劉璐，朱明雪，李奇瑋，蘭辛鍵，隋雨桐，梁華

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

方 劑 研 究

四君子湯干預(yù)小鼠腎組織增齡性改變的代謝組學(xué)研究

劉璐，朱明雪，李奇瑋，蘭辛鍵，隋雨桐，梁華*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：基于代謝組學(xué)方法研究四君子湯干預(yù)12月齡雄性小鼠腎組織增齡性變化的作用機制。方法：選取自然增齡小鼠,對小鼠腎組織勻漿提取液進行檢測，探討12月齡雄性小鼠腎臟組織增齡性變化的代謝標(biāo)志物及對應(yīng)的代謝通路以及四君子湯的干預(yù)作用。結(jié)果：鑒別出四君子湯對5個代謝標(biāo)志物(4,5-二氫乳清酸、花生四烯酸、泛酸、焦谷氨酸、二十二碳六烯酸)有明顯的回調(diào)作用，并對相應(yīng)5條代謝通路(嘧啶代謝、花生四烯酸代謝、不飽和脂肪酸生物合成、泛酸和輔酶A的生物合成、谷胱甘肽代謝)產(chǎn)生影響。結(jié)論：四君子湯可以通過介入脂類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝等多條代謝途徑干預(yù)12月齡雄性小鼠增齡性改變。

四君子湯；代謝組學(xué)；增齡

中醫(yī)學(xué)對于衰老有很多學(xué)說進行闡釋，其中對于“氣虛致衰”理論就有大量的文獻記載。如早在《論語》中就提出“及其老也，血氣既衰”；《素問·八正神明論》 中也提到 “血氣者，人之神，不可不謹(jǐn)養(yǎng)”等。脾胃乃人后天之本，是氣血生化之源。四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，是益氣健脾的代表方和基本方，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草四味藥組成，有“天下補氣第一名方”之美稱。該方益氣健脾，調(diào)理氣機，氣血得以充盈，榮養(yǎng)全身，從而能夠有效延緩衰老。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)四君子湯可以提升衰老模型小鼠體內(nèi)IgA、IgG、IL-2的水平，減少IL-18、5-HT、TGF-β含量，有效改善機體免疫功能[1-2]。

代謝組學(xué)對機體組織器官的動態(tài)研究與中醫(yī)學(xué)的整體觀、系統(tǒng)觀及辨證論治思維一致[3]。利用代謝組學(xué)探討方證分子水平的生物標(biāo)志物，可以為研究特定方證間的作用機制提供科學(xué)依據(jù)[4-6]。

本課題前期實驗通過研究12月齡雄性小鼠與3月齡血清中的代謝標(biāo)志物及四君子湯的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)四君子湯能夠改善增齡造成的氨基酸代謝紊亂[7]。本實驗利用代謝組學(xué)技術(shù)，對四君子湯干預(yù)作用下12月齡雄性小鼠腎組織與3月齡雄鼠比較的內(nèi)源性小分子代謝物質(zhì)的變化進行研究，解析自然生長小鼠增齡過程中生物標(biāo)志物、代謝通路的改變以及四君子湯的干預(yù)作用。掲示其增齡過程及四君子湯干預(yù)所致生理、病理改變的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

30只購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司的SPF級ICR雄性小鼠，其中3月齡10只為青年對照組；12月齡20只隨機分為兩組，每組10只，分別作為四君子湯組和空白對照組，許可證號：SCXK(遼)2010-0001。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(22±2)℃，濕度55%±15%，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.2 藥品與試劑

四君子湯(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂)；水溶性維生素E粉末(美國sigma公司生產(chǎn)，韓國biosharp公司分裝)；甲酸(北京迪馬科技?xì)W泰科技發(fā)展中心)；生理鹽水(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司)；色譜甲醇(美國賽默飛世爾公司)；色譜乙腈(美國賽默飛世爾公司)。

1.3 儀器

電子分析天平AL204(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；超低溫冰箱(德國賽默飛世爾科技有限公司)；KDC-160HR 高速冷凍離心機(中國科大創(chuàng)新股份有限中佳分公司)；微量移液器(上海新漢計量器具技術(shù)研究所)；液相：Waters Acquity UPLC(美國Waters公司)；質(zhì)譜：Waters LCT Premier XE TOF(美國Waters公司)；色譜柱：Acquity UPLCTMBEH C18柱(1.7 μm,2.1 mm×50 mm)(美國Waters公司)；工作站：MassLynxV4.1(美國Waters公司)。

