關(guān)瑞橋，鄒偉，于學(xué)平，孫曉偉，戴曉紅，滕偉，張鑫，袁夢飛

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

針刺“百會”透“曲鬢”對急性腦出血大鼠血清中P選擇素(CD62p)的表達影響的實驗研究

關(guān)瑞橋1，鄒偉2*，于學(xué)平2，孫曉偉2，戴曉紅2，滕偉2，張鑫2，袁夢飛1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的:通過觀察 “百會” 透 “曲鬢”頭針針刺法對急性腦出血大鼠腦組織中CD62p表達的影響，來揭示針刺頭部腧穴對腦出血后炎癥反應(yīng)影響的相關(guān)機理方法：選取132只雄性Wistar大鼠隨機分3組：空白對照組12只大鼠，腦出血模型組，針刺治療組各60只大鼠。后兩組又隨機分為6 h，24 h，3 d，7 d四個亞組，每組大鼠數(shù)量均等。針刺組分別于相應(yīng)的時間點進行針刺治療，空白組，腦出血作為對照組不做處理。在完成治療后，于相應(yīng)的時間點對大鼠進行神經(jīng)功能評分，然后處死大鼠提取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血漿CD62p表達水平。結(jié)果：經(jīng)針刺治療后，針刺組大鼠的神經(jīng)功能缺損體征較同時間點的腦出血對照組明顯減輕，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CD62p酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果顯示，腦出血組，針刺組CD62p水平較空白組明顯增高，并有顯著差異(P<0.01)；針刺組腦組織中CD62p水平較相應(yīng)時間段的腦出血組低，并有顯著差異(P<0.01)；腦出血組，針刺組在3d時腦組織中CD62p含量較其他時間段高，并有顯著差異(P<0.01)。結(jié)論：“百會透曲鬢” 針刺法可明顯改善大鼠的神經(jīng)功能學(xué)評分，有利于腦出血后肢體運動功能的恢復(fù)；“百會”透“曲鬢”針刺療法，可能通過抑制CD62p在血小板膜上的表達，從而在一定程度上抑制腦出血后炎癥反應(yīng)，及腦水腫的形成。

“百會”透“曲鬢”針刺療法；急性腦出血；炎癥反應(yīng)；CD62p

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性腦實質(zhì)出血，占所有中腦出血卒中的10%～17%，急性腦出血的死亡率和致殘率極高。近年來研究表明[1-3]，腦出血后神經(jīng)功能進一步惡化的原因主要由于血腫周圍腦組織繼發(fā)性腦水腫和腦損傷所致。炎癥反應(yīng)是造成繼發(fā)性腦損傷的重要原因，其中血小板的活化，是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵過程之一。本次課題以腦出血后的炎癥反應(yīng)為著手點，選擇CD62p作為檢測指標(biāo)。

CD62p屬于選擇素家族，是一種相對分子量為140KD的跨膜糖蛋白，存在于活化的血小板膜上，定位于血小板α-顆粒和內(nèi)皮細胞Weible-palade小體內(nèi)[4]。血小板活化時CD62p分子在血小板膜上表達，介導(dǎo)血小板與粒細胞及內(nèi)皮細胞的粘附與連接CD62p在其他粘附分子的協(xié)助下，使白細胞穿過血管壁進入腦實質(zhì)，導(dǎo)致缺血區(qū)腦組織的損傷水腫。

實驗通過針刺“百會”透“曲鬢”穴，觀察在針刺治療過程中，CD62p在腦出血大鼠血清中的動態(tài)變化，從而探究CD69p與腦出血后炎癥反應(yīng)，血栓等形成的關(guān)系，進一步了解腦出血嚴重程度及預(yù)后。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

清潔級Wistar雄性健康大鼠，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(合格證書號：SCXK (黑)20150023 )，體質(zhì)量(300±20)g，室溫條件下飼養(yǎng)，自由攝食，給予清潔飲用水，實驗前正常飼養(yǎng)1周，造模前禁食12 h，禁水6 h。

1.1.2 主要儀器

立體定位儀(STW-1型，中國成都儀器廠)；微量注射器(YY0088-92型，寧波市鎮(zhèn)江三愛儀器廠);臺式牙鉆機(307-6型，中國上海齒科醫(yī)械廠)；酶標(biāo)儀(美國Bio-TEK公司synergyHT型)；大鼠P選擇素酶聯(lián)分析法試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立

