雷湘蘭，沈振國，孫倩*，鄭金明

（海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南?？?70216）

一株椰糠纖維降解菌的分離、鑒定及特性研究

雷湘蘭，沈振國，孫倩*，鄭金明

（海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院，海南?？?70216）

以椰糠作為碳源，從紅樹林土壤中分離了一株高產(chǎn)纖維素酶的真菌，命名為DZ10。經(jīng)形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)試驗，鑒定菌株DZ10為長枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）。該菌在pH值為6.5、培養(yǎng)溫度為35℃、初始NaCl含量為2.0%、添加K+終濃度為0.1mmol/L條件下，椰糠降解率最高為39.88%；在pH值為6.5、培養(yǎng)溫度40℃、初始NaCl含量3.0%、添加K+終濃度為0.1mmol/L條件下，羧甲基纖維素酶活力（CMCA）最高值為80.07U/m L；在pH值為6.0、培養(yǎng)溫度35℃、初始NaCl含量1.5%、添加K+終濃度為0.1mmol/L條件下，濾紙酶活力（FPA）最高值為73.81U/m L。Ca2+、K+對菌株DZ10產(chǎn)酶和椰糠降解率有促進作用，Mg2+抑制菌株DZ10產(chǎn)酶和椰糠降解率。

椰糠；纖維素酶；分離；鑒定；降解

我國熱帶地區(qū)椰子資源豐富，椰果加工后的留下大量的椰糠，椰糠纖維素的含量約為24%，經(jīng)過處理后可用于有機肥料生產(chǎn)、沼氣發(fā)酵、飼料添加等[1-2]。但大多數(shù)的椰糠被當作廢棄物堆積或焚燒處理，既污染環(huán)境又造成資源浪費。

微生物降解纖維素具有高效、環(huán)保等特點，微生物纖維素酶在釀造業(yè)中應(yīng)用廣泛[3]。本研究從紅樹林環(huán)境中分離篩選可降解椰糠纖維素的真菌，分離到9株纖維素降解菌株，最終篩選出1株纖維素酶高產(chǎn)菌株，并對椰糠纖維的降解特性做了分析比較，以期為椰子廢棄物纖維素資源的綜合利用和纖維素酶制劑開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣：海南東寨港紅樹林土壤。

磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）等（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；椰糠：市售。

椰糠纖維菌篩選培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，MgSO40.2 g，（NH4）2SO40.5 g，紅樹林滅菌海水100m L，椰糠粉4.0 g，慶大霉素1m L，蒸餾水900m L，瓊脂18.0 g，pH 6.8。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：CMC-Na15.0 g，磷酸二氫鉀1.5 g，氯化鈉0.5 g，硫酸鎂0.3 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水1 000m L，瓊脂18.0 g，pH 6.8。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：椰糠粉10.0 g，NaCl5.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.2 g，蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 000m L，pH 6.8。

椰糠液體培養(yǎng)基：椰糠粉20 g，NaCl5.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO41.0 g，葡萄糖1.0 g，（NH4）2SO42.0 g，蒸餾水1 000m L，pH 6.8。

1.2 儀器與設(shè)備

1-16k臺式高速冷凍離心機：德國Sigma公司；T100PCR儀：美國伯樂公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠；ZWY-2102立式中型全溫搖床、ZXSR-1090生化培養(yǎng)箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；GenШM icrostation BIOLOG自動微生物鑒定系統(tǒng)：美國BIOLOG公司；MagMax Express自動核酸提取儀：美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 椰糠纖維素降解菌初篩

取5g土樣溶解于50m L無菌蒸餾水中，旋渦振蕩10m in，懸液按10-1～10-5進行梯度稀釋，選擇合適稀釋度的菌液涂布于椰糠纖維菌篩選培養(yǎng)基上。培養(yǎng)皿28℃倒置培養(yǎng)，將長出的菌落挑取在真菌分離純化培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，純化后的菌株接種于真菌試管斜面培養(yǎng)基4℃保藏。獲得的純菌株點種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)基中加入1mg/m L剛果紅染液染色1 h，以1mol/L NaCl溶液沖洗并浸泡1 h，棄去NaCl溶液，觀察測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），以透明圈直徑和菌落直徑的比值大小D/d作為產(chǎn)纖維素酶能力的判斷依據(jù)。