1.4 藥液制備

四君子湯：人參9 g(單煎后與其他藥液混合)，白術(shù)9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，共33 g。加水適量，煎煮藥液100 mL，濃度0.33 g/mL。每周定期煎取藥液，4 ℃冰箱冷藏，使用前加溫至37℃。

1.5 給藥

四君子湯組：灌胃給藥量為13 mL/(kg·d)。

青年對照組、12月空白對照組：生理鹽水灌胃給藥量為13 mL/(kg·d)。

給藥時間是每日上午8:30-9:30，共給藥30 d。

1.6 樣品采集與制備

于給藥第30天時對所有小鼠進行禁食，不禁水。第31天時采用頸椎脫位法處死，摘取腎臟，并對其進行稱質(zhì)量，標(biāo)記后由液氮冷凍，統(tǒng)一轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存。

1.7 樣本預(yù)處理

甲醇有機溶劑沉淀蛋白法：于冰浴中將腎組織剪成碎片，加10倍體積甲醇，勻漿，離心(離心條件為12 000×g、4℃、15 min)，轉(zhuǎn)移所得上清液至另一離心管后于上述條件再次離心，取200 μL上清液，進行UPLC-TOF/MS分析。

1.8 樣品的檢測

1.8.1 超高液相色譜條件

ACQUITY UPLCTMBEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)色譜柱；流速0.4 mL/min；柱溫40℃；樣品倉溫4℃；流動相A：0.1%甲酸-乙腈溶液；流動相B：0.1%甲酸-超純水溶液；梯度洗脫程序：0～15 min,2%A～100%A。

1.8.2 質(zhì)譜條件

正/負(fù)離子模式：電噴霧離子源(ESI)；利用Lockspray校正系統(tǒng)(美國Waters公司)進行在線質(zhì)量校正，其中校正液為亮氨酸-腦啡肽(Leucine- Enkephalin)溶液，濃度為1 ng/mL，流速為20 μL/min；校正頻率為15 s；采用全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍為m/z：100～1 500。質(zhì)譜條件見表1。

1.8.3 數(shù)據(jù)的處理

本實驗采用Progenesis QI 2.1軟件對數(shù)據(jù)進行色譜峰識別和峰匹配，利用PCA主成分分析以及OPLS-DA正效偏最小二乘-判別對12月空白對照組與3月青年對照組之間的代謝物譜差異進行分析，進而由VIP變量重要性投影和EZinfo軟件篩選出生物標(biāo)記物等。

表1 質(zhì)譜條件

2 實驗結(jié)果

2.1 儀器穩(wěn)定性

本實驗每隔10個待測樣品，進一組質(zhì)量控制樣品(QC)，經(jīng)PCA主成分分析證明儀器穩(wěn)定性良好，實驗數(shù)據(jù)可靠。

2.2 3月青年對照組與12月空白對照組的整體評價

如圖1、2所示，將兩組的各個散點分別置于同一橢圓形中發(fā)現(xiàn)，其中左側(cè)的是3月青年對照組，右側(cè)的是12月空白對照組，正、負(fù)離子條件下，兩組小鼠明顯分離，證明12月空白對照組與3月青年對照組間有明顯差異。

圖1 3月青年對照組與12月空白對照組雄鼠腎組織正離子條件下經(jīng)OPLS-DA分析后的Scores圖

圖2 3月青年對照組與12月空白對照組雄鼠腎組織負(fù)離子條件下經(jīng)OPLS-DA分析后的Scores圖

2.3 四君子湯對正、負(fù)離子條件下12月雄性小鼠腎組織整體狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用

如圖3、4所示，將三組的各個數(shù)據(jù)分別置于同一橢圓中發(fā)現(xiàn)，其中左側(cè)的是四君子湯組，中間的是12月組，右側(cè)的是3月組，三組數(shù)據(jù)間離散程度很強，證明四君子湯在正/負(fù)離子條件下，對12月雄性小鼠腎組織有一定的調(diào)節(jié)作用。

