王超，劉薇薇，黃潔，劉密，譚成富，常小榮，嚴(yán)潔

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

針 灸 經(jīng) 絡(luò)

不同艾灸預(yù)處理時(shí)間對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3表達(dá)的影響

王超1，劉薇薇1，黃潔2*，劉密1，譚成富1，常小榮1，嚴(yán)潔1

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

目的：通過觀察不同艾灸預(yù)處理時(shí)間對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3) 蛋白和基因表達(dá)的變化，探討艾灸預(yù)處理對(duì)MIRI預(yù)防保護(hù)機(jī)制。方法：將40只大鼠分為正常組、模型組、艾灸預(yù)處理5天組、艾灸預(yù)處理10天組。取“內(nèi)關(guān)”穴行艾灸預(yù)處理5 d和10 d后，采用冠脈結(jié)扎法建立MIRI模型。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)以及Western blot方法檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2、HIF-1α及Caspase-3蛋白及基因表達(dá)。結(jié)果：與正常組比較，模型組HIF-1α和Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)均高于正常水平(P<0.01)，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)低于正常水平(P<0.01)。與模型組比較，艾灸預(yù)處理組HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)增高(P<0.01)，Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)下降(P<0.01 orP<0.05)。與5天組比較，艾灸預(yù)處理10天組HIF-1α mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白顯著增高(P<0.05)，Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.01)。結(jié)論：艾灸預(yù)處理可通過降低MIRI大鼠心肌細(xì)胞中HIF-1α、Caspase-3的含量，增加心肌細(xì)胞中Bcl-2的含量，改善心肌缺血缺氧狀態(tài)以及抑制心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)損傷心肌細(xì)胞起到預(yù)防保護(hù)作用。其中艾灸預(yù)處理10天對(duì)心肌細(xì)胞保護(hù)作用優(yōu)于5天。

艾灸預(yù)處理；心肌缺血再灌注損傷；低氧誘導(dǎo)因子-1α；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2；天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3

冠心病已成為全球范圍內(nèi)高致病率和高死亡率的疾病之一[1]。目前臨床上主要通過藥物、介入、外科手術(shù)等手段來(lái)改善冠狀動(dòng)脈血供、降低心肌耗氧量。然而各種血運(yùn)重建手段的運(yùn)用，在恢復(fù)心肌供血供氧同時(shí)可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷甚至壞死，稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[2-3]。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，針灸預(yù)處理對(duì)MIRI造成的缺血心肌具有良好的保護(hù)作用[4-6]。與針刺比較，艾灸更安全，且易被患者接受的。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察不同艾灸預(yù)處理時(shí)間對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白和基因表達(dá)的變化，探討艾灸預(yù)處理對(duì)MIRI心肌細(xì)胞的保護(hù)是否與這三者有關(guān)，同時(shí)明確不同艾灸預(yù)處理時(shí)間是否對(duì)心肌細(xì)胞作用結(jié)果存在差異。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(220±10)g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2011-0003。飼養(yǎng)溫度22～25℃，濕度40%～60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，正常組、模型組、艾灸預(yù)處理5天組、艾灸預(yù)處理10天組。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；生理鹽水(雙鶴藥業(yè))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)；Trizol(Invitrogen)。

ALC-V108動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；ECG-9620P三道自動(dòng)分析心電圖機(jī)(上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司)；艾條(南陽(yáng)漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司，豫衛(wèi)健用字[2004]第N0248號(hào)，規(guī)格：4 mm×120 mm×90支)；自制簡(jiǎn)易艾灸架；TS-92搖床(其林貝爾)；TGL-18R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(深圳黑馬)；164-5050電泳儀(Bio-rad)；PIKO REAL 96熒光定量RCP儀(Thermo)。

1.3 造模方法

模型組、艾灸預(yù)處理5天組及艾灸預(yù)處理10天組大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100g)全身麻醉，將其仰臥位固定于鼠板之上，術(shù)前大鼠胸前區(qū)去毛，碘伏消毒，開胸沿左側(cè)第四、五肋骨間剪開，輕輕剪破心包膜，提起左心耳，在冠狀動(dòng)脈左前降支1/3處穿0號(hào)線，置一硅膠管結(jié)扎，以心電圖ST段的改變及冠脈向外膨脹發(fā)紺為結(jié)扎成功標(biāo)志，結(jié)扎40 min后，剪開硅膠管恢復(fù)左前降支灌流60 min。

