杜安定，譚艾娟＊ ，陳 婷，李?lèi)傂?，王珍燕，杜?guó)琴

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

貴州兩市豬源大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)

杜安定，譚艾娟＊ ，陳 婷，李?lèi)傂?，王珍燕，杜?guó)琴

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

為了解貴州安順、遵義市豬源細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥性，采用CLSI 推薦的雙紙片擴(kuò)散法，調(diào)查108株臨床分離的大腸桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌的比例。結(jié)果表明：遵義、安順兩市108株大腸桿菌確認(rèn)有72株ESBLs 陽(yáng)性菌株，檢出率66.7%(72/108)，其中遵義市（79.6%，43/54）檢出率高于安順市（53.7%，29/54），兩市豬源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的檢測(cè)率較高，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥較為嚴(yán)重。

耐藥性；β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素；產(chǎn)ESBLs大腸桿菌

β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素毒副作用小，抗菌活性強(qiáng)，抗菌譜廣，是人醫(yī)臨床上和獸醫(yī)臨床最常用的抗生素，隨著此類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，同時(shí)也造成畜產(chǎn)品中的抗生素藥物殘留增加，危害了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶降解此類(lèi)抗生素是其耐藥的主要機(jī)制，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamases ESBLs）主要由大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌等G-菌產(chǎn)生，可水解滅活青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，細(xì)菌產(chǎn)生ESBLs后可對(duì)多種β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)抗生素耐藥[4]，因此，可通過(guò)調(diào)查區(qū)域內(nèi)ESBLs菌株的比例來(lái)評(píng)價(jià)該區(qū)域內(nèi)細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥水平[5]。本研究對(duì)貴州省遵義、安順兩市豬源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs菌株的比例進(jìn)行了調(diào)查，以期對(duì)兩市β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的正確選用和降低細(xì)菌耐藥性危害提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)菌株：已鑒定的108株豬源大腸桿菌分別采自貴州遵義和安順地區(qū)。

質(zhì)控菌株：大腸埃希氏菌質(zhì)控菌株ATCC 25922，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

表1 藥敏紙片

1.1.2 培養(yǎng)基

LB肉湯：用于活化細(xì)菌。米勒-海頓瓊脂（MHA）：規(guī)格250 g/瓶，批號(hào)111226，購(gòu)自上海博微生物科技有限公司。

1.1.3 藥物

藥敏紙片：見(jiàn)表1。

1.2 方法

產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌篩選：按CLSI 推薦的紙片擴(kuò)散法進(jìn)行操作和結(jié)果判讀[6-7]。一般情況抑菌圈＜ 10 mm為低敏， 10 mm＜抑菌圈＜ 15 mm為中敏，15 mm＜抑菌圈＜ 20 mm為高敏，抑菌圈＞ 20 mm為極敏，無(wú)抑菌圈為不敏感[7]。

初篩實(shí)驗(yàn)：將受試菌株均勻涂布于M-H瓊脂平板，貼頭孢他啶（30 μg/片)和頭孢噻肟（30 μg/片)，37 ℃培養(yǎng)16～18 h。當(dāng)兩個(gè)藥物抑菌圈直徑滿(mǎn)足以下任一條件：即頭孢他啶 ≤ 22 mm，頭孢噻肟 ≤ 27 mm，判定為疑產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株，需進(jìn)一步作確證試驗(yàn)。以大腸埃希菌ATCC 25922作陰性對(duì)照，同時(shí)以肺炎克雷伯菌ATCC700603作陽(yáng)性對(duì)照。

確證實(shí)驗(yàn)：將受試菌株均勻涂布于M-H 瓊脂平板，分別貼頭孢他啶（30 μg/ mL)、頭孢他啶/克拉維酸（30/10 μg/片）以及頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸（30/10 μg/片）2 組紙片，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，細(xì)菌對(duì)兩個(gè)中任何一個(gè)藥物加克拉維酸后抑菌圈直徑與不加克拉維酸的抑菌圈相比，增大值 ≥ 5 mm時(shí)，判定為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌判定

如圖1所示，頭孢他啶抑菌圈 ≤ 22 mm，頭孢噻肟抑菌圈 ≤ 27 mm；同時(shí)，頭孢噻肟/克拉維酸抑菌圈 －頭孢噻肟抑菌圈 ≥ 5 mm，頭孢他啶/克拉維酸抑菌圈－頭孢他啶抑菌圈 ≥ 5 mm，因此，判定該菌為產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株。

