方蘭，邱樹毅，周鴻翔，曾海英，王曉丹*

（1.貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025）

金線草主根總黃酮的提取工藝優(yōu)化

方蘭1，2，邱樹毅1，2，周鴻翔1，2，曾海英1，2，王曉丹1，2*

（1.貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州貴陽550025；2.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025）

以金線草主根為原料，對金線草主根總黃酮的乙醇回流提取工藝進行研究。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化工藝條件。結(jié)果表明，金線草主根中總黃酮的最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分數(shù)10%、提取溫度80℃、提取時間2.0 h、液料比20∶1（m L∶g）。在此條件下，金線草主根總黃酮的提取率達到（23.59±0.19）mg/g。

金線草主根；乙醇回流提取法；總黃酮；正交試驗

金線草（Antenoron filiforme Rob.et Vaut.）為蓼科（Polygonaceae）蓼屬（Polygonum）的一個種，多年生草本，高50～100 cm，為民間草藥，始載于《本草拾遺》[1]，以毛蓼之名載于《植物名實圖考》[2]。金線草具有祛風除濕、止痛、健脾燥濕、散瘀消腫、治霍亂、癰腫瘰疬；散瘀止血、解毒利氣、收斂、治跌打損傷[3]等多種功效；通過經(jīng)典的抗炎、鎮(zhèn)痛試驗也表明了金線草具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗凝血的藥理作用[4]，具有較高的藥用價值，這有可能和金線草黃酮有關(guān)。黃酮具有抗癌、抗菌、抗氧化和預防心腦血管疾病等多種生物活性[5-7]，抗氧化活性是植物黃酮的一個重要性質(zhì)，其抗氧化能力與黃酮的含量和種類有關(guān)[8]。

目前，植物黃酮提取方法主要有經(jīng)典的乙醇提取[9-12]、超聲波輔助提取[13-15]、微波輔助提取[16]、酶法輔助提取[17]、超聲波輔助半仿生法提取[18]、超聲-微波提取[19]、超聲波-酶法提取[20]等。由于乙醇廉價易得且毒性小，便于回收，鑒于此，實驗選用乙醇作為提取劑，為了減小乙醇的揮發(fā)，因此選用回流裝置提取金線草主根總黃酮。

本研究通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計對金線草主根總黃酮的提取工藝進行優(yōu)化，以期為后續(xù)開發(fā)利用金線草提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金線草：2016年10月1日采摘于貴州省六盤水市六枝特區(qū)，保存于實驗室4℃的冰箱。蘆丁標準品（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；無水氯化鋁（純度≥99.5%）：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721可見分光光度計：上海菁華科技有限公司；FA2004N電子天平：上海菁海儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金壇市中大儀器廠；XTP-200型高速多功能粉碎機：永康市紅太陽機電有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；島津紫外分光光度計UV-2550：浙江藍箭儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金線草主根總黃酮的提取

準確稱取3 g打碎均勻的新鮮洗凈的金線草主根樣品置于平底燒瓶中，在一定的液料比、提取溫度和乙醇體積分數(shù)條件下進行乙醇回流提取，提取液用提取溶劑定容至100m L，待用。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制[22]

準確稱取18.9mg蘆丁標準品，用體積分數(shù)為95%的乙醇溶液溶解并定容于100m L容量瓶中，得到蘆丁標準溶液，待用。精確量取蘆丁標準溶液0、0.5m L、1.0m L、2.0m L、3.0m L、4.0m L、5.0m L、6.0m L分別置于25m L容量瓶中，依次加入1%的氯化鋁溶液1m L，然后用體積分數(shù)為95%的乙醇溶液定容，搖勻，放置15m in；以溶劑作空白，蒸餾水作參比，在波長410 nm處測吸光度值，重復測量3次，取其平均值。以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，制作標準曲線，得到蘆丁標準曲線的回歸方程為：Y= 17.934X+0.0021，相關(guān)系數(shù)R2=0.9950。表明在0～0.05mg/m L范圍內(nèi)，蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度值線性關(guān)系良好。