圖3 四君子湯對12月雄鼠腎組織正離子條件下整體狀態(tài)經(jīng)PLS-DA分析后的Scores圖

圖4 四君子湯對12月雄鼠腎組織負(fù)離子條件下整體狀態(tài)經(jīng)PLS-DA分析后的Scores圖

圖5 12月雄鼠腎臟正離子條件下S-plot圖

2.4 代謝標(biāo)志物和代謝通路的篩選

通過上述方法，本實驗基于VIP值>2，P值<0.05進行代謝差異物篩選。并經(jīng)由QI軟件處理及HMDB數(shù)據(jù)庫檢索篩選得出代謝差異物。如S-plot圖見圖5、7；VIP圖見6、8。利用Metaboanalyst數(shù)據(jù)庫對所得代謝差異物進行標(biāo)志物篩選，共得出正離子條件下6個代謝標(biāo)志物，負(fù)離子條件下16個代謝標(biāo)志物，如表2所示。圖9、10分別為正/負(fù)離子條件下12月雄鼠腎組織代謝標(biāo)志物峰面積變化情況以及給藥組與12月空白組進行T檢驗的結(jié)果，由圖可見，四君子湯對C00219、C006429、C00337、C00864、C001879這5個代謝標(biāo)志物有明顯回調(diào)趨勢。其所對應(yīng)的5條代謝通路可由圖11所示，分別為花生四烯酸代謝；不飽和脂肪酸生物合成；嘧啶代謝；泛酸和輔酶A的生物合成；谷胱甘肽代謝。

圖6 12月雄鼠腎臟正離子條件下VIP圖

圖7 12月雄鼠腎臟負(fù)離子條件下S-plot圖

圖8 12月雄鼠腎臟負(fù)離子條件下VIP圖

HDMBIDKEGGID物質(zhì)名稱離子模式趨勢代謝途徑HMDB01043C00219Arachidonicacid正↓花生四烯酸代謝;不飽和脂肪酸生物合成HMDB00157C00262Hypoxanthine正↓嘌呤代謝HMDB00528C003374,5-Dihydrooroticacid正↓嘧啶代謝HMDB00210C00864Pantothenicacid正↓泛酸和輔酶A的生物合成HMDB10315C030334-Hydroxyandrostenedioneglucuronide正↓戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換;淀粉蔗糖代謝HMDB02183C06429Docosahexaenoicacid正↓不飽和脂肪酸生物合成HMDB01248C00016FAD負(fù)↓核黃素代謝HMDB00126C00093Glycerol3-phosphate負(fù)↓甘油磷脂代謝;甘油酯代謝HMDB01043C00219Arachidonicacid負(fù)↓花生四烯酸代謝;不飽和脂肪酸生物合成HMDB00251C00245Taurine負(fù)↓?；撬岷团；撬岽x;初級膽汁酸生物合成HMDB00157C00262Hypoxanthine負(fù)↓嘌呤代謝HMDB00210C00864Pantothenicacid負(fù)↑泛酸和輔酶A的生物合成HMDB00673C01595Linoleicacid負(fù)↓亞油酸代謝;不飽和脂肪酸生物合成HMDB00267C01879Pyroglutamicacid負(fù)↑谷胱甘肽代謝HMDB00253C01953Pregnenolone負(fù)↑類固醇激素的合成HMDB03598C02075Retinylester負(fù)↓視黃醇的代謝HMDB02577C03033Cholicacidglucuronide負(fù)↓戊糖、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換;淀粉蔗糖代謝HMDB01016C03492D-4'-Phosphopantothenate負(fù)↓泛酸和輔酶A的生物合成HMDB00363C0513817a-Hydroxypregnenolone負(fù)↑類固醇激素的合成HMDB00010C052992-Methoxyestrone負(fù)↑類固醇激素的合成HMDB02183C06429Docosahexaenoicacid負(fù)↓不飽和脂肪酸生物合成HMDB00653C18043Cholesterolsulfate負(fù)↓類固醇激素的合成

圖9 正離子條件下12月雄鼠腎組織代謝標(biāo)志物表達水平變化情況 注:與青年對照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與空白對照組相比,*P<0.05,**P<0.01

圖10 負(fù)離子條件下12月雄鼠腎組織代謝標(biāo)志物表達水平變化情況 注:與青年對照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與空白對照組相比,*P<0.05,**P<0.01

圖11 左圖為正離子條件下12月雄鼠腎組織代謝途徑散點圖;右圖為負(fù)離子條件下12月雄鼠腎組織代謝途徑散點圖

3 討論

3.1 不飽和脂肪酸生物合成

代謝標(biāo)志物花生四烯酸(C00219)、二十二碳六烯酸(C06429)參與了不飽和脂肪酸生物合成。不飽和脂肪酸是人體的一種必需脂肪酸[8]，能夠酯化膽固醇，刺激脂質(zhì)代謝，預(yù)防心血管疾病、提高免疫力，促進生長發(fā)育，延緩衰老[9]。