1.3.2 椰糠纖維素降解菌復(fù)篩

（1）粗酶液制備：初篩獲得的菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、140 r/m in搖床培養(yǎng)6 d，取10m L發(fā)酵液4℃、3 500 r/min條件下離心20m in，吸取上清液保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）酶活測定：配制葡萄糖標準溶液，以二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法繪制葡萄糖標準曲線[4]。

1.3.3 菌種鑒定

（1）形態(tài)觀察：參照《真菌鑒定手冊》[5]。

（2）生理生化鑒定：以Biolog系統(tǒng)做碳源同化分析。

（3）分子鑒定：聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增中度保守的ITS區(qū)域，擴增條件見表1。擴增產(chǎn)物進行測序及提交GenBank序列比對。

表1 PCR擴增條件Table 1 Amplification condition of PCR

1.3.4 椰糠降解特性試驗

（1）不同pH對菌株降解椰糠的影響：用磷酸緩沖液調(diào)整椰糠液體培養(yǎng)基pH值，分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培養(yǎng)基于30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，計算不同pH值椰糠降解率。取10m L發(fā)酵液4℃、3 500 r/min條件下離心20min，吸取上清液測定羧甲基纖維素酶活（carboxymethylcelluloseenzymeactivity，CMCA）與濾紙酶活（filterpaperactivity，F(xiàn)PA）。

（2）不同培養(yǎng)溫度對菌株降解椰糠的影響：培養(yǎng)溫度設(shè)置為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，在最適pH值條件下120 r/m in振蕩培養(yǎng)7 d，計算不同培養(yǎng)溫度椰糠降解率，測定CMCA與FPA。

（3）不同初始NaCl含量對菌株降解椰糠的影響：椰糠液體培養(yǎng)基分別添加初始NaCl含量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%，在最適pH值和培養(yǎng)溫度條件下，120 r/m in振蕩培養(yǎng)7 d后，計算不同初始NaCl含量椰糠降解率，測定CMCA與FPA。

（4）金屬離子對菌株降解椰糠的影響：椰糠液體培養(yǎng)基分別添加CaCl2、MgCl2、MnSO4、KCl、CuSO4、FeCl2、ZnSO4，使各金屬離子的終濃度為0.1mmol/L，在最適pH值和培養(yǎng)溫度條件下，120 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后，計算不同金屬離子影響下椰糠降解率，測定CMCA與FPA。以未加金屬離子的椰糠降解率和酶活力為100%作為對照。

1.3.5 測定方法

（1）CMCA和FPA測定參照文獻[6-7]進行。

（2）椰糠降解率測定：椰糠液體培養(yǎng)基中接入5%菌種，30℃搖瓶培養(yǎng)。6 d后停止培養(yǎng)，過濾培養(yǎng)液，去離子水沖洗殘留物5～6次。殘留物80℃烘干至質(zhì)量恒定，計算椰糠降解率[8]，其計算公式如下：

式中：M 1為對照組椰糠質(zhì)量；M 2為降解后椰糠質(zhì)量；M為初始椰糠質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

經(jīng)梯度稀釋的紅樹林土壤懸液，涂布于椰糠纖維菌篩選培養(yǎng)基上，長出的菌落挑取在真菌分離純化培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，得到9株菌株。分別將純化后的菌株點種于CMC-Na培養(yǎng)基，經(jīng)剛果紅染色后測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的比值（D/d）大小。純化的菌株接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃、140 r/min搖床培養(yǎng)6 d，制得的粗酶液，測定CMCA與FPA，篩選結(jié)果見表2。

