胡閃耀，姜佳佳，楊 華，毛 翠，毛慧敏，王利通，王國水，左 波*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.浙江天蓬集團(tuán)有限公司，浙江 江山 324111；3.湖北省畜禽育種中心，湖北 武漢 430072）

大白豬ESR基因多態(tài)性與繁殖性狀的相關(guān)性研究

胡閃耀1，姜佳佳2，楊 華3，毛 翠2，毛慧敏2，王利通2，王國水2，左 波1*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.浙江天蓬集團(tuán)有限公司，浙江 江山 324111；3.湖北省畜禽育種中心，湖北 武漢 430072）

豬產(chǎn)仔數(shù)是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，提高產(chǎn)仔數(shù)可以增加豬肉的產(chǎn)量，為養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。該研究以美系大白豬（633頭）和法系大白豬（963頭）為研究對象，利用PCR-RFLP技術(shù)對ESR基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測，并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。研究結(jié)果表明：在美系和法系大白豬中均檢測到ESR基因存在3種基因型（AA、AB和BB基因型）；在美系和法系大白豬中，初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬ESR基因BB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重均顯著高于AB基因型和AA基因型個(gè)體（P＜0.05）。綜合來看，ESR基因變異對美系和法系大白母豬的產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重具有顯著的遺傳效應(yīng)，可以應(yīng)用于大白母豬產(chǎn)仔數(shù)的標(biāo)記輔助選擇。

豬；ESR；單核苷酸多態(tài)性；關(guān)聯(lián)分析

1 前言

雌激素受體（Estrogen receptor，ESR）是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子家族中的核酸受體，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)的生物功能，還可以影響雌激素基因在雌性脊椎動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)與調(diào)控。另外，雌激素與雌激素受體結(jié)合后對雌性動(dòng)物繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育具有重要作用。因此，Rothschild等將ESR基因作為影響豬產(chǎn)仔數(shù)的候選基因進(jìn)行研究，并首次在不同豬種中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)PvuⅡ酶切位點(diǎn)存在多態(tài)性，與母豬產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)[1]。肖璐等人（1997）的研究也發(fā)現(xiàn)，在梅山豬、二花臉豬、大白豬、長白豬和杜洛克豬群體中均能檢測到ESR基因PvuⅡ酶切位點(diǎn)存在多態(tài)性分布[2]。經(jīng)過專家學(xué)者們多年的研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因的PvuⅡ酶切位點(diǎn)多態(tài)性與豬的繁殖性狀存在顯著的關(guān)聯(lián)性，在多個(gè)豬種中BB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)都顯著高于AB和AA基因型個(gè)體[3-4]。目前，ESR基因已經(jīng)被認(rèn)定為影響豬繁殖性狀的一個(gè)候選基因，并在豬育種中得到應(yīng)用，為提高母豬產(chǎn)仔性能做出了巨大貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)在大白豬中研究ESR基因?qū)δ肛i繁殖性狀的影響，旨在為ESR基因在育種中的應(yīng)用提供更多的理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

美系大白豬633頭、法系大白豬963頭和6月齡法系大白豬組織樣9頭（采自浙江開盛生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司）。基因組DNA采用血液基因組DNA中量提取試劑盒（離心柱型）提取，于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

2.2 基因型檢測

本研究主要利用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因分型，所用引物根據(jù)Short T H（1997）發(fā)表的引物序列合成引物：（F）5′--CCTGTTTTTAC AGTGACTTTTACAGAG--3′，（R）5′--CACTTCGAGGGTCAGTCCA ATTAG--3′。

PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含以下成分：Sense primer（10 μM），0.5 μL；Antisense primer（10 μM），0.5 μL；ddH2O，8.0 μL；DNA，1.0 μL；2×Es Taq MasterMix（含染料），10.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，4 min；34個(gè)循環(huán)（94℃，30 s-Tm，40 s-72 ℃，根據(jù)片段長度有所不同，1 000 bp按30 s設(shè)計(jì)）；72 ℃，5 min；25 ℃，1 min。PCR產(chǎn)物利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

酶切反應(yīng)體系為20 μL，其中PCR production，10.0 μL； FastDigestPvuII，1.0μL；10×FastDigest Green Buffer，2.0 μL；ddH2O，7.0 μL。37 ℃消化30 min，然后利用3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照保存圖片，統(tǒng)計(jì)基因型。

2.3 基因效應(yīng)分析

本研究所采用模型為：Tijkl=μ+Gi+Fj+Yk+Pl+Am+eijklm，Tijkl為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)）；Fj、Yk、Pl、Am為固定效應(yīng)，分別為家系、季度、胎次、場次效應(yīng)，eijklm為殘差效應(yīng)。采用SAS軟件GLM模型自編程序完成。同時(shí)采用reg程序計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 ESR基因的PCR-PvuIIRFLP多態(tài)性檢測