3.2 花生四烯酸代謝

代謝標(biāo)志物花生四烯酸(C00219)參與了花生四烯酸代謝途徑。花生四烯酸(ARA或AA)是一種人體必需的多不飽和脂肪酸，游離的AA可在酶的刺激下生成眾多的具有很強生物活性的二十碳衍生物，如前列腺素(PG)，前列環(huán)素(PGI2)和血栓烷素(TXA2)等[10]。AA及其代謝物能夠促進脂類代謝、調(diào)節(jié)免疫和造血功能、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)激、舒張血管、促進細(xì)胞分裂，抑制腫瘤[10-11]。

3.3 嘧啶代謝

代謝標(biāo)志物4,5-二氫乳清酸(C00337)參與了嘧啶代謝。嘧啶類堿基是構(gòu)成核苷酸的重要組分，衍生品有胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶[12]。

3.4 泛酸和輔酶A的生物合成

代謝標(biāo)志物泛酸(C00864)參與了泛酸和輔酶A的生物合成通路。泛酸又稱遍多酸，是一種水溶性B族維生素，是輔酶A(CoA)和?；d體蛋白(ACP)生物合成的前體物質(zhì)，CoA可以介入機體的糖、脂肪、蛋白質(zhì)和能量代謝，為生命活動提供絕大部分的能量。泛酸參與類固醇紫質(zhì)、褪黑激素和亞鐵血紅素的合成過程，還可提高機體免疫力[13]。

3.5 谷胱甘肽代謝

代謝標(biāo)志物焦谷氨酸(C01879)參與了谷胱甘肽代謝。谷胱甘肽一般指的是還原性谷胱甘肽(GSH)[14]。GSH由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成[15]，其在免疫細(xì)胞中的水平高低可調(diào)控免疫反應(yīng)，其中包括Th細(xì)胞功能以及抗體的生成[16]。體內(nèi)的自由基能夠通過與GSH中的巰基結(jié)合，快速排出體外，進而起到保護機體的作用[17]。

4 小結(jié)

綜上所述，12月齡相較于3月齡雄性小鼠腎組織間的代謝標(biāo)志物有明顯增齡性變化；四君子湯對其中呈下調(diào)趨勢的代謝標(biāo)志物C00219、C00337、C06429有上調(diào)作用，對呈上調(diào)趨勢的C00864、C01879有下調(diào)作用。它們分別參與了花生四烯酸代謝、嘧啶代謝、不飽和脂肪酸代謝、泛酸和輔酶A生物合成及谷胱甘肽代謝等代謝途徑。由結(jié)果可知四君子湯主要能夠改善機體增齡過程中發(fā)生的氨基酸、脂類代謝紊亂，并通過影響泛酸及輔酶A生物合成關(guān)鍵酶類及核苷酸代謝途徑從而調(diào)節(jié)能量及物質(zhì)代謝，能夠有效調(diào)節(jié)機體免疫和抗氧化的能力，保護細(xì)胞，維持細(xì)胞正常分解等。四君子湯為益氣健脾的代表方劑[18-19]，利用代謝組學(xué)技術(shù)研究四君子湯對自然增齡動物的干預(yù)作用，為多角度，全方位認(rèn)識四君子湯抗衰老機制及其對應(yīng)的方證相關(guān)的生物學(xué)基礎(chǔ)提供科學(xué)有效的理論依據(jù)。

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Intervention Effect of Sijunzi Decoction to Ageing Changes of Nephridial Tissue Based on Metabonomics

LIU Lu, ZHU Ming-xue, LI Qiwei, LAN Xin-jian,SUI Yu-tong, LIANG Hua

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To study the mechanism ageing changes of nephridial tissue in 12 months male mice by Sijunzi decoction intervention. Methods: Natural aging mice were selected in this research. The homogenate extract of nephridial tissues were tested by metabonomics. The endogenous metabolic markers and corresponding metabolic pathways were analyzed to discuss the intervention effects of Sijunzi decoction. Results:Sijunzi decoction had up-regulation effect for the five metabolic markers (4,5-Dihydroorotic acid; Arachidonic acid; Pantothenic acid; Pyroglutamic acid and Docosahexaenoic acid) to influence this five metabolic pathways(pyrimidine metabolism; AA metabolism; biosynthesis of unsaturated fatty acids; biosynthesis of pantothenic acid and CoA; glutathione metabolism). Conclusion: Sijunzi decoction may intervene the ageing changes in 12 months male mice, in terms of the metabolism of lipid, amino acid and nucleotide.

Sijunzi decoction; Metabonomics; Ageing

2017-03-22

2017-04-20

國家自然科學(xué)基金項目(81473563)

劉璐(1991-)，女，碩士研究生，專業(yè):方劑學(xué)。

*通訊作者：梁華(1962-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事衰老及營養(yǎng)代謝相關(guān)病癥的方劑配伍規(guī)律研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0048-05