混合均勻作為該處理的一個(gè)平行樣品，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。土壤樣本保存于封口塑料袋中，一部分于溫室風(fēng)干、研磨后過(guò)0.2mm篩，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)(用鮮土測(cè)定土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量)；另一部分樣品保存于–80℃冰箱，用于微生物群落分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定以下土壤理化性質(zhì)參照魯如坤[23]方法，采用酸度計(jì)法(土水比為1∶1)測(cè)定土壤pH；采用半微量凱氏定氮法測(cè)定土壤全氮；Olsen法測(cè)定土壤有效磷；采用乙酸銨浸提—原子吸收分光光度法測(cè)定土壤速效鉀；通過(guò)重鉻酸鉀—容量法—外加熱法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)。全自動(dòng)流動(dòng)分析儀(AA3)測(cè)定硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量[24]。

1.3.2 土壤DNA的提取和ITS基因的高通量測(cè)序使用美國(guó)MOBIO公司的Power Max Soil DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤總DNA，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25g土壤樣品，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取土壤總DNA。為了使土壤總DNA具有重復(fù)性和代表性，每個(gè)處理的每個(gè)重復(fù)樣品，提取6次DNA，把所提取的6次DNA混合均勻作為該重復(fù)土壤總DNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[25]。用核酸定量?jī)x(NanoDrop ND-1000)檢測(cè)土壤總DNA濃度和純度。符合要求的DNA送至北京奧維森基因科技有限公司應(yīng)用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序引物為ITS1F/ITS2(ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[26]。Illumina Miseq平臺(tái)測(cè)序的主要步驟：首先合成帶有barcode的特異引物，并使用Qubit熒光定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。再依據(jù)每個(gè)樣本的測(cè)序量要求以及定量結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。然后將含有標(biāo)簽的接頭與DNA片段鏈接。選擇性地富集兩端連有接頭的DNA片段，擴(kuò)增DNA文庫(kù)，使用測(cè)序平臺(tái)對(duì)真菌ITS1區(qū)基因進(jìn)行測(cè)序。原始序列上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)為SRP085784。

1.3.3 定量PCR分析采用SYBR Green定量PCR分析ITS基因，反應(yīng)在ABI7500Real-time PCR (ABI，USA)儀器上進(jìn)行。反應(yīng)體系為FastFire qPCR PreMix(TIANGEN，China)10μL，ROX Reference Dye0.4μL，1μL DNA模板，10nmol/L引物，補(bǔ)加ddH2O至20μL。真菌定量PCR引物為ITS4/ITS5

(ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[27]。以含有目標(biāo)基因的重組pGEMR-T載體為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，制備質(zhì)粒和后續(xù)方法參照文獻(xiàn)[28]。細(xì)菌16S rRNA基因豐度檢測(cè)方法同真菌，其引物為515F/806R[29]。

1.3.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行Paired-end測(cè)序，使用Trimmomatic軟件修剪數(shù)據(jù)末端堿基，以Q20≥90的標(biāo)準(zhǔn)用Readfq (vertion6.0)軟件將低質(zhì)量的成對(duì)reads過(guò)濾掉；采用FLASH(version1.2.10)軟件把成對(duì)的reads通過(guò)其overlap拼接到一條序列，拼接的錯(cuò)誤匹配率為0.1。Mothur(version1.31.2)軟件去除長(zhǎng)度小于200 bp的序列和maxhomop大于10的序列，并去除嵌合體。QIIME(v1.8.0)軟件將拼接過(guò)濾后的序列聚類(lèi)為用于物種分類(lèi)的OTU(Operational Taxonomic Units)，OUT相似性設(shè)置為97%。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并在各個(gè)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成，對(duì)比UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)。利用軟件Mothur進(jìn)行α多樣分析。采用SPSS19.1軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析和Pearson相關(guān)性分析，并用Turkey顯著差異法分析處理間的差異顯著性。使用PAST軟件，基于Bray-Curtis相似距離，對(duì)黑土中真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行聚類(lèi)分析[30]。采用CANOCO5.0將土壤理化性質(zhì)和真菌群落組成進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理土壤理化性質(zhì)