表2 纖維素降解菌株篩選結(jié)果Table 2 Screening results of cellulose-degrading strains

由表2可知，菌株DZ10的D/d值明顯高于其他菌株，酶活也最高。因此以菌株DZ10作為后續(xù)研究對象。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

菌株DZ10的形態(tài)特征見圖1。由圖1a可知，菌株DZ10菌落形態(tài)特征：菌絲呈現(xiàn)致密毛絨狀，培養(yǎng)初期菌落白色，長淺綠色孢子，培養(yǎng)至7 d后反面變?yōu)辄S綠色。由圖1b可知，菌絲側(cè)枝生出分生孢子梗，直且有分枝，孢子呈橢圓形。

圖1 菌株DZ10的形態(tài)特征Fig.1 Morpho logical characteristics of strain DZ10

經(jīng)Biolog生化系統(tǒng)分析，菌株DZ10利用較好的碳源有：L-谷氨酸、D-木糖、水楊苷、奎尼酸、D-甘露糖、D-核糖、2-酮-D-葡糖酸、L-巖藻糖、龍膽二糖、D-半乳糖、L-焦谷氨酸、B-環(huán)化糊精、甘油、L-阿拉伯糖、丙三醇、赤藻糖醇、L-鳥氨酸、D-山梨醇、葡萄糖胺等。

ITS的PCR擴增產(chǎn)物測序后提交GenBank獲得菌株序列號為：MF062685，用BLAST進行同源性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 菌株DZ10以ITS區(qū)為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS o f strain DZ10

由圖2可知，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、Biolog自動分析系統(tǒng)結(jié)合ITS序列分析，鑒定菌株DZ10為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

2.3 椰糠降解特性研究

2.3.1 不同pH對菌株降解椰糠的影響

圖3 不同pH值對菌株DZ10降解椰糠的影響Fig.3 Effects of different pH value on the coconut coir degradation of strain DZ10

由圖3可知，pH值為6.5時，椰糠降解率達到最高值25.5%，CMCA達到最高值57.03U/m L，pH值為6.0時FPA達到最高值53.07U/m L。pH值為5.0～7.0時，椰糠降解率、CMCA和FPA均保持在較高值，說明菌株DZ10產(chǎn)纖維素酶降解椰糠纖維，適合于pH值弱酸條件。結(jié)果表明，菌株D210降解椰糠的最適pH值為6.5。

2.3.2 不同培養(yǎng)溫度對菌株降解椰糠的影響

圖4 不同培養(yǎng)溫度對菌株DZ10降解椰糠的影響Fig.4 Effects of different culture tem perature on the coconut coir degradation of strain DZ10

由圖4可知，當培養(yǎng)溫度為35℃時椰糠降解率達到最高值27.3%，F(xiàn)PA達到最高值56.12U/m L，培養(yǎng)溫度為40℃時CMCA達到最高值58.30U/m L。培養(yǎng)溫度為30～40℃時椰糠降解率、CMCA和FPA均保持在較高值。結(jié)果表明，菌株D210降解椰糠的最適培養(yǎng)溫度為35℃。

2.3.3 不同初始NaCl含量對菌株降解椰糠的影響

由圖5可知，菌株DZ10表現(xiàn)出較好的耐鹽性，當初始NaCl含量為0.5%～3.0%時，菌株生長良好，酶活力保持在較高水平。當初始NaCl含量為2.0%時椰糠降解率達到最高值31.4%，當初始NaCl含量為1.5%時，F(xiàn)PA達到最高值57.22 U/m L，初始NaCl含量為3.0%時CMCA達到最高值61.12 U/m L。結(jié)果表明，菌株D210降解椰糠的最適初始NaCl含量為6.5。

圖5 不同初始NaCl含量對菌株DZ10降解椰糠的影響Fig.5 Effects of different initialNaCl concentration on the coconut coir degradation of strain DZ10