1.3.3 金線草主根總黃酮提取率的計算

將樣品提取液稀釋10倍，取1m L稀釋液，操作與標準曲線的制作相同，由蘆丁標準曲線回歸方程計算樣品總黃酮的質(zhì)量濃度，水分含量的測定采用GB/T 8305—2016《食品中水分的測定方法》[23]，測得其水分含量為（57.89±0.02）%?？傸S酮提取率計算公式如下：

1.3.4 單因素試驗

考察提取時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、提取溫度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）、液料比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（m L∶g））、乙醇體積分數(shù)（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%）對金線草主根總黃酮提取率的影響。

1.3.5 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液料比（D）為考察因素，采用L9（34）正交設(shè)計，進行4因素3水平正交優(yōu)化試驗。以確定乙醇回流提取總黃酮的最佳工藝條件。正交試驗因素與水平如表1所示。

表1 總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and leve ls of orthogonalexperiments for total flavonoids extraction process optim ization

2 結(jié)果與分析

2.1 金線草主根總黃酮提取的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對總黃酮提取率的影響

考察提取時間對金線草主根總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取時間對金線草主根總黃酮提取的影響Fig.1 Effects of extraction tim e on total flavonoids extraction from A.filiform e taproot

由圖1可知，總黃酮提取率呈先增加后減少的趨勢，當提取時間＜2.0 h時，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率逐漸增大；當提取時間＞2.0 h時，總黃酮提取率逐漸減小?？赡苁窃谳^短的時間內(nèi)，總黃酮還沒有提取完全，隨著提取時間的延長，總黃酮的提取率逐漸增加，但提取時間過長，總黃酮容易受到氧化，從而導致提取率下降[24]。選擇提取時間為1.5 h、2.0 h、2.5 h進行正交試驗。

2.1.2 提取溫度對總黃酮提取率的影響

考察提取溫度對金線草主根總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對金線草主根總黃酮提取的影響Fig.2 Effects of extraction tem perature on total flavonoids extraction from A.filiforme taproot

由圖2可知，當提取溫度低于70℃時，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率逐漸增加；當提取溫度高于70℃時，總黃酮提取率呈下降趨勢；當提取溫度為70℃時，總黃酮的提取率達到最大，這可能是因為高溫有利于引起細胞膜結(jié)構(gòu)的變化，加劇分子的運動，從而使總黃酮提取率增加。但隨著溫度升高到70℃以后，由于溫度過高，從而引起總黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化，破壞了總黃酮，總黃酮的提取率又有所下降[25]。因此，選擇提取溫度為60℃、70℃、80℃進行正交試驗。

2.1.3 液料比對總黃酮提取率的影響

考察液料比對金線草主根總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對金線草主根總黃酮提取的影響Fig.3 Effect o f liquid-solid rate on total flavonoids extraction from A.filiforme taproot

由圖3可知，隨著液料比的增加，總黃酮提取率呈先增加后減少的趨勢，當液料比為25∶1（m L∶g）時，總黃酮提取率達到最大值，這可能是因為增大液料比，溶劑的量也相應(yīng)增多，樣品在溶液中的分散程度增大，接觸面積也增大，有利于總黃酮的提取，但當液料比過大時，其中的雜質(zhì)（如可溶性的蛋白、多糖、果膠）溶出，這些雜質(zhì)可能吸附總黃酮或者和總黃酮結(jié)合，從而導致總黃酮提取率減小[26]。因此，選擇液料比為20∶1、25∶1、30∶1（m L∶g）進行正交試驗。

2.1.4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數(shù)對金線草主根總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇體積分數(shù)對金線草主根總黃酮提取的影響Fig.4 Effect o f ethanolconcentration on tota l flavonoids extraction from A.filiforme taproot

