張文娓，韓玉生，王超，范越，田明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

黃芪桂枝五物湯對(duì)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)組織Trx及Txnip表達(dá)的影響

張文娓，韓玉生，王超，范越*，田明

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：研究黃芪桂枝五物湯對(duì)STZ大鼠坐骨神經(jīng)Trx及Txnip表達(dá)的影響，初步探討黃芪桂枝五物湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)的機(jī)制。 方法：將鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠隨機(jī)分為模型組、給藥組，另取正常大鼠為對(duì)照組。8周后，采用Western blot法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定大鼠坐骨神經(jīng)中Trx 與Txnip表達(dá)。 結(jié)果：Western bolt法顯示模型組大鼠坐骨神經(jīng)Txnip表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，給藥組低于模型組(P<0.01)。實(shí)時(shí)定量PCR法顯示模型組大鼠坐骨神經(jīng)Txnip表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，給藥組低于模型組(P<0.01)但高于對(duì)照組。而大鼠坐骨神經(jīng)Trx表達(dá)中模型組明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，給藥組高于模型組(P<0.01)但低于對(duì)照組。結(jié)論：DPN大鼠坐骨神經(jīng)存在Txnip系統(tǒng)異常，黃芪桂枝五物湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變，其作用機(jī)制與抑制Txnip表達(dá)，提高Trx表達(dá)有關(guān)。

黃芪桂枝五物湯；糖尿病周圍神經(jīng)病變；Trx；Txnip

糖尿病周圍神經(jīng)病變(Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN)是糖尿病并發(fā)癥中最普遍的一種，其發(fā)病率高，甚者致殘，病機(jī)復(fù)雜，因素繁多[1-3]。目前發(fā)病機(jī)制還沒(méi)有明確，其中參與影響因素眾多。黃芪桂枝五物湯是臨床治療DPN常用基礎(chǔ)方之一[4-6]，療效確切，效果顯著，為進(jìn)一步探究其作用效果及作用機(jī)制，本文將做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP；合格證號(hào)：SCXK黑2008004)。

1.2 藥物及試劑

黃芪桂枝五物湯，含生藥量1 g/mL，(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；NC膜(美國(guó)密理博公司)；Ecl Western blot檢測(cè)試劑盒，瓊脂糖(電泳級(jí))(上海百賽生物技術(shù)有限公司)；綠如藍(lán)低毒核酸染料(中國(guó)天澤基因工程有限公司)；引物合成(中國(guó)上海捷瑞生物工程有限公司)；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa DL2,000 DNA Marker(中國(guó)大連寶生物工程有限公司)；兔抗Txnip多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔IgG-HRP二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；BlueRanger預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(美國(guó)生物農(nóng)藥公司)；SDS-PAGE 膠電泳所有試劑(美國(guó)Amresco公司)；其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

普通PCR儀(PTC-100，美國(guó)MJ)；熒光定量PCR儀(ABI-7500，美國(guó)AB)；凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-It，美國(guó)UVP)；酸度計(jì)(310P-02，美國(guó)Orion)；電子分析天平(AB204-N，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；-80℃低溫冰箱(MDF-382E，日本三洋)；紫外分光光度計(jì)(UV-1601PC，日本島津)；超純水儀(Milli-Q，美國(guó)密理博)；制冰機(jī)(Grant,XB70，美國(guó))；高速低溫離心機(jī)(Sigma,3-18K，德國(guó))；恒壓恒流電泳儀(DYY-6C,北京六一儀器廠)；ThermoForma725(美國(guó)Forma公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物造模與分組

選取8周健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量200～220 g，隨機(jī)分成空白組(20只)及模型組(60只)。模型組大鼠給予鏈脲佐菌素(STZ；用0.1 mol/mL檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液配制)按70 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射，經(jīng)過(guò)72 h測(cè)定模型組大鼠空腹血糖，若測(cè)得的血糖值≥16.7 mmol/L，即造模成功，可作為糖尿病模型大鼠?？瞻捉M大鼠按70 mg/kg劑量注射檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。將空白組和模型組大鼠分籠飼養(yǎng)10周，自由飲水、進(jìn)食。10周后檢測(cè)模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，并與10周前檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，若神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢、軸突萎縮、結(jié)周脫髓鞘者即為DPN模型，再將DPN模型大鼠隨機(jī)等分成3組，分別為黃芪桂枝五物湯組(HQG)、彌可保組(MKB)及模型組。HQG組按生藥5 g/(kg·d)劑量灌胃給藥；MKB組按175 μg/(kg·d)劑量灌胃給藥，空白組及模型組按5 g/(kg·d)劑量給予蒸餾水，連續(xù)給藥 8周，8周后取材檢測(cè)指標(biāo)。