2.2 遵義、安順兩市產(chǎn)ESBLs大腸桿菌檢測(cè)結(jié)果

108株大腸桿菌經(jīng)初篩和確證試驗(yàn)，有72株ESBLs陽(yáng)性菌株，檢出率66．7%，72/108，其中遵義市檢出率（79．6%，43/54）遠(yuǎn)高于安順市的（53．7%，29/54），詳見(jiàn)表2。

表2 108株大腸桿菌ESBLs菌檢測(cè)結(jié)果

圖1 產(chǎn)ESBLs大腸桿菌雙紙片篩選結(jié)果

3 討論

從青霉素應(yīng)用于細(xì)菌感染的治療后近100年來(lái)，抗菌藥物有效降低了人和動(dòng)物的細(xì)菌感染性疾病的危害，給人類(lèi)健康和生活水平的改善帶來(lái)巨大的福音。隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥水平不斷升高，使臨床治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)不斷加大，對(duì)人類(lèi)健康和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物高效、低毒、廣譜，是臨床最重要的抗生素，其包括青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)和非典型β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素等。細(xì)菌可通過(guò)產(chǎn)生降解藥物的β-內(nèi)酰胺酶、改變靶點(diǎn)對(duì)藥物的親和力、降低本身細(xì)胞膜的通透性、增強(qiáng)主動(dòng)外排等方式獲得對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥[8]；而產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌獲得高度耐藥的主要方式，而ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)，其可在不同細(xì)菌間廣泛傳播，產(chǎn)生對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的耐藥，在耐藥基因水平傳播中發(fā)揮重要作用。

2005-2012年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)（CH INET）結(jié)果顯示大腸桿菌中產(chǎn)ESBLs菌株的檢出率高[9]，并呈逐年增加的趨勢(shì)上升，直至2012年的檢出率高達(dá)55．3%。估計(jì)2012年至今，其結(jié)果一直處于上升趨勢(shì)[10]；本研究顯示也符合上述推斷。遵義市、安順市豬源產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌檢出率分別為79．6%和53．7%，明顯高于趙鳳菊[11]等報(bào)道的遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs 30．77%的檢出率。說(shuō)明β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素在該兩市的豬場(chǎng)中的使用率高于國(guó)內(nèi)部分地區(qū)。

建議兩市應(yīng)減少β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素在豬場(chǎng)的使用，以恢復(fù)細(xì)菌對(duì)此類(lèi)藥物的敏感性。

[1] 趙慶奎． 濫用抗生素對(duì)畜牧業(yè)的危害及對(duì)策[J]． 畜牧獸醫(yī)科技信息，2016(9)：39．

[2] 林紅華，黃冬菊．濫用抗生素對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展的危害及對(duì)策[J]． 福建農(nóng)業(yè)，2000(9)：18．

[3] 李培倉(cāng)． 抗生素濫用對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的危害及控制對(duì)策[J]． 中國(guó)動(dòng)物檢疫， 2009，26(6)：23-24．

[4] 呂霞， 李從榮． 產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌耐藥性檢測(cè)[J]．醫(yī)學(xué)臨床研究，2006，23(3)：353-355．

[5] 張珍珍． 重慶市豬源大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥性的研究[D]． 重慶：西南大學(xué)， 2009．

[6] NationalComm itteeforclinicalLaborator yStandards．Performancestandardsfora ntim icrobialdisksuscepti-bility tests[S]．A pp rovedstandard， 9thed．M 2-A 9．NCCLS， 2006．

[7] 黃志堅(jiān)． 紙片擴(kuò)散法在藥敏試驗(yàn)中的應(yīng)用[J]． 福建畜牧獸醫(yī)， 2004， 26(6)：9-10．

[8] 洪英， 黃雁， 魏良宇． 淺談紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)[J]． 福建畜牧獸醫(yī)， 2004，26(5)：56-57．

[9] 汪復(fù)， 朱德妹， 胡付品，等． 2012年中國(guó)CH INET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]． 中國(guó)感染與化療雜志， 2013，13(5)：325-333．

[10] 陸堅(jiān)， 唐英春． 細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的熱點(diǎn)問(wèn)題[J]． 國(guó)際醫(yī)學(xué)（內(nèi)科學(xué)分冊(cè)）， 2003， 30(9)：369-372．

[11] 趙鳳菊， 曹東， 李井春，等． 豬源大腸埃希菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)及其耐藥性分析[J]． 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017， 46(2)：111-115．

2017-06-19)

貴陽(yáng)市農(nóng)委科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（貴陽(yáng)市屠宰場(chǎng)豬肉致病菌污染調(diào)查及防控措施研究［ 筑科合（2010）12 -11］）

杜安定（1992-） , 男, 貴州湄潭人， 碩士研究生， 研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)

譚艾娟（1963-）， 女， 教授， 從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：ajtan@gzu.edu.cn