張玲妮，李岑岑（編譯）

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070）

VR-2332菌株豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗功效的相關(guān)研究

張玲妮，李岑岑（編譯）

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070）

薦語(yǔ)：來自VR-2332菌株（2型PRRSV的原型）的減毒疫苗（IngelvacPRRS MLV）已顯示能有效抵抗異源病毒分離物，并在許多國(guó)家都被廣泛使用。然而，據(jù)報(bào)道，HP-PRRS的病毒株表現(xiàn)出不同的毒力，這可能影響疫苗功效的評(píng)估。最近，Lager等人報(bào)道說，2007年分離的越南HP-PRRSV和中國(guó)的HP-PRRSV在用IngelvacPRRS MLV免疫的豬中具有不同的致病性潛力。Thuy等人比較了2007年至2010年間分離株中ORF5的基因突變并發(fā)現(xiàn)其存在一些差異。這些研究結(jié)果表明，需要進(jìn)一步評(píng)估目前可用的活疫苗的療效。

李岑岑，女（1989-），山東淄博人，畢業(yè)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，博士。

自20世紀(jì)80年代后期出現(xiàn)以來，豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）已經(jīng)在大多數(shù)養(yǎng)豬國(guó)家流行起來。PRRS的病原體是PRRS病毒（PRRSV），它是單股正鏈RNA病毒。2006年，中國(guó)出現(xiàn)了導(dǎo)致所有年齡的豬高熱和死亡的高致病性PRRS（HP-PRRS）。高毒性2型PRRSV已被檢測(cè)到，并鑒定了非結(jié)構(gòu)蛋白2（nsp2）中常見的缺失位點(diǎn)。HPPRRS由具有共同遺傳特征的病毒引起，現(xiàn)在已經(jīng)迅速蔓延到東南亞各國(guó)。在這里，我們以無特定病原體（SPF）仔豬作為試驗(yàn)對(duì)象，通過評(píng)估臨床特征，血清、唾液和器官中的病毒載體及肉眼和微觀病變來評(píng)估越南2010年分離株的體內(nèi)致病力和毒力以及IngelvacPRRS MLV的有效性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

4周齡的雜交SPF豬，在進(jìn)行試驗(yàn)之前，用市售的ELISA試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些豬為PRRSV陰性豬。這些豬被飼養(yǎng)在一個(gè)封閉的環(huán)境中。

1.2 病毒

2010年，在越南1頭感染了HPPRRS的豬體內(nèi)分離并經(jīng)MARC-145細(xì)胞傳代培養(yǎng)三代后獲得此病毒（10186-614菌株）。這個(gè)隔離株是由豬的肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）培養(yǎng)并傳了三代之后得到的。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和尸體剖檢

將25頭豬隨機(jī)分為3組：第1組（n=10）肌肉注射2 mL 2型PRRSV減毒活疫苗，并在接種4周后，用含有PRRSV 10186-614菌株1×105．550%組織感染劑量（TCID50/mL）的鼻噴霧裝置對(duì)其進(jìn)行人工感染。第2組（n=10）僅被感染了病毒，未免疫疫苗；第3組（n=5）作為對(duì)照組，未感染PRRSV病毒也未免疫疫苗。在試驗(yàn)過程中監(jiān)測(cè)豬的體溫、臨床癥狀和體重。所有的豬在接種病毒14 d（dpi）后進(jìn)行剖檢，并收集其組織用于病理、病毒學(xué)和細(xì)菌學(xué)的檢測(cè)。

1.4 血清學(xué)和PRRSV RNA的數(shù)量

采集接毒前28、21、14、7 d和接毒0、1、2、3、5、8、11和14 d豬只的血清，并檢測(cè)PRRSV的抗體和PRRSV RNA的數(shù)量。用棉簽來收集接毒0、1、2、3、5、8、11和14 d時(shí)每頭豬只的唾液，以便來定量PRRSV的RNA。在解剖時(shí)，收集肺、扁桃體、支氣管淋巴結(jié)、肝、腎和脾臟，并檢測(cè)這些組織中PRRSV的RNA含量。

1.5 開放閱讀框5區(qū)域的序列分析

在HP-PRRSV接毒前7 d和接毒0 d、3 d和8 d的血清中提取的病毒RNA中隨機(jī)挑選3個(gè)RNA樣本。為了檢測(cè)ORF5基因，使用已發(fā)表的PCR引物對(duì)（P420：5’-CCATTCTGTTGGCAATTTGA-3’和P620：5’-GGCATATATCATCACTGGCG-3’）提取的RNA進(jìn)行一步法RT-PCR。