1.4 穴位定位和處理方法

穴位定位參考常用動(dòng)物穴位定位[7]，內(nèi)關(guān)穴位于前肢內(nèi)側(cè)離腕關(guān)節(jié)約3 mm左右的尺橈骨縫間。

正常組和模型組大鼠每天捆綁束縛20 min，連續(xù)5 d；艾灸預(yù)處理5天組大鼠每天捆綁固定于鼠板上，將艾條點(diǎn)燃后固定于自制灸架上，燃燒端分別對(duì)準(zhǔn)大鼠雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，距離約0.5 cm左右，內(nèi)關(guān)穴局部溫度控制在(42±1)℃(隨著艾條的燃燒及時(shí)彈去灰燼并調(diào)整距離)，每次20 min，1次/d，共5 d；艾灸預(yù)處理10天組同樣固定、取穴、施灸，每次20 min，1次/d，共10 d。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 Western blot檢測(cè)

檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2、HIF-1α及Caspase-3蛋白。剪取0.25 g心肌組織緩沖液洗凈后反復(fù)研磨，冰上蛋白裂解30 min，離心后取上清(即為組織蛋白)。按照BCA蛋白定量試劑盒(Wellbio)測(cè)定蛋白濃度。吸取蛋白組織與5×loading buffer混勻，沸水煮5 min制備電泳樣本，根據(jù)蛋白定量結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE穩(wěn)壓電泳(濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V)。待溴酚藍(lán)電泳至膠底部時(shí)終止電泳。將PVDF膜與濾紙依次排列置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中完全浸透，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(HIF-1α約2 h，Bcl-2約30 min， Caspase-3約40 min)。將膜取出漂洗后，按一定稀釋比例(HIF-1α∶1∶200；Bcl-2∶1∶500；Caspase-3∶1∶1000)與對(duì)應(yīng)抗體進(jìn)行一抗孵育，與HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶3000)進(jìn)行二抗孵育。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，顯影沖洗。

1.5.2 RT-PCR檢測(cè)

檢測(cè)心肌細(xì)胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3基因的相對(duì)表達(dá)。取心肌組織約0.02 g加入1 mL Trizol研磨勻漿，加三氯甲烷震蕩，離心加等體積的異丙醇靜置。低溫離心后棄上清保留白色沉淀，加乙醇震蕩。低溫離心棄上清加無(wú)菌無(wú)酶水溶解沉淀。吸取2μL RNA溶液運(yùn)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在260 nm與280 nm處吸光度值，計(jì)算其濃度跟純度。經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)(actin為內(nèi)參，引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1)，讀取Ct(cycle threshold)值，采用2-△△Ct值反映各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因的表達(dá)水平，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，得到均值。

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 艾灸預(yù)處理對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白影響

結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，艾灸預(yù)處理5天組與艾灸預(yù)處理10天組大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與艾灸預(yù)處理5天組比較，艾灸預(yù)處理10天組大鼠Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Caspase-3的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而心肌細(xì)胞中HIF-1α的蛋白表達(dá)未見明顯差異(P>0.05)。

2.2 艾灸預(yù)處理組對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞中HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3基因的相對(duì)表達(dá)

結(jié)果見表3。與正常組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2 mRNA含量明顯降低(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3 mRNA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，艾灸預(yù)處理5天組與艾灸預(yù)處理10天組大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2 mRNA含量顯著升高(P<0.01)，HIF-1α及Caspase-3 mRNA含量明顯降低(P<0.01 orP<0.05)；與艾灸預(yù)處理5天組比較，艾灸預(yù)處理10天組大鼠HIF-1α mRNA含量及Caspase-3 mRNA含量顯著降低(P<0.05)，而心肌細(xì)胞中Bcl-2 mRNA含量未見明顯差異(P>0.05)。

表2 各組心肌細(xì)胞HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

注：與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較，▲P<0.01;與艾灸預(yù)處理5天組比較,●P<0.05,●●P<0.01