2.2 Western blot法檢測(cè)Txnip蛋白表達(dá)

稱取100 mg坐骨神經(jīng)組織充分研磨，加入新鮮配制的蛋白裂解液(RIPA)1 000 μL，并將混合液置勻漿器中進(jìn)行勻漿，再于4℃下，12 000 r/min離心10 min，取上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)中步驟測(cè)定總蛋白含量。再稱取20 μg蛋白，與蛋白上樣緩沖液以5∶1混勻，沸水浴5 min，使蛋白變性，12 000 r/min離心5 min，取上清液，進(jìn)行SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白質(zhì)，再將蛋白質(zhì)從凝膠以300 mA轉(zhuǎn)移到NC膜，經(jīng)過(guò)60 min,再用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉處理。NC膜上轉(zhuǎn)印蛋白與一抗結(jié)合發(fā)生免疫反應(yīng)后，再加入二抗，在室溫下孵育1 h。加入酶標(biāo)抗體，5 min后觀察，可見(jiàn)清晰的蛋白條帶，至蛋白條帶顏色深度達(dá)到要求后，用去離子水洗滌終止反應(yīng)。采用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度面積掃描，計(jì)算目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶的灰度值，二者的比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Txnip mRNA及Trx mRNA的表達(dá)

稱取100 mg組織，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中步驟提取總RNA，并采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm處的光密度值計(jì)算RNA的濃度，測(cè)定260 nm及280 nm處的吸收值，計(jì)算RNA的純度。配好1.2%甲醛變性膠電泳緩沖液中預(yù)電泳15 min，取1 μL總RNA在電壓120 V下電泳20 min，檢測(cè)RNA的完整性。將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定，引物的序列為:

Txnip擴(kuò)增引物:上游5′-ATCATGGCGTGGCAAGAGTC-3′，下游5′-TTTCT TGGAGCCAGGGACAC-3′.Trx 上游引物為 5′-GTCTTTACCATACAAA AAGAT AC-3′，下游引物為5′-CCCTGTGTTAGGAGATAG-3′。β-actin擴(kuò)增引物:上游5′-GG TCGGAGTGAACGGATTTG-3′，下游5′-CCTTGACTGTGCCGTGGAAT-3′.Real-time PCR擴(kuò)增:c-DNA 2.0 μL，SYBR PremixEx Taq TM (2) 10 μL，PCR Forward Primer (10 μM)0. 4 μL，PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μL，ROX Reference DyeII(50) 0.4 μL，滅菌蒸餾水6.8 μL。經(jīng)過(guò)預(yù)變性95℃ 30 s; 95℃ 5 s，60℃ 34 s共40個(gè)循環(huán)，完成PCR擴(kuò)增程序。此過(guò)程中收集熒光信號(hào)，待反應(yīng)結(jié)束后，采用熒光定量分析儀對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。測(cè)定PCR擴(kuò)增時(shí)每份樣品的Ct值，利用內(nèi)參基因校正，計(jì)算樣品相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠坐骨神經(jīng)Txnip表達(dá)的變化

Western bolt法顯示模型組大鼠坐骨神經(jīng)Txnip表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，給藥組低于模型組(P<0.01)，其中HQG組較MKB組低，但無(wú)顯著性差別。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠坐骨神經(jīng)Txnip蛋白表達(dá)±s)

注：與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

實(shí)時(shí)定量PCR法顯示模型組大鼠坐骨神經(jīng)Txnip mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，給藥組低于模型組(P<0.01)但高于對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)Txnip基因表達(dá)±s)

注：與正常組比較,*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

3.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)Trx表達(dá)的變化

實(shí)時(shí)定量PCR法顯示模型組大鼠坐骨神經(jīng)Trx mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，給藥組高于模型組(P<0.01)但低于對(duì)照組，其中HQG組較MKB組低，但無(wú)顯著性差別。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)Trx基因表達(dá)±s)

注：與正常組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

4 討論

糖尿病是一種終身性、全身性的慢性非傳染性疾病，糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，臨床表現(xiàn)主要為便秘、腹脹、肢體麻木、神經(jīng)病理性疼痛、感覺(jué)異常等，其發(fā)病率高，致殘率也隨之增加，目前已成為全球不可忽視的疾病問(wèn)題[7-8]。對(duì)于DPN的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，現(xiàn)有研究表明其發(fā)病受細(xì)胞生長(zhǎng)因子，遺傳因素，糖代謝異常及自身免疫功能等多方面因素影響，其中抗氧化劑硫氧還蛋白(Trx)及其內(nèi)源性抑制劑硫氧還蛋白反應(yīng)蛋白(Txnip)是DPN發(fā)病機(jī)制的重要影響因素[9-10]。