1.6 病理學(xué)檢查

在剖檢時(shí)，對(duì)每頭豬的所有器官進(jìn)行外觀檢查，并將肺部總體的損傷從0到100進(jìn)行評(píng)分。分別給7個(gè)肺葉（左右兩側(cè)的前端、中間和尾部，還有副葉）標(biāo)記一個(gè)數(shù)字并對(duì)其進(jìn)行評(píng)分，從而反映可見性肺炎的嚴(yán)重程度，最后對(duì)所有肺葉的總得分進(jìn)行評(píng)估。對(duì)上述7個(gè)肺葉以及肝臟、腎臟、脾臟、心臟、腦和淋巴器官做了組織切片并用顯微鏡進(jìn)行觀察。顯微鏡下對(duì)肺損傷進(jìn)行評(píng)分，以此來反映間質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重程度，然后計(jì)算整體的平均值。

1.7 細(xì)菌分離

在試驗(yàn)開始時(shí)收集每頭豬的鼻拭子，并從每個(gè)尸體上收集組織（肺、肝臟、腎臟、脾臟、心臟和腦）用于細(xì)菌實(shí)驗(yàn)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用R語(yǔ)言里的“EZR”軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較和各自之間的兩兩比較分析，P＜0．05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體溫

在感染PRRSV病毒之前，3組在平均直腸溫度方面沒有顯著差異。在接毒后的第2天到第14天，第1組和第2組的平均直腸溫度顯著高于對(duì)照組。在接種第9天到第13天之間，第1組的體溫顯著低于第2組。

2.2 臨床癥狀

在接毒2 d或3 d一直到接毒第8天，兩組都出現(xiàn)食欲不振和呼吸急促的癥狀，且第1組的大部分豬都在恢復(fù)中。相比之下，接毒第9天后，第2組的豬仍然出現(xiàn)食欲不振和呼吸急促的癥狀，并伴有嚴(yán)重的咳嗽和腹式呼吸。這些臨床癥狀一直持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。從接毒第9天到第14天，第1組的臨床評(píng)分顯著低于第2組。在未感染的豬中沒有觀察到臨床癥狀。

2.3 日增重

在接毒第3天后，3組之間的平均日增重明顯不同。在感染病毒后，第2組中平均日增重沒有增加。在接毒第8天后，第1組和第2組之間的平均日增重存在顯著差異。

2.4 血清與唾液里的病毒載量

兩個(gè)接毒組從接毒第1天到第5天血清病毒載量大幅度上升，在接毒第5天到達(dá)高峰。從接毒第5天到第14天，第2組血清中的病毒載量始終居高不下，而第1組的血清病毒載量迅速下降。兩個(gè)接毒組在接毒第1天到第14天，在口腔液中都可以檢測(cè)到病毒，并在病毒攻擊后的第5天到達(dá)高峰。但在接毒第11天到第14天，這兩個(gè)接毒組的病毒釋放存在顯著差異。在第3組豬的血清或者口腔液中都沒有檢測(cè)到病毒RNA。

2.5 ORF5區(qū)域序列分析

為了證實(shí)RT-PCR的產(chǎn)物是由第1組和第2組在接毒1天后的病毒RNA擴(kuò)增而來，每個(gè)RT-PCR產(chǎn)物的序列都與疫苗株和HP-PRRSV進(jìn)行了比較。對(duì)于接毒前7天和接種0天擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物而言，ORF5與疫苗株享有99．5%～99．7%的核苷酸同一性，與HP-PRRSV則是88．6%～89．1%。

2.6 PRRSV抗體

第1組的一些豬在免疫疫苗7天后檢測(cè)到了PRRSV抗體，在免疫第14天除了1頭豬（S/P=0．38）以外其他所有豬都超過了分界線（S/P=0．4）。這個(gè)S/P比值是逐漸上升的，在免疫第8天時(shí)觀察到一個(gè)瞬時(shí)增加。在第2組中，在接毒第8天觀察到PRRSV抗體的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化，而且病毒抗體的S/P比值呈逐漸上升趨勢(shì)。相反的，在第3組中沒有觀察到抵抗PRRSV的抗體。

2.7 組織中的病毒RNA

檢測(cè)第1組和第2組中所有檢測(cè)器官（肝臟、腎臟、肺、脾臟、扁桃體和支氣管淋巴結(jié)）的PRRSV的RNA含量。第1組中肺臟、肝臟、腎臟和扁桃體中PRRSV的RNA的數(shù)量低于第2組。然而，第1組和第2組里脾臟和支氣管淋巴結(jié)里PRRSV RNA的數(shù)量之間無顯著差異。第3組沒有檢測(cè)到PRRSV的RNA。