由圖4可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，總黃酮提取率先迅速增加后逐漸減少，當乙醇體積分數(shù)＜20%時，總黃酮提取率逐漸增大；當乙醇體積分數(shù)＞20%時，總黃酮提取率逐漸減小，這可能是由于乙醇體積分數(shù)過大，容易揮發(fā)，同時其他一些醇溶性物質(zhì)和脂溶性雜質(zhì)溶出的增加，導致總黃酮提取率下降[27]。因此，選擇乙醇體積分數(shù)為10%、20%、30%進行正交試驗。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以提取時間、提取溫度、液料比和乙醇體積分數(shù)為考察因素，采用L9（34）正交設(shè)計進行正交試驗，以確定最佳提取條件，試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 總黃酮提取工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 2 Resu lts of orthogonalexperiments for total flavonoids extraction conditions optim ization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonalexperim ents results

由表2可知，對總黃酮提取率影響大小的因素排序為提取溫度＞提取時間＞液料比＞乙醇體積分數(shù)。最佳組合為A1B3C2D1，即乙醇體積分數(shù)10%、提取溫度80℃、提取時間2.0 h、液料比20∶1（m L∶g）。由于A1B3C2D1不在所設(shè)計的正交表中，因此在最佳工藝條件下，進行5次驗證試驗，總黃酮平均提取率為（23.59±0.19）mg/g。

由表3可知，校正模型的P＜0.001，達到了極顯著水平，說明模型擬合度好，誤差為0.831，模型誤差較小，模型是合適的；校正模型的決定系數(shù)R2為0.999，校正決定系數(shù)R2Adj為0.998，說明試驗方法可靠，能較準確地描述試驗結(jié)果。4個因素的P值均＜0.001，說明4個因素在取值范圍內(nèi)對金線草主根總黃酮提取差異都極顯著。由F值的大小可知，影響總黃酮提取率大小的因素依次為提取溫度＞提取時間＞液料比＞乙醇體積分數(shù)，與極差分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗以金線草主根為材料，乙醇為提取溶劑，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對乙醇回流提取金線草主根總黃酮的工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)10%、提取時間2.0 h、液料比20∶1（m L∶g）、提取溫度80℃，在此最佳提取條件下，進行5次驗證試驗，總黃酮平均提取率為（23.59±0.19）mg/g。為進一步開發(fā)金線草的藥用價值提供一定理論依據(jù)。

[1]樊寶娟，劉雪峰，曾愛國，等.HPLC法測定金線草不同部位沒食子酸的含量[J].西北藥學雜志，2014，29（6）：573-575.

[2]曹望弟，王翠萍.金線草質(zhì)量標準研究[J].中國藥業(yè)，2012，21（20）：92-93.

[3]魯大軍，曾紅，賴林城，等.金線草的研究進展[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析，2015，15（9）：1269-1270.

[4]黃勇其，駱紅梅，陳秀芬，等.金線草藥理作用初步研究[J].中成藥，2004，26（11）：918-921.

[5]GONZáLEZR,LOBOG,GONZALEZM.Antioxidantactivity in banana peelextracts:testing extraction conditions and related bio active compounds[J].Food Chem,2010,119:1030-1039.

[6]LEE JH,PARK K H,LEEM H,et al.Identification,characterisation, and quantification of phenolic compounds in the antioxidant activitycontaining fraction from the seeds of Korean perilla(Perilla frutescens) cultivars[J].Food Chem,2013,136:843-852.

[7]柯春林，王娣，謝海偉，等.多酚化合物抗菌活性的最新進展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（17）：405-408.

[8]PETKOVSEKM M,SLATNAR A,STAMPAR F,etal.The influenceof organic/integrated production on the content of phenolic compounds in apple leavesand fruits in four different varieties over a 2-year period[J]. JSci Food Agr,2010,90(14):2366-2378.

[9]趙志永，蒲彬，賀玉鳳，等.響應(yīng)面法優(yōu)化新疆紅棗總黃酮乙醇提取工藝[J].中國釀造，2012，31（1）：88-90.

[10]舒俊生，黃桂東，毛健.滁菊95%乙醇提取液中黃酮類和酚酸類物質(zhì)的鑒定及分離[J].中國食品學報，2013，13（4）：207-213.

[11]黃菊，何偉平.響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取芹菜中黃酮的工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（14）：46-51.

[12]王麗霞，陳永勝，穆莎茉莉，等.乙醇浸提法提取蓖麻餅粕總黃酮的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2015，36（4）：282-285，309.