表3 各組心肌細(xì)胞HIF-1α、Bcl-2及Caspase-3 mRNA含量比較

注：與正常組比較,*P<0.01;與模型組比較，▲P<0.01,P<0.05;與艾灸預(yù)處理5天組比較，●P<0.05,●●P<0.01

3 討論

HIF-1α是維持體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)節(jié)的核轉(zhuǎn)錄因子，心肌組織在缺血缺氧條件下可應(yīng)激性的引起HIF-1α表達(dá)大量增加，在缺血的心肌組織中高表達(dá)HIF-1α?xí)M(jìn)一步激活細(xì)胞膜上的酸敏感離子通道，從而進(jìn)一步破壞心肌細(xì)胞[8]。MIRI過程中最主要的分子生物變化表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的大量凋亡，Bcl-2家族蛋白就是一類在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的蛋白質(zhì)，其中Bcl-2為抗凋亡蛋白，其機(jī)制主要是通過抑制Caspase蛋白酶活性從而抑制細(xì)胞凋亡。一般情況下，當(dāng)細(xì)胞受到損傷或者細(xì)胞凋亡時(shí)，Bcl-2基因表達(dá)則顯著下降。Caspase-3是參與細(xì)胞凋亡啟動(dòng)與執(zhí)行的Caspase家族中最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9]，由Caspase-3介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是MIRI發(fā)生的重要機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)HIF-1α和Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)均高于正常水平，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)均低于正常水平，皆提示本實(shí)驗(yàn)所采用的造模方法能使大鼠造成MIRI模型，引起大鼠心肌缺血缺氧，造成實(shí)驗(yàn)大鼠心肌損傷，使大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

中醫(yī)學(xué)歷來(lái)注重對(duì)疾病的預(yù)防，早在《內(nèi)經(jīng)》中已提出“不治已病治未病”。針灸“治未病”古稱“逆針灸”，即無(wú)病而施用針灸，以疏通經(jīng)絡(luò)氣血，調(diào)節(jié)臟腑陰陽(yáng)，以增強(qiáng)人體抗病能力。近年來(lái)針灸界提出的“針灸預(yù)處理”，與“逆針灸”有著相似之處。李曉泓[10]發(fā)現(xiàn)針灸“治未病”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)應(yīng)激理論有一定的聯(lián)系，即機(jī)體通過采取一定物理或者化學(xué)預(yù)處理方法激發(fā)機(jī)體出現(xiàn)適度應(yīng)激從而達(dá)到激發(fā)機(jī)體抗病能力的目的，這一特點(diǎn)與針灸預(yù)處理理論不謀而合。臨床上MIRI產(chǎn)生機(jī)制尚未明確，對(duì)其防治手段包括缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IP)、缺血后處理、遠(yuǎn)程缺血預(yù)適應(yīng)、藥物治療等[11]，其中心肌缺血預(yù)適應(yīng)(IP)作為目前最有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，是指心肌在遭受反復(fù)短暫缺血后對(duì)缺血再灌注損傷的耐受力增強(qiáng)，能顯著縮小心肌梗死面積、減輕心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷[12]，對(duì)心肌細(xì)胞能起到明顯的保護(hù)作用。課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)[4-6],針灸預(yù)處理能取得與心肌缺血預(yù)適應(yīng)相似的效果。