腦出血模型的制備模型制備方法依照鄒氏法和Rosenberg法[5]，并依需要改良。首先腹腔注射水合氯醛麻醉(10%，300 mg/kg)，將大鼠常規(guī)備皮后俯臥固定在立體定位儀上并固定。用碘伏在手術(shù)處進行消毒后，在頭部正中做縱型切口，暴露骨膜及前囟點，用無菌鑷子剝離骨膜后，以前囟為中心，在前囟點右側(cè)3.5 mm，后0.2 mm處做標(biāo)記，再用牙鉆在標(biāo)記點處鉆出直徑為0.1 mm的圓孔，深度需達硬膜表面。注血采用自體尾尖取血，在尾尖用剪刀剪斷，用微量注射器吸取50 μL血液。將微量注射器固定于立體定位儀上，將針頭插入前囟孔約6 mm，將50 μL尾尖血緩慢注射進尾殼核，速度約為20 μL/min，全部注入后留針約5 min，然后緩慢出針。在留針同時消毒大鼠尾部傷口后包扎。術(shù)后用牙科磷酸鋅水門汀封閉顱骨鉆孔，并在傷口處用慶大霉素消毒以防感染。最后縫合大鼠頭部皮膚，用碘伏消毒防止感染?？瞻讓φ战M大鼠不做任何處置，并按標(biāo)準飼養(yǎng)。

1.2.2 行為學(xué)觀察

待大鼠在手術(shù)后完全清醒，在相應(yīng)時間點，即6 h,24 h,3 d,7 d進行神經(jīng)功能缺損評價，采用Berderson[6]評分方法對大鼠神經(jīng)功能進行評分。具體標(biāo)準如下 ：①輕抓大鼠尾巴提起高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直，無神經(jīng)功能缺損;② 無任何神經(jīng)功能缺損，0分 ； ③大鼠腦出血病變對側(cè)腕關(guān)節(jié)，肘關(guān)節(jié)屈曲，肩部內(nèi)收，1分； ④上述體征伴有向麻痹側(cè)推阻力下降，2分； ⑤行走時時向麻搏側(cè)打圈，表現(xiàn)出追尾狀，3分。

1.2.3 實驗動物的干預(yù)方法

經(jīng)神經(jīng)體征評分篩選出132只雄性Wistar大鼠，隨機分3組：空白對照組12只，腦出血模型組，針刺治療組各60只。后兩組又隨機分為6 h，24 h，3 d，7 d四個亞組(每組大鼠數(shù)量均等)。其中腦出血模型組和針刺治療組按上述方法制備腦出血模型，空白組不做任何處理，并按標(biāo)準飼養(yǎng)。

腦出血模型組：實驗過程中以和針刺組同樣的方式捆綁大鼠，每次30 min，每天1次。

針刺治療組：在大鼠手術(shù)清醒后針刺治療，6 h組1次，24 h組1次，3 d、7 d組每日1次。用華佗牌28號1寸毫針，向右百會透刺曲鬢穴，取血標(biāo)準參照《實驗動物學(xué)圖譜》[7]，進針約0.8寸，留針30 min，期間捻針3次，每次2 min,速度不少于200 r/min?？瞻捉M：不做任何處理，并按標(biāo)準飼養(yǎng)。

1.2.4 血清中選擇素CD62p的測定

本次實驗采用腹主動脈采血法，腹腔注射水合氯醛麻醉(10%，300 mg/kg)后。將大鼠仰臥固定在手術(shù)臺上。消毒后沿腹正中線剪開腹腔。將腸管及組織移向左側(cè)腹部，暴露右側(cè)顏色稍白的腹主動脈。手術(shù)者右手持 5mL空針，針尖斜面朝下，以25°～30°刺入腹主動脈，深度約5 mm左右，抽吸血液，每只大鼠采血約5 mL。 取血后靜置20 min， 用離心機以3 000/min的速度離心20 min，分離后取上清液，-20 ℃冰箱冷凍備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)進行CD62p測定,操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3 結(jié)果分析

2 實驗結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損體征評分

各組大鼠于相應(yīng)的時間點，在取材前進行神經(jīng)功能評分，觀察并記錄。由表1可見，空白組因不做任何處理，沒有神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，為0分。而經(jīng)過腦出血造模手術(shù)并合格的大鼠，在術(shù)后不同的時間點表現(xiàn)出不同的神經(jīng)功能損傷體征，包括爬行時向右側(cè)(健側(cè))傾斜、劃圈，另一側(cè)(左側(cè))癱瘓的前肢屈曲而內(nèi)收，癱瘓側(cè)(左側(cè))后肢向后外伸展。在手術(shù)后第3天時，神經(jīng)功能損傷癥狀最為嚴重，如追尾動作，各項癱瘓體征加重等；在第7天時各組已經(jīng)有明顯好轉(zhuǎn)。