由表1可知，與不施肥相比，單施無(wú)機(jī)肥降低了土壤pH，施有機(jī)肥提高了pH，NPK處理的土壤pH值比CK降低0.53，MNPK的pH要高出NPK處理0.40。有機(jī)無(wú)機(jī)配施和單施無(wú)機(jī)肥處理極顯著增加土壤中全氮、硝態(tài)氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)等的含量(P<0.05)，MNPK處理的有效磷含量較CK處理提高60.14mg/kg，NPK處理也較CK處理提高57.81 mg/kg；而施肥對(duì)不同處理的銨態(tài)氮、速效鉀含量影響不顯著?？傮w上來(lái)說(shuō)，施肥改變了土壤理化性質(zhì)。

表1 不同施肥處理對(duì)黑土土壤理化性質(zhì)的影響分析Table 1 Variations of soil physicochemical properties under different fertilizer treatments

2.2 不同施肥處理的黑土ITS基因豐度和細(xì)菌/真菌比值分析

通過(guò)qPCR檢測(cè)黑土中ITS基因和16S rRNA基因豐度，分析黑土土壤中真菌豐度，以及細(xì)菌/真菌比值(16S rRNA基因豐度值與ITS基因豐度值做商)，結(jié)果見(jiàn)圖1。各處理ITS基因拷貝數(shù)為1.66×105～3.04×105/g,soil)，NPK處理的最高(3.04×105/g,soil)，比MNPK處理(2.02×105/g,soil)的高出1.02×105/g, soil，不同處理之間存在顯著差異。通過(guò)分析細(xì)菌/真菌比值可知，MNPK處理(26.91×104)和M處理(23.61×104)均高于CK(19.58×104)，而NPK處理(9.90×104)小于CK。另外，通過(guò)土壤理化性質(zhì)和ITS基因豐度，以及細(xì)菌/真菌比值的相關(guān)性分析(表2)可知，ITS基因拷貝數(shù)同銨態(tài)氮和速效鉀含量顯著正相關(guān)；細(xì)菌/真菌比值同土壤pH值顯著正相關(guān)，與銨態(tài)氮含量顯著負(fù)相關(guān)。

2.3 真菌 α 多樣性分析

不同施肥處理之間的真菌α多樣性分析結(jié)果(表3)表明，只有Observed Species分析，CK處理的最高(735)，與其他3個(gè)處理差異達(dá)到顯著水平，3個(gè)施肥處理間雖有差異，但未達(dá)顯著水平。Chao1、PD whole tree和Shannon指數(shù)，所有處理間均沒(méi)有顯著性差異。

2.4 不同施肥處理的黑土土壤真菌組成分析

由圖2中可以看到，長(zhǎng)期施肥的黑土土壤中檢測(cè)到6個(gè)真菌門(mén)，相對(duì)豐度大于1的有5個(gè)，分別為：Ascomycota(相對(duì)豐度35.47%～56.22%)，Zygomycota(18.37%～25.66%)，Basidiomycota (8.26%～12.14%)，Glomeromycota(1.19%～2.63%)，Chytridiomycota(1.96%～9.87%)。相對(duì)豐度大于1%的菌綱有10個(gè)和相對(duì)豐度大于0.1%的菌屬40個(gè)(圖2)。

不同施肥處理土壤5個(gè)真菌門(mén)Ascomycota、Zygomycota、Basidiomycota、Glomeromycota和Chytridiomycota的相對(duì)豐度存在差異(圖3)。CK處理Ascomycota的相對(duì)豐度為45.35%，M處理的為35.47%，而MNPK處理和NPK處理的分別提高到50.93%和56.16%。Zygomycota的相對(duì)豐度在CK處理為20.91%，在M處理比CK增加了4.75%，而在MNPK處理和NPK處理分別減少為18.37%和19.95%?？梢?jiàn)長(zhǎng)期施肥引起了真菌優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相對(duì)豐度的差異。

圖1 施肥處理ITS基因豐度和細(xì)菌/真菌比值的qPCR結(jié)果Fig. 1 The abundance of fungi as indicated by the number of ITS copies and bacteria-to-fungi ratio in different treatments analyzed by qPCR