艾灸預(yù)處理與針刺預(yù)處理重視既病防傳的特點(diǎn)比較，更加注重于未病先防[13]?，F(xiàn)代研究[14]證實(shí)艾灸存在藥物作用、溫?zé)嶙饔门c近紅外光輻射作用3大主要機(jī)制，其中溫?zé)嶙饔靡鸬呐R床效應(yīng)稱之為溫補(bǔ)效應(yīng)、溫通效應(yīng)[15]。溫?zé)嶙饔檬钱a(chǎn)生灸效的主要因素，其中決定灸效的關(guān)鍵是灸量，而構(gòu)成有效灸量的核心在于灸時(shí)。與用藥累積量同理，施灸時(shí)間越長(zhǎng)能釋放更多被機(jī)體吸收的能量和化學(xué)物質(zhì)[16]。中醫(yī)學(xué)中尚提及“心肌缺血再灌注損傷”這一病名，結(jié)合臨床表現(xiàn)將其歸于“胸痹”“心痛”范疇[17-18]。病性總屬本虛標(biāo)實(shí)，故辨證論治不外乎“補(bǔ)”“通”兩義。艾灸預(yù)處理治療MIRI取之艾灸溫補(bǔ)溫通作用中“補(bǔ)虛固本”“通脈散瘀”之義。內(nèi)關(guān)穴屬心包經(jīng)之絡(luò)穴，外邪侵心治之以心包絡(luò)，取“代君受邪”之義。又為八脈交會(huì)穴，通陰維脈，為治療心胸疾病之首選穴位[19-20]。課題組前期實(shí)驗(yàn)皆已經(jīng)證實(shí)[3-5],針灸預(yù)處理“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)心肌細(xì)胞存在有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，兩組艾灸預(yù)處理大鼠心肌細(xì)胞中HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)降低，提示艾灸預(yù)處理能降低HIF-1α濃度，改善心肌缺血、缺氧狀態(tài)。Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)增高，Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)均下調(diào)，提示艾灸預(yù)處理通過增加Bcl-2濃度，抑制Caspase-3蛋白酶活性，從而緩解MIRI引起的心肌細(xì)胞凋亡。與艾灸預(yù)處理5天組比較，艾灸預(yù)處理10天組HIF-1α mRNA表達(dá)顯著降低，提示10天組能更有效的緩解心肌缺血缺氧狀態(tài)。比較艾灸預(yù)處理5天組，Bcl-2蛋白顯著增高，Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，提示艾灸預(yù)處理10天組通過進(jìn)一步高表達(dá)Bcl-2更有效的阻斷Caspase-3凋亡蛋白酶的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，艾灸內(nèi)關(guān)能顯著改善心肌缺血缺氧狀態(tài)以及抑制心肌細(xì)胞凋亡。隨著對(duì)心肌缺血發(fā)病機(jī)制的不斷深入研究，艾灸對(duì)于防治心肌缺血有巨大的學(xué)術(shù)研究空間和臨床運(yùn)用價(jià)值。但不同艾灸預(yù)處理時(shí)間對(duì)心肌缺血療效中存在差異，與施灸時(shí)間和有效灸量有關(guān)，但其作用機(jī)制尚未明確，有待課題組進(jìn)一步研究。

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Effect of Different Length of Moxibustion Preconditioning on the Expression of HIF-1α, Bcl-2 and Caspase-3 in Myocardial Cells of MIRI Rats

WANG Chao1, LIU Wei-wei1, HUANG Jie2, LIU Mi1, TAN Cheng-fu1, CHANG Xiao-rong1, YAN Jie1

(1.AcupunctureandMassageCollegeofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;2.TheFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China)

Objective: To discuss the protective mechanism of moxibustion preconditioning for myocardial ischemia reperfusion injury(MIRI), by observing the expression changes of HIF-1α, Bcl-2, and Caspase-3 protein and mRNA in myocardial cells of MIRI rats by different length of moxibustion preconditioning. Methods: 40 rats were randomly divided into the normal group, the model group, the moxibustion preconditioning group A(preconditioning for 5 days), and moxibustion preconditioning group B(preconditioning for 10 days). Moxibustion preconditioning was applied on point of PC6 for 5 or 10 days respectively before MIRI model being established by coronary artery ligation. The expressions of HIF-1α, and Caspase-3 protein and mRNA in myocardial cells were detected with RT-PCR technique and Western blot method. Results: The protein and mRNA expressions of HIF-1α, and Caspase-3 in the model group was higher than the normal level(P<0.01); the protein and mRNA expressions of Bcl-2 in the model group was lower than the normal level (P<0.01). Compared to the model group, the expressions of HIF-1α and Caspase-3 in the moxibustion preconditioning groups decreased significantly(P<0.05,P<0.01), the expressions of Bcl-2 increased significantly(P<0.01), of which moxibustion preconditioning group B was superior to group A(P<0.05,P<0.01). Conclusion: Moxibustion preconditioning can decrease the expression of HIF-1α and Caspase-3 and increase the expression of Bcl-2 in myocardial cells to improve myocardial ischemia and inhibit myocardial apoptosis. The protective effect of moxibustion preconditioning for 10 days was better than that for 5 days.

Moxibustion preconditioning; Myocardial ischemia reperfusion injury; HIF-1α; Bcl-2; Caspase-3

2016-09-12

2017-02-20

2015年針灸推拿學(xué)湖南省“十二五”重點(diǎn)學(xué)科開放基金資助項(xiàng)目(06)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81574080)；湖南省中管局課題(201521)；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金項(xiàng)目(15k093)

王超(1974-)，女，碩士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：經(jīng)脈臟腑相關(guān)機(jī)制的研究。

*通訊作者：黃潔(1969-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師,研究方向：經(jīng)脈臟腑相關(guān)機(jī)制的研究。

R245;R285.5

A

1002-2392(2017)04-0070-04