ESR基因PCR產(chǎn)物長120 bp，如圖1所示；用PvuII內(nèi)切酶酶切后會(huì)產(chǎn)生55 bp和65 bp的片段，切開的片段與PCR產(chǎn)物長度相差較短，故采用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果如圖2所示，酶切后產(chǎn)生3種基因型分別為：AA型（120 bp），BB型（55 bp+65 bp），AB型（120 bp+65 bp+55 bp）。由于切開的兩個(gè)片段只相差10 bp，所以圖2中55 bp和65 bp的片段未能分離。

圖1 ESR基因PCR電泳結(jié)果

圖2 ESR基因PCR-PvuII-RFLP酶切分型結(jié)果

表1 大白豬ESR基因PvuII-RFLP基因型頻率和等位基因頻率

表2 ESR基因PvuII多態(tài)性與美系大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

表3 ESR基因PvuII多態(tài)性與法系大白豬繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析

3.2 ESR基因在大白豬群體中的基因頻率

本研究主要在美系和法系大白豬群體中對PvuII酶切位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測，在兩個(gè)群體中均檢測到3種基因型，基因頻率及分布情況如表1所示。

從表1可以看出，在兩個(gè)群體中A等位基因和B等位基因的頻率都比較接近，相差不大，B等位基因在法系大白豬群體中的分布頻率略高于美系大白豬。

3.3 ESR基因多態(tài)性與大白豬繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

對ESR基因多態(tài)性位點(diǎn)不同基因型與美系和法系大白豬的繁殖性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果分別見表2和表3。

由表2關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，ESR基因的多態(tài)性與總產(chǎn)仔數(shù)、出生窩重和健仔數(shù)間存在顯著的關(guān)聯(lián)性。在初產(chǎn)美系大白豬群體中，BB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和出生窩重都顯著（P〈0.05）高于AB、AA基因型個(gè)體；在經(jīng)產(chǎn)美系大白豬中，BB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、初生窩重和健仔數(shù)均顯著（P〈0.05）高于AA基因型個(gè)體。

從表3可以看出，ESR基因的多態(tài)性與總產(chǎn)仔數(shù)和健仔數(shù)間存在顯著的關(guān)聯(lián)性。在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)法系大白豬群體中，BB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)和健仔數(shù)都顯著（P〈0.05）高于AA基因型個(gè)體；BB基因型個(gè)體的初生窩重雖高于AB、 AA基因型個(gè)體，但差異并不顯著。分析結(jié)果說明，在美系和法系大白豬中，B等位基因都是提高總產(chǎn)仔數(shù)和健仔數(shù)的有利等位基因。

4 討論

ESR基因是早期發(fā)現(xiàn)與母豬繁殖性能相關(guān)的候選基因之一，大量研究也證明該基因的PvuII酶切位點(diǎn)多態(tài)性對母豬繁殖性能具有顯著影響。本研究利用PCR-PvuII-RFLP技術(shù)對ESR基因在美系大白和法系大白豬群體中的多態(tài)性進(jìn)行檢測，基因頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在美系和法系大白豬中A、B等位基因的頻率都比較接近，相差不大。關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，ESR基因?qū)Τ醍a(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)大白母豬的繁殖性能有顯著影響。

在美系大白豬中，BB基因型個(gè)體總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重均高于AB型個(gè)體和AA型個(gè)體。且在初產(chǎn)母豬群體中，不同基因型個(gè)體間的總產(chǎn)仔數(shù)和初生窩重差異達(dá)到顯著水平（P〈0.05），而健仔數(shù)差異不顯著；在經(jīng)產(chǎn)母豬中，3個(gè)基因型個(gè)體間的總產(chǎn)仔數(shù)和健仔數(shù)差異顯著（P〈0.05），而初生窩重差異不顯著。在法系大白母豬中，BB基因型個(gè)體的總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重也都高于AB和AA基因型個(gè)體，且在初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)母豬中，各個(gè)基因型個(gè)體間的總產(chǎn)仔數(shù)和健仔數(shù)差異都達(dá)到顯著水平（P〈0.05），而初生窩重則差異不顯著。

對比可以發(fā)現(xiàn)，AA、AB和BB基因型個(gè)體的健仔數(shù)及初生窩重，會(huì)因胎次和品系不同而導(dǎo)致差異顯著性不盡一致，但整體上B等位基因?qū)偖a(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)和初生窩重的加性效應(yīng)是一致的。本研究結(jié)果與部分報(bào)道的研究結(jié)果一致[5-10]，即B等位基因?qū)μ岣吣肛i的繁殖性能為有利等位基因。由此證明，ESR基因的B等位基因?qū)μ岣呙老岛头ㄏ荡蟀啄肛i的繁殖性能為有利等位基因，可以在今后的育種工作中優(yōu)先選留AB和BB基因型個(gè)體，從而提高母豬整體的繁殖性能。

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2017-04-06）

本項(xiàng)目受到國家科技支撐計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào)：2014BAD20B01）、浙江省重大科技專項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)：2014C02010）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)：2014PY038；2662016PY012）資助

胡閃耀（1988-），男，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖方面研究，E-mail：shy907530102@qq.com

*通訊作者：左波，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，動(dòng)科動(dòng)醫(yī)學(xué)院教授，E-mail：zuobo@mail.hzau.edu.cn