2.8 組織學(xué)病變

第2組豬只的主要嚴(yán)重病變?yōu)榉窝缀托叵傥s。這些豬的肺部病變特征為全葉出現(xiàn)黃褐色腫脹或者前葉、中葉、副葉和尾葉的額部出現(xiàn)邊界清晰的深紅色肺炎癥狀。相反，第1組中大多數(shù)豬的肺部都出現(xiàn)輕微的變色腫脹。第2組的平均肺部病變?cè)u(píng)分為57．9±18．3，第1組為12．5±6．9，二者之間存在顯著差異。且在第1組中未觀察到胸腺萎縮。

顯微鏡下，第2組的肺炎病變特征是重癥壞死性間質(zhì)性肺炎，還能觀察到II型肺細(xì)胞肥大增生，巨噬細(xì)胞間隔浸潤(rùn)以及多灶性肺泡壁血管周圍組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。相反，第1組的肺炎病變特征是多灶性肺泡壁血管周圍發(fā)生輕微到中度的組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。第1組的微觀肺炎評(píng)分（1．2±0．5）顯著低于第2組（2．7±0．5）。值得注意的是，在第3組中沒有觀察到總體或微觀損傷。

2.9 細(xì)菌檢驗(yàn)

在試驗(yàn)開始前，從每組3頭豬的鼻拭子中分離出鏈球菌，但是這些豬的剖檢結(jié)果相對(duì)其他豬來說并不顯著。

3 討論

我們將越南2010年高致病性PRRSV的分離株通過對(duì)SPF豬鼻接毒再現(xiàn)了HP-PRRSV的病理狀況，并評(píng)估了市售的2型PRRSV疫苗的功效。與非免疫動(dòng)物相比，用改良的PRRSV活疫苗免疫后，豬只的病毒復(fù)制量、唾液中病毒釋放、臨床癥狀和病變嚴(yán)重程度發(fā)生了顯著降低現(xiàn)象，而平均日增重明顯提高。

這項(xiàng)研究中未免疫疫苗的動(dòng)物出現(xiàn)持續(xù)高熱和嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎的癥狀。這些發(fā)現(xiàn)與用高致病性PRRSV感染動(dòng)物出現(xiàn)的病理特征相符。此外，未免疫疫苗的豬發(fā)生了胸腺萎縮，Guo等人提出這是HP-PSSRV感染的獨(dú)特病理特征。上述結(jié)果可能可以證實(shí)這種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢杂脕碓u(píng)估HP-PRRSV感染后的結(jié)果。

雖然免疫組和未免疫組在感染病毒后直腸溫度都升高，但免疫組顯著降低了高燒的持續(xù)時(shí)間。在退熱的同時(shí)，免疫組的呼吸道癥狀也明顯減輕。組織學(xué)檢測(cè)顯示，免疫組豬只的肺炎病變范圍和程度均低于未免疫組的豬只。這些臨床癥狀和病理結(jié)果的改善可能會(huì)導(dǎo)致體重的增加。qRT-PCR的縱向數(shù)據(jù)表明免疫組豬只的病毒血癥增加，且與未免疫組相比其發(fā)生了迅速地下降?？紤]到免疫組在早期會(huì)發(fā)生發(fā)熱現(xiàn)象，這種病毒的動(dòng)力學(xué)變化可能表明在早期階段，疫苗免疫有助于清除感染組織中的病毒，而不是抑制病毒的增殖。這個(gè)研究的幾個(gè)限制因素值得一提。首先，雖然我們使用了對(duì)10186-614菌株有效的疫苗（Ingelvac PRRS?MLV），但是很難預(yù)測(cè)其是否對(duì)其他HP-PRRSV變異體是否有效。其次，我們沒有闡明體液免疫和細(xì)胞免疫是如何抑制豬中病毒的復(fù)制。

總之，我們發(fā)現(xiàn)免疫改進(jìn)后的PRRSV活疫苗可以顯著降低病毒的復(fù)制能力和病變的嚴(yán)重程度。此外，它有助于改善感染了2010年越南HPPRRSV分離株的豬只的臨床癥狀。這些發(fā)現(xiàn)表明這種疫苗在控制HPPRRSV上具有潛在的廣泛應(yīng)用。此外，PRRSV的繼發(fā)感染會(huì)造成經(jīng)濟(jì)損失。免疫疫苗后，病毒對(duì)免疫系統(tǒng)器官的影響會(huì)減少，這可能會(huì)抑制繼發(fā)性感染，并有助于降低經(jīng)濟(jì)成本。

（原文作者：Iseki H,Kawashima K,Tung N,Inui K,Ikezawa M,Shibahara T,Yamakawa M；原文鏈接：https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28239040）

2017-04-19）