2.3.4 金屬離子對菌株降解椰糠的影響

圖6 金屬離子對菌株DZ10降解椰糠的影響Fig.6 Effects ofmeta l ions on the coconut coir degradation of strain DZ10

由圖6可知，Ca2+、K+對菌株DZ10產(chǎn)酶有促進作用且明顯提高椰糠降解率，而Mg2+抑制菌株DZ10產(chǎn)酶或抑制酶活性，降低了椰糠降解率。其他離子對產(chǎn)酶和椰糠降解影響不顯著。

3 結(jié)論

本研究從紅樹林土壤分離篩選出1株可用椰糠作為碳源，有較高產(chǎn)纖維素分解能力的菌株，編號為DZ10。經(jīng)形態(tài)特征培養(yǎng)觀察、生理生化分析和ITS分子序列特征比對，鑒定菌株DZ10為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。海南東寨港紅樹林土壤屬于典型的酸鹽土壤，對纖維素菌酶活性特征有較大影響[9-10]，pH值為5.0～7.0時，CMCA和FPA均保持在較高值。金屬離子對酶的影響，因不同環(huán)境分離到的不同菌種而情況各異[11-12]，Ca2+、K+對菌株DZ10酶活性有促進作用，而Mg2+抑制酶活性。結(jié)果顯示，當pH值為6.5、培養(yǎng)溫度為35℃、初始NaCl含量為2.0%、添加K+終濃度為0.1mmol/L時，椰糠降解率最高為39.88%。當pH值為6.5、培養(yǎng)溫度40℃、初始NaCl含量3.0%、添加K+終濃度為0.1mmol/L時，CMCA最高值為80.07 U/m L。當pH值為6.0、培養(yǎng)溫度35℃、初始NaCl含量1.5%、添加K+終濃度為0.1mmol/L，F(xiàn)PA最高值為73.81U/m L。

不同微生物所產(chǎn)纖維素酶的組分和性質(zhì)各不相同，纖維素在多種纖維素酶的協(xié)同作用下被逐步降解，纖維素酶組成比例也影響纖維素降解效果[13-15]。長枝木霉DZ10菌株對椰糠纖維顯示出較好的降解效果，可作為出發(fā)菌株進行改良研究，逐步用于生產(chǎn)。

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Isolation,identification and characteristicsofa coconutcoir fiber-decomposing strain

LEIXianglan,SHEN Zhenguo,SUN Qian*,ZHENG Jinm ing
(DepartmentofTropical Agricultural Technology,Hainan College ofVocation and Technique,Haikou 570216,China)

Using the coconutcoirasa carbon source,ahigh cellulase-producing strain named DZ10was isolated from mangrove soils.Bymorphology identification,physiological and biochemical properties and molecular biological experiments,strain DZ10 was identified as Trichoderma longibrachiatum.Under the conditions of pH 6.5,culture temperature 35℃,initial NaCl concentration 2.0%and K+final concentration 0.1mmol/L,the coconutcoir degradation ratewas thehighestof 39.88%.Under the conditionsof pH 6.5,culture temperature 40℃,initial NaCl concentration 3.0% and K+final concentration 0.1mmol/L,the activity of carboxymethyl cellulase(CMCA)was the highestof 80.07U/m l.Under the conditionsof pH 6.0,culture temperature 35℃,initial NaCl concentration 1.5%and K+final concentration 0.1mmol/L,the activity of filter paper lyasewas the highestof 73.81 U/m l.Ca2+and K+promoted the enzyme production and the degradation rate of strain DZ10,butMg2+inhibited the enzyme production and the degradation rateof strain DZ10.

coconutcoir;cellulase;isolation;identification;degradation

TQ920.6

0254-5071（2017）08-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.016

2017-05-31

海南省自然科學(xué)基金項目（314094）；海南省教育廳科研基金項目（HNJG2014-85）

雷湘蘭（1980-），女，講師，碩士，研究方向為食品微生物、食品加工。

*通訊作者：孫倩（1982-），女，講師，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。