表1 Berderson大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

注：與空白組比較，☆P<0.05；與模型組比較，★P<0.05

其中經(jīng)過針刺治療的大鼠，在各個時間段神經(jīng)功能損傷的體征較模型組不同程度減輕。在6 h時，評分顯示差異不明顯，往后自24 h，3 d，7 d，評分與模型組比較差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。

圖1 各時間段每組Berderson評分比較

2.2 各組大鼠血清中CD62p的含量

2.2.1 不同組間及不同時間點CD62p濃度比較

對數(shù)據(jù)整理分析后進行重復(fù)測量設(shè)計方差分析。單獨分析組別和時間變量時，不同組間CD62p濃度不同,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.31,P<0.01)；不同時間之間CD62p濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=63.43,P<0.01) (見表2)。組別、時間及交互作用均進入模型后參數(shù)估計結(jié)果顯示仍具有統(tǒng)計學(xué)意義，即時間與組別存在交互作用，說明各組間不同時間點CD62p濃度變化趨勢有差異，通過趨勢性分析可知不同組隨著時間的推移, 模型組與針刺組均表現(xiàn)為先升后降，均在第3天是達到濃度高峰(見圖3)。

圖2 各時間段各組CD62p濃度比較

圖3 時間與組別間交互作用圖

組別(編號)n6h(ng/L)24(ng/L)3d(ng/L)7d(ng/L)F(組間)P模型組(1)601.71±0.293.02±0.374.00±0.303.35±0.32針刺組(2)601.74±0.312.59±0.273.31±0.382.01±0.385.310.001空白組(3)121.74±0.361.78±0.321.79±0.311.77±0.31F(時點)63.43P<0.01

2.2.2 進一步對交互項進行分析結(jié)果

控制組別這一變量，觀察時點上的差異：觀察時點為6 h(0.25 d)時，三組間無差異(F=0.03,P=0.97>0.05),而24 h(1 d)、3 d、7 d三個時間點，三組差異均具有統(tǒng)計學(xué)意(P<0.001),通過比較均值，可見模型組24 h(1 d)、3 d、7 d三個時間點均高于針刺組，可見針刺組治療有效。

表3 固定組別，分析時間效應(yīng)

控制時間比較組別差異：模型組和針刺組，各時點間濃度值差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，各時點間CD62p濃度變化趨勢均為先升后降(峰值在3 d處)?？瞻讓φ战M各時點之間CD62p濃度差別無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.92,P>0.05),時點間濃度值變化波動不大。

表4 固定時間，分析組別效應(yīng)

3 討論

近年來，在出血性腦卒中疾病機制中，血小板凝集，血栓的形成，腦出血后炎癥細胞的浸潤，為腦出血早期的治療和預(yù)防帶來了新的影響。在此過程當(dāng)中，血小板跨膜糖蛋白在血小板的附著，聚集，粘附作用是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵點。

P-選擇素主要分布于胞內(nèi)貯存顆粒即血小板α顆粒及內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade小體, 又見于微靜脈、小靜脈的內(nèi)皮細胞中[8]。在與凝血酶，組胺，補體及活性氧反應(yīng)的過程中，P-選擇素與漿膜融合，而在漿膜表面表達，在上述反應(yīng)約20min后表達量下降，有部分P-選擇素釋放入血液中。高表達的P-選擇素介導(dǎo)血小板，內(nèi)皮細胞粘附，啟動炎癥反應(yīng)，與血栓形成有密切關(guān)系。選擇素發(fā)揮作用需要與相應(yīng)的配體相互反應(yīng)，配體包括糖類配體和蛋白類配體兩部分[9]。在生理反應(yīng)過程中，P-選擇素的配體一般都是糖蛋白，選擇素配體是多種多樣的。參與的反應(yīng)也不同。P選擇素與配體相結(jié)合，在腦出血類疾病當(dāng)中，主要參與的過程有，腦出血的炎癥過程(介導(dǎo)炎癥過程中白細胞的起始粘附)，缺血再灌注損傷過程以及血栓的形成等。

在腦出血后的炎癥反應(yīng)，白細胞穿越血管壁進入組織間隙，此過程為最重要的病理過程。其過程主要有：白細胞的滾動、 激活和緊密黏附、 移行[10]。

P選擇素在這個過程中參與炎癥反應(yīng)的起始過程(白細胞在內(nèi)皮上的滾動)。因此干預(yù)P選擇素的表達，或者抑制其與配體的結(jié)合，是抑制腦出血后炎癥反應(yīng)，阻止腦出血后腦組織進一步損傷的重要思路。P選擇素也可以作為早起血栓形成，以及炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志物。