表2 ITS基因拷貝數(shù)、細(xì)菌/真菌比值與土壤理化性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation coefficients between ITS gene sequence copy numbers, bacteria-to-fungi ratio and soil physiochemical characteristics

表3 不同施肥處理黑土土壤中真菌 α 多樣性指數(shù)Table 3 α-diversity index of fungi under different fertilizer treatments

另外，不同施肥處理土壤真菌屬水平組成分析(表4)，4個(gè)處理之間優(yōu)勢(shì)菌屬Fusarium的相對(duì)豐度沒(méi)有顯著性差異；而Cochliobolus在CK處理和NPK處理中分別為3.25%和2.08%，在施入有機(jī)肥的MNPK處理和M處理中的相對(duì)豐度分別降低到0.41%和0.39%。Exophiala和Alternaria也有類(lèi)似變化趨勢(shì)，它們的相對(duì)豐度在NPK處理(分別為5.38%和2.49%)均顯著高于MNPK處理(分別為3.15%和1.65%)。

2.5 不同施肥處理的聚類(lèi)分析

聚類(lèi)分析根據(jù)每個(gè)樣品OTU的組成情況，更直觀地展示各個(gè)樣品之間的關(guān)系，組成越相似的樣品，聚類(lèi)關(guān)系越近。通過(guò)此分析，具有相似β多樣性的供試樣品聚類(lèi)在一起，本研究各處理的結(jié)果(圖4)顯示CK處理的幾個(gè)重復(fù)先行相聚，再同M和MNPK聚類(lèi)，最后與NPK聚類(lèi)。4個(gè)處理之間彼此分開(kāi)，說(shuō)明處理之間的群落結(jié)構(gòu)存在差異；MNPK處理與NPK處理相比較，MNPK處理與CK處理的親緣關(guān)系更近。

圖2 長(zhǎng)期施肥黑土土壤真菌組成Fig. 2 Fungal community composition in long-term fertilized soils

圖3 不同施肥處理的真菌門(mén)水平相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundances of fungal common phyla under different long-term fertilizer treatments

表4 不同施肥處理黑土土壤中真菌屬相對(duì)豐度 (%)Table 4 Relative abundances of fungal common genera under different treatments

圖4 不同施肥處理黑土土壤中真菌組成聚類(lèi)分析 (OTU水平)Fig. 4 Results of clustering analysis based on fungal community composition in different fertilized soils (at OUT-level)

2.6 CCA分析

CCA分析主要反映樣品、菌群與環(huán)境因子之間關(guān)系。通過(guò)CCA分析長(zhǎng)期不同施肥處理土壤中真菌群落與土壤理化性質(zhì)之間的相互關(guān)系(圖5)，本文選取的土壤理化性質(zhì)包括：土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀等。土壤理化性質(zhì)共解釋土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化的73.3%，前兩軸累計(jì)解釋量為56.53%，第一軸和第二軸的解釋量分別為36.54%、19.99%。分析得知，對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)解釋量前三位的理化指標(biāo)分別為：有效磷(貢獻(xiàn)量為32.4%，P=0.002)、銨態(tài)氮(貢獻(xiàn)量為14.8%，P=0.01)和硝態(tài)氮(貢獻(xiàn)量為16.2%，P=0.048)。

3 討論

3.1 長(zhǎng)期施肥對(duì)黑土理化性質(zhì)的影響

有機(jī)肥配施無(wú)機(jī)肥和單施無(wú)機(jī)肥處理極顯著增加土壤中全氮、硝態(tài)氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)等的含量。總體上來(lái)說(shuō)，施肥改變了土壤理化性質(zhì)。對(duì)比4個(gè)處理1980年的土壤基礎(chǔ)pH值(7.22)和施肥36年后的pH值，可知多年的施肥引起了土壤的嚴(yán)重酸化，應(yīng)采取優(yōu)化施肥措施緩解酸化。NPK處理的pH (5.89)明顯低于CK、M和MNPK三個(gè)處理，說(shuō)明施無(wú)機(jī)肥導(dǎo)致了土壤的酸化，而有機(jī)肥或者有機(jī)無(wú)機(jī)配施可以減緩?fù)寥纏H值的降低。酸性土壤pH因?yàn)槭┤爰S肥而增加土壤pH，這可能是由于在糞肥中存在著大量的碳酸鹽和碳酸氫鹽[29,31]，另外，帶有羥基和酚羥基的有機(jī)酸類(lèi)在土壤中可以起到緩沖作用，而增加土壤pH[32]。