[13]千春錄，侯順超，殷健東，等.響應(yīng)面試驗優(yōu)化水芹黃酮超聲波輔助提取工藝及其抗氧化性[J].食品科學，2016，37（10）：76-81.

[14]陳建福，林洵，陳美慧，等.超聲波輔助提取石橄欖總黃酮的工藝[J].上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版，2016，34（2）：33-39.

[15]李麗，李杰民，盛金鳳，等.超聲波提取羅漢果渣中的黃酮優(yōu)化工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（15）：61-65.

[16]劉桂萍，崔博籍，孫久陽，等.微波輔助提取杜仲葉總黃酮工藝優(yōu)化[J].中國釀造，2015，34（5）：127-130.

[17]陳瑤，吳龍月，向福，等.泥蒿葉總黃酮的酶法提取及其抗氧化活性評價[J].中國釀造，2017，36（6）：142-146.

[18]鄧佑林，唐石，王美春，等.半仿生及超聲波輔助半仿生法提取杜仲葉黃酮[J].吉首大學學報：自然科學版，2017，38（2）：66-70.

[19]袁茹楠，胡浩斌，韓舜禹，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波提取甘草渣總黃酮工藝[J].中成藥，2017，39（3）：504-508.

[20]李俠，鄒基豪，王大為.響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波-酶法提取綠豆皮黃酮類化合物工藝[J].食品科學，2017，38（8）：206-212.

[21]趙友興，李紅芳，馬青云，等.金線草化學成分研究[J].中藥材，2011，34（5）：704-706.

[22]李玉紅，趙維，郭乃妮，等.蘋果皮總黃酮的提取及含量測定[J].化學與生物工程，2016，33（5）：68-70.

[23]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.GB/T 5009.3—2016食品中水分的測定方法[S].北京：中國標準出版社，2016.

[24]朱德艷.乙醇回流法提取葛根黃酮的工藝優(yōu)化研究[J].中國釀造，2015，34（11）：145-148.

[25]郝教敏，楊文平，李紅玉，等.黑麥類黃酮最佳提取條件及清除亞硝酸鹽能力研究[J].中國食品學報，2017，17（1）：126-133.

[26]代燕麗，沈維治，廖森泰，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取桑葉多酚工藝[J].熱帶作物學報，2016，37（8）：1588-1594.

[27]楊申明，王波，陳靖，等.乙醇回流法提取甜菜樹總黃酮及其抗氧化性評價[J].保鮮與加工，2016，16（4）：61-66.

Optim ization ofextraction processof total flavonoids from Antenoron filiforme taproot

FANG Lan1,2,QIU Shuyi1,2,ZHOU Hongxiang1,2,ZENGHaiying1,2,WANGXiaodan1,2*
(1.Guizhou Provincial Key Laboratory ofFermentation Engineering and BiologicalPharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 2.SchoolofLiquorand Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Using Antenoron filiforme taproot as raw material,the extraction process of total flavonoids from A.filiforme taprootwas researched by ethanol refluxing technology.On thebasisof single factorexperiments,the process conditionswereoptim ized by orthogonalexperiments.The results showed that the optimum extraction conditionsof total flavonoidswere ethanol concentration 10%,extraction temperature 80℃,time 2.0 h and liquid-solid ratio 20∶1(m l∶g).Under the conditions,the extraction rate of total flavonoidswasup to(23.59±0.19)mg/g.

Antenoron filiforme taproot;ethanol refluxing extractionmethod;total flavonoids;orthogonalexperiments

TQ 917

0254-5071（2017）08-0149-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.032

2017-05-15

貴州大學教育教學改革研究項目（JGYB201531）；貴州大學品牌特色專業(yè)建設(shè)（培育）項目（PTPY201303）；貴州大學“本科教學工程”建設(shè)項目（JG201641）

方蘭（1991-），女，碩士研究生，研究方向為生物活性物質(zhì)的提取分離。

*通訊作者：王曉丹（1980-），女，高級實驗師，博士，研究方向為應(yīng)用生物技術(shù)。