本實驗ELISA 結(jié)果顯示CD62p在腦出血后表達明顯升高，說明了血小板膜上的CD62p表達開始增高，是反應(yīng)腦出血后炎癥反應(yīng)嚴重程度的表現(xiàn)。CD62p的表達在腦出血后第3天達到高峰，隨后開始下降，為正態(tài)分布形式。而空白組的CD62p表達含量明顯低于腦出血組和針刺組大鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)過針刺治療的大鼠，在各個時間段，CD62p的表達含量較腦出血組都有不同程度的降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)觀察，隨著炎癥反應(yīng)的進行，CD62p在血清中的表達變化，觀察到大鼠的神經(jīng)功能缺損體征也隨之加重或減輕。因此可以證明本次課題的結(jié)論，“百會透曲鬢”對抑制腦出血后炎癥反應(yīng)有一定的作用，減輕腦組織的進一步損傷。即通過抑制炎癥反應(yīng)，減輕腦出血后一系列腦組織的損傷反應(yīng)，減輕神經(jīng)功能的損傷。研究針刺對腦出血的治療作用，為腦出血的治療及后期復(fù)恢提供了新的思路，也驗證了針刺治療腦出血的明確作用。為今后臨床治療和藥物的研發(fā)提供了新的方向。

近年來，中醫(yī)治療腦出血及其后遺癥方面有了很大的進展。針灸作為一種治療手段，在臨床和實驗方面都取得了良好的效果[11-13]。針灸的作用原理研究是針灸學(xué)與現(xiàn)代科學(xué)的觀念與技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，研究和實踐明確了針灸對疾病的作用其生物效應(yīng)的機理。

本課題以CD62p為檢測指標(biāo)，觀察“百會透曲鬢”針刺法對急性腦出血后炎癥反應(yīng)的作用，證明了針刺對緩解抑制大鼠腦出血后炎癥有一定的作用，進一步明確了頭針治療大鼠急性腦出血的機理和療效。為腦出血的研究和臨床的治療指明了新的方向，提供了新的成果。

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Expression of CD62p in Acute Cerebral Hemorrhage Rats Intervened by Acupunture of Baihui-to-Qubin

GUAN Rui-qiao1, ZOU Wei2, YU Xue-ping2, SUN Xiao-wei2, DAI Xiao-hong2,TENG Wei2, ZHANG Xin2, YUAN Meng-fei1

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To investigate the effectiveness of acupuncture to the inflammation after cerebral hemorrhage through observing the influence of the expression of CD62p after acute cerebral hemorrhage in rats by acupuncturing Baihui-to-Qubin. Methods：132 Male Wistar rats were randomly divided into the blank group(12 rats), the model group(60 rats), and the acupuncture group(60 rats), of which the last two groups were randomly and evenly divided into four sub-groups as different time point: 6 h, 24 h, 3 d, and 7 d. Acupuncture group was treated by acupuncture at different time, whereas the blank group and the model group were not intervened. After treatment, the scores of nerve function were assessed at different points of time, and serum levels of CD62p were detected in each group with ELISA method. Results:The neurological impairment was significantly alleviated after acupuncture treatment compared to the model group at the same time point (P<0.01). ELISA result: The expression of CD62p in the rats' brain which have cerebral hemorrhage was obviously higher than that of the blank group, and the difference was statistically significant (P<0.01); CD62p expression of the acupuncture group was obviously lower than that of the model group at the same time point (P<0.01); The expression of CD62p reached the peak on the 3rd day after operation, there was a significant difference compared to the other time point (P<0.01). Conclusion：Acupuncture of Baihui-to-Qubin can obviously raise the scores of nerve function，and have the benefit for improvement of extremity function after cerebral hemorrhage. Also, this treatment can suppress the expression of CD62p in the membranes of blood platelets, to restrain the formation of encephaledema and inhibit the inflammation reaction.

Acupuncture therapy of Baihui-to-Qubin; Acute cerebral hemorrhage; Inflammation reaction; CD62p

2016-08-20

2017-03-20

國家自然科學(xué)基金面上項目(81273824)；黑龍江省自然科學(xué)基金重點項目(ZD201204)；教育部博士點基金(20102327110003)；教育部春暉計劃項目(Z2007-1-15010)

關(guān)瑞橋(1989-)， 女，博士研究生 ，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疑難雜病。

*通訊作者：鄒偉(1965-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疑難雜病。

R245.32+1

A

1002-2392(2017)04-0074-05