3.2 長(zhǎng)期施肥對(duì)黑土中ITS基因豐度的影響

通過(guò)qPCR分析結(jié)果顯示，不施肥的ITS基因豐度明顯小于無(wú)機(jī)肥處理，顯著大于單施有機(jī)肥，略高于有機(jī)無(wú)機(jī)配施。這些結(jié)果說(shuō)明施用無(wú)機(jī)肥會(huì)提高土壤中真菌的數(shù)量，施用有機(jī)肥減少了土壤中真菌數(shù)量，而有機(jī)無(wú)機(jī)配施的真菌數(shù)量與不施肥處理無(wú)顯著差異。因?yàn)檎婢m應(yīng)生存的pH范圍較寬(pH 5～9)[33]，且較低的pH相對(duì)更有利于真菌的繁殖生長(zhǎng)[34]，通過(guò)土壤pH分析得知，施用無(wú)機(jī)肥明顯的降低了土壤pH，4個(gè)處理中施無(wú)機(jī)肥的土壤pH最低，所以施無(wú)機(jī)肥的真菌數(shù)最高。有機(jī)無(wú)機(jī)配施相對(duì)單施無(wú)機(jī)肥來(lái)說(shuō)，可減緩?fù)寥纏H降低，所以土壤真菌含量相對(duì)較低。通過(guò)ITS基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析，可知ITS基因拷貝數(shù)與土壤中的銨態(tài)氮含量顯著正相關(guān)，這個(gè)結(jié)果與Zhou等[20]在研究氮肥對(duì)真菌豐度影響時(shí)得到的結(jié)論一致。

圖5 不同施肥處理黑土土壤中真菌群落與土壤理化性質(zhì)的CCA分析Fig. 5 Relationship between dominant soil fungal communities and soil chemical characteristics presented by CCA

3.3 長(zhǎng)期施肥對(duì)黑土中細(xì)菌與真菌比值的影響

本文研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用有機(jī)肥或者有機(jī)無(wú)機(jī)配施會(huì)提高黑土土壤中細(xì)菌/真菌比值(MNPK處理的為26.91×104)，施無(wú)機(jī)肥(NPK處理的為9.90×104)會(huì)降低細(xì)菌/真菌比值。這種比值變化是因?yàn)橥寥纏H與細(xì)菌數(shù)量有相關(guān)性[35]，pH值較低時(shí)，細(xì)菌數(shù)量較小；無(wú)機(jī)肥處理的pH明顯小于有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理，分析可知長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥會(huì)降低黑土土壤中細(xì)菌數(shù)量，而有機(jī)無(wú)機(jī)配施會(huì)提高土壤中細(xì)菌數(shù)量(MNPK處理的16S rRNA基因拷貝數(shù)比NPK的高出2.40×1010/g,soil)。另外一個(gè)原因是pH值越低越有利于真菌的生長(zhǎng)[34]。綜合長(zhǎng)期施肥而使得細(xì)菌數(shù)量和真菌數(shù)量的變化，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥導(dǎo)致黑土由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，而有機(jī)無(wú)機(jī)配施可以避免“細(xì)菌型”向“真菌型”的轉(zhuǎn)變。通過(guò)細(xì)菌/真菌比值和土壤理化性質(zhì)Pearson相關(guān)性分析，可知其與土壤pH有正相關(guān)性。