硫氧還原蛋白(thioredoxin ,Trx)系統(tǒng)是機(jī)體一種對(duì)抗氧化應(yīng)激，維持氧化還原反應(yīng)的平衡系統(tǒng)，可抑制細(xì)胞凋亡。硫氧還蛋白相互作用蛋白(Txnip)是Trx 的生理抑制劑，能下調(diào)Trx表達(dá)。Txnip過(guò)表達(dá)，抑制Trx的活性，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。

黃芪桂枝五物湯組成為黃芪、桂枝、白芍、生姜、大棗，具有益氣通絡(luò)、和血通痹之功，是臨床治療DPN常用方劑[12]，具有較好療效，改善臨床癥狀。本實(shí)驗(yàn)黃芪桂枝五物湯可明顯降低糖尿病大鼠Txnip表達(dá)，提高Trx表達(dá)，進(jìn)一步闡明黃芪桂枝五物湯治療有效DPN的重要機(jī)制與硫氧還蛋白氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

[1] Laslie Rd． United Kingdorn Prospective． Diabeters study( UKPDS) ． WHAT now or so what? [J]．Diabetes Metab ResRev，2003，15:65．

[2] 陳伊，劉雙嶺，孔妍,等.神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測(cè)對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病中醫(yī)辨證的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2015,43(2):127-129.

[3] 李崖雪,閆建華,王豐,等.針刺六經(jīng)原穴(陰經(jīng)輸穴)治療糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的臨床療效觀察[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào),2015,43(5):24-26.

[4] 高岑，宋俊生，薛曉煥,等．黃芪桂枝五物湯與西藥治療糖尿病周圍神經(jīng)病變療效比較的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J]．遼寧中醫(yī)雜志，2012，39(6):993-994．

[5] 王紅,韓兆瑩,呂佳奇,等.黃芪桂枝五物湯臨床應(yīng)用研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2014,42(1):105-107.

[6] 李冀,孫新雨,畢珺輝.黃芪桂枝五物湯的臨證應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2014,42(5):108-111.

[7] 潘立民，孫素芹，葉婷.穴位貼敷治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的療效研究[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(3):96-99.

[8] 李芊綿，王超，范越.黃芪桂枝五物湯對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠NGF mRNA和VEGF mRNA 表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(5):42-44.

[9] 高海波，李裕.明硫氧還蛋白和硫氧還蛋白相互作用蛋白與糖尿病及其并發(fā)癥關(guān)系的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·老年醫(yī)學(xué)分冊(cè)，2008,29(6)：248-252.

[10] 栗明，劉春燕，丁常宏,等.烏芪通絡(luò)膠囊對(duì)STZ大鼠硫氧還蛋白/硫氧還蛋白反應(yīng)蛋白(Txnip)系統(tǒng)的影響[J].中醫(yī)藥信息，2013,30(4)：33-36.

[11] Yoshioka J, Schulze PC, Cupesi M, et al.Thioredoxin-interacting protein controls cardiac hypertrophy through regulation of thioredoxin activity[J].Circulation,2004,109(21):2581-6.

[12] 張敬一，史國(guó)兵，徐博,等.黃芪桂枝五物湯治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的Meta分析[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,31(8)：643-648.

Expressions of Txnip and Trx by Huangqi Guizhi Wuwu Decoction in DPN Rats

ZHANG Wen-wei, HAN Yu-sheng, WANG Chao, FAN Yue, TIAN Ming

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To study the influence of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on the expression of Trx and TXnip in the sciatic nerve from diabetic rats induced by STZ, and to discuss the preliminary mechanism of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on diabetic peripheral neuropathy (DPN). Methods: Diabetes rats induced by STZ were randomly divided into the model group and the medication group, and the normal rats were taken as the normal control group. The expressions of Txnip and Trx in the sciatic nerve were determined with Western blot and real-time PCR after eight weeks. Results: The expression of Txnip was significantly increased in the model group compared to that of the normal control group (P<0.01), and the medication group could obviously reduce the expression of Txnip compared to the model group by the two methods(P<0.01), but it was still higher than the normal control group. However, the expression of Trx was significantly lower in the model group compared to the normal control group (P<0.01), and it was increased by the medication compared to the model group (P<0.01), but was still lower than the normal control group. Conclusions: There was an abnormity of Txnip in the sciatic nerve of DPN rats, the treatment mechanism of Huangqi Guizhi Wuwu decoction for DPN may be related to the inhibition of Txnip and the enhancement of Trx.

Huangqi Guizhi Wuwu decoction; Diabetic peripheral neuropathy; Trx; Txnip

2016-05-06

2017-04-20

黑龍江省自然科學(xué)基金研究項(xiàng)目(H2015047)

張文娓(1982-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥新藥研發(fā)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

*通訊作者：范越(1961-)，女，編審，主要從事中醫(yī)藥文獻(xiàn)研究工作。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0057-03