3.4 長(zhǎng)期施肥對(duì)黑土中真菌 α 多樣性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)雖然不施肥處理、無(wú)機(jī)肥處理、有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理的真菌α多樣性總體上沒(méi)有顯著性差異，但是有機(jī)無(wú)機(jī)配施相對(duì)于無(wú)機(jī)肥有略提高真菌的多樣性，無(wú)機(jī)肥有略降低土壤真菌的多樣性的趨勢(shì)，這與Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)氮肥會(huì)降低土壤真菌的α多樣性相一致。而Lou等[36]通過(guò)PCRDGGE方法研究報(bào)道無(wú)機(jī)肥和有機(jī)肥均會(huì)顯著增加真菌多樣性，尤其是有機(jī)肥，結(jié)果的不同很可能是因?yàn)樵囼?yàn)方法和土壤類(lèi)型的差別。

3.5 長(zhǎng)期施肥對(duì)黑土中真菌組成的影響

Ascomycota的相對(duì)豐度在不施肥處理(45.35%)，有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理(50.93%)和無(wú)機(jī)肥(56.16%)處理中大于單施有機(jī)肥處理(35.47%)的相對(duì)豐度，說(shuō)明Ascomycota對(duì)無(wú)論有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥均不穩(wěn)定。有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理和無(wú)機(jī)肥處理中Ascomycota的相對(duì)豐度增加，是因?yàn)橥寥乐惺┤牒姆柿鲜雇寥乐械肯鄬?duì)高，而土壤中施入適量氮能增加Ascomycota的百分比[13]。Zygomycota的相對(duì)豐度在單有機(jī)肥處理中要高于不施肥、有機(jī)無(wú)機(jī)配施和單施無(wú)機(jī)肥處理，有機(jī)糞肥提高了土壤中Zygomycota的含量，Neher等[37]研究發(fā)現(xiàn)Zygomycota的相對(duì)豐度與糞肥具有相關(guān)性。Cochliobolus在不施肥處理和單施無(wú)機(jī)肥處理均有較高的相對(duì)豐度，而在施入有機(jī)肥的MNPK處理和M處理中均大幅度降低；Exophiala和Alternaria有類(lèi)似變化趨勢(shì)。通過(guò)門(mén)和屬兩個(gè)水平的相對(duì)豐度分析得知，長(zhǎng)期施用有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥會(huì)改變土壤中真菌組成的相對(duì)豐度。

絲狀子囊菌屬Cochliobolus具有高度的侵染性，其病原菌種對(duì)宿主植物具有特異性[38]，引起作物病害，在M處理(0.39%)和MNPK處理(0.41%)含量均較低，而NPK處理(2.08%)比MNPK處理高1.67%，說(shuō)明有機(jī)無(wú)機(jī)配施可以減少Cochliobolus的相對(duì)豐度，降低作物病害發(fā)生率。具有腐生性和病原性的真菌Exophiala[39]在無(wú)機(jī)肥處理中含量顯著高于有機(jī)無(wú)機(jī)配施處理；雖然我們沒(méi)有監(jiān)測(cè)作物的發(fā)病情況，但從真菌的組成也可以初步分析得到有機(jī)肥無(wú)機(jī)肥配施具有潛在減少作物土傳病害發(fā)生的作用。另外，通過(guò)土壤理化性質(zhì)與真菌組成的CCA分析，可以知道土壤理化性質(zhì)影響著土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，尤其是土壤的有效磷和銨態(tài)氮濃度是兩個(gè)重要因素。影響真菌群落結(jié)構(gòu)的主要理化性質(zhì)均為速效養(yǎng)分，這可能是和土壤養(yǎng)分物質(zhì)存在的形式有關(guān)系，土壤中養(yǎng)分物質(zhì)存在形式又與地理環(huán)境、氣候溫度有相關(guān)性，例如，寒溫帶土壤中氮素化合物33%～42%的氮是以氨基酸形式存在，大約有10%的氨基酸水解成銨態(tài)氮[40]。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)36年連續(xù)施用有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥土壤中真菌群落特征的研究，發(fā)現(xiàn)連續(xù)施用無(wú)機(jī)肥會(huì)導(dǎo)致土壤酸化，改變真菌群落結(jié)構(gòu)，降低土壤真菌的多樣性；而有機(jī)肥無(wú)機(jī)肥配施減緩?fù)寥浪峄?，提高土壤真菌的多樣性。從長(zhǎng)期有機(jī)無(wú)機(jī)配施對(duì)真菌組成影響的分析可知，長(zhǎng)期有機(jī)無(wú)機(jī)配施的真菌組成結(jié)構(gòu)更有利于降低土傳病害發(fā)生率。長(zhǎng)期施用無(wú)機(jī)肥已導(dǎo)致黑土中真菌的數(shù)量增加，致使土壤由“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)化為“真菌型”，而有機(jī)無(wú)機(jī)配施可以改變這種變化趨勢(shì)。CCA分析明確有效磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化重要土壤理化因素，同時(shí)土壤細(xì)菌/真菌比值與土壤pH正相關(guān)。

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Structure of soil fungal communities under long-term inorganic and organic fertilization in black soil of Northeast China

DING Jian-li1,2,JIANG Xin1,2*,MA Ming-chao1,2,GUAN Da-wei1,2,ZHAO Bai-suo2,WEI Dan3,CAO Feng-ming1,2,LI Li1,2,LI Jun1,2*
[1 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 Laboratory of Quality &Safety Risk Assessment for Microbial Products (Beijing), Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China; 3 Institute of Soil Fertility and Environmental Sources, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China]

【Objectives】The abundance,diversity and composition of fungal community were identified,and the main relationship between soil fungi community variation and soil fertilizer would be revealed in this paper.【Methods】Based on36-years’fertilization experiment in Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,four treatments were selected to study:no fertilizer(CK);manure(M);chemical N,P and Kfertilizer(NPK); and manure with NPK(MNPK).The ITS gene was applied as target gene,using Illumina Miseq sequencing and quantitative PCR method.The fungal abundance,diversity and composition in black soil were analyzed.The relationship of fertilization and fungi community was calculated.【Results】Long term application of chemical fertilizers reduced soil pH and led to soil acidification,while manure did not show same impact.ITS gene abundance in ratio in MNPK(26.91×104)was significantly higher than that in NPK,and the ratio was in order of MNPK>M>CK>NPK.NPK treatment was more than in MNPK.Bacteria-to-fungi ratio was positively correlated with soil pH.Alpha diversity of fungi community of MNPK was slightly greater than that of NPK. Ascomycota and Zygomycota were the top two majority fungi found in black soil.The relative abundance of the fungi community was significantly different among the four fertilization treatments.The relative abundanceof Ascomycota in CK was45.35%,in MNPK and NPK were50.93%and56.16%,respectively.Manure reduced the relative abundance of pathogenic fungi.The relative abundances of highly aggressive Cochliobolus in MNPK (0.41%)and M(0.39%)were significantly lower than those of CK(3.25%)and NPK(2.08%).Canonical correlation analysis indicated that the selected soil properties could explain73.3%of the variation,and fungal communities were closely positively correlated with soil available P(Contribution=32.4%,P=0.002),NH4+-N concentration(Contribution=14.8,P=0.01)and NO3–-N concentration(Contribution=16.2%,P=0.048).【Conclusions】Long-term fertilization affects fungal abundance,diversity and community characteristics of black soil.Compared with chemical fertilizers,manure alone and manure combined with chemical NPK fertilizers will improve the fungal communities structures,decrease fungal abundance and increase diversity activity, enhance the soil pH,slowed down soil acidification.Among the soil fertility factors,the soil available P,NH4+-N and NO3–-N concentrations are the three dominant factors determining the variation of fungal communities structures.

fertilization;fungal communities;high-throughput sequencing;soil available P;soil NH4+-N; soil NO3–-N

2016–09–18接受日期：2017–03–01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41573066）；國(guó)家“973”計(jì)劃（2015CB150506）；農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估專(zhuān)項(xiàng)任務(wù)（GJFP201601202，GJFP201601203）；國(guó)家“863”計(jì)劃（2013AA102802-04）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-04）資助。

丁建莉（1981—），女，遼寧凌源人，博士研究生，主要從事環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)生態(tài)方面的研究。E-mail：lndjl@126.com *通信作者E-mail：jiangxin@caas.cn；E-mail：lijun01@caas.cn