胡貝 薛念余 牧啟田 張盛敏 牟丹 許幼峰

超聲聯(lián)合微泡對比劑在宮頸癌SiHa細(xì)胞低濃度順鉑化療中的增敏作用

胡貝 薛念余 牧啟田 張盛敏 牟丹 許幼峰

目的 研究超聲聯(lián)合微泡對比劑SonoVue增強(qiáng)宮頸癌SiHa細(xì)胞對低濃度化療藥物順鉑敏感性的作用。 方法 將SiHa細(xì)胞培養(yǎng)后分為空白對照組（Control）、超聲微泡空化組（MEUS）、低順鉑濃度組（順鉑IC25）、低順鉑濃度聯(lián)合空化組（順鉑IC25+MEUS）。選用機(jī)械指數(shù)（MI）0.5、頻率4MHz超聲波聯(lián)合對比劑SonoVue處理MEUS組及順鉑IC25+MEUS組的SiHa細(xì)胞。處理24h后，用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，并用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 Control組凋亡率為（0.855±0.427）%，MEUS組凋亡率為（1.019±0.309）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而順鉑IC25+MEUS組凋亡率為（8.453±0.265）%明顯高于順鉑IC25組凋亡率（4.340±0.271）%（P＜0.001）。結(jié)論 機(jī)械指數(shù)0.5、頻率4MHz時(shí)，超聲聯(lián)合對比劑SonoVue并不會引起細(xì)胞的凋亡；但加入順鉑后，超聲聯(lián)合微氣泡顯著增強(qiáng)了宮頸癌SiHa細(xì)胞對順鉑的敏感性，具有化療增敏作用。

微氣泡 順鉑 宮頸癌 化療

宮頸癌是女性三大常見惡性腫瘤之一，雖可手術(shù)根治，但僅局限于臨床ⅠA~ⅡA期的患者[1]。在發(fā)展中國家，許多患者在確診時(shí)就已達(dá)到ⅡB期或ⅡB期以上，大部分失去手術(shù)指征，預(yù)后往往不良[2]。輔助化療技術(shù)能有效提高ⅡB期以上以及復(fù)發(fā)型宮頸癌患者的遠(yuǎn)期生存率[3]，化療后使部分患者可手術(shù)切除。宮頸癌的一線化療藥物順鉑（DDP）是一種金屬鉑類絡(luò)合物，其毒副反應(yīng)制約著臨床治療用藥。因此在保證化療效果的前提下，降低順鉑劑量具有一定臨床意義。超聲微泡對比劑早先用作成像顯影，而后被發(fā)現(xiàn)微氣泡能在超聲波的作用下，振蕩、收縮、擴(kuò)大、破裂，產(chǎn)生“空化效應(yīng)”引起周圍組織細(xì)胞膜通透性一過性改變。筆者通過CCK-8、流式細(xì)胞檢測等實(shí)驗(yàn)方法研究超聲“空化效應(yīng)”在低濃度順鉑處理宮頸癌SiHa細(xì)胞時(shí)所發(fā)揮的增敏作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人子宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞（美國ATCC公司）；DMEM、FBS、0.25%Trypsin-EDTA（美國Gibco公司）；Penicillin-Streptomycin、PBS（美國GE公司）；Annexin V/PI apoptosis kit（杭州聯(lián)科公司）；Cell counting KIT-8（日本同仁公司）；SonoVue（荷蘭Bracco公司）；順鉑（中國齊魯公司）；超聲儀器（美國PHILIPS公司IUElite）；酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；含5%CO2、37℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.2 SiHa細(xì)胞培養(yǎng) SiHa細(xì)胞用含 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀況，每1~2d進(jìn)行1次換液，當(dāng)細(xì)胞覆蓋瓶底80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代或收集細(xì)胞。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取處于對數(shù)生長期的SiHa細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后輕柔吹打制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞終濃度濃度為1×105個(gè)/ml。接種于96孔板，每孔接種100μl細(xì)胞懸液，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別以不同的濃度順鉑處理，藥物濃度依次為0、2、4、8、12、16、20、30、40、50μg/ml。24h后每孔加入10μl CCK-8，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1.5h。用酶標(biāo)儀在450nm的波長下測定吸光度（OD）值。按下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率（%）＝1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。用GraphPad 5.0計(jì)算IC50值為后續(xù)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)提供藥物濃度參考。

1.4 流式細(xì)胞分析

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞處理方法 取對數(shù)生長期的Si－Ha細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化離心后輕柔吹打重懸，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×105個(gè)/ml，接種于6孔板，每孔接種3ml，于CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，貼壁后吸出原培養(yǎng)基并根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給予不同處理。處理方式分別為：空白對照（Control）組加入3ml完全培養(yǎng)基；超聲微泡空化（MEUS）組加入完全培養(yǎng)基3ml，且以每3ml培養(yǎng)基100μl的SonoVue超聲照射10min，機(jī)械指數(shù)0.5、頻率4MHz；順鉑IC25組加入順鉑濃度為7.95μg/ml的完全培養(yǎng)基3ml；順鉑IC25+MEUS組加入順鉑濃度為7.95μg/ml的完全培養(yǎng)基3ml，并以每3ml培養(yǎng)基100μl的SonoVue超聲照射10min，機(jī)械指數(shù)0.5、頻率4MHz。處理完后置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培育。

1.4.2 Annexin V-FITC/PI雙染色 按上述分組處理24h后，消化收集細(xì)胞，包括所有懸浮和貼壁細(xì)胞，PBS洗滌后離心后去上清液，加入500μl 1×binding buffer重懸后移入流式管中，每管加入10μlAnnexin V-FITC和 5μlPI染色，避光孵育5min。使用流式細(xì)胞儀檢測各組SiHa細(xì)胞凋亡情況。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，采用flowjo及GraphPad軟件分析統(tǒng)計(jì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示。不同順鉑濃度抑制率的比較采用t檢驗(yàn)，并采用概率法計(jì)算IC25。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度順鉑處理后SiHa細(xì)胞OD值及抑制率的比較 順鉑處理SiHa細(xì)胞24h后，OD值隨順鉑濃度增加而減小，細(xì)胞活性抑制率則逐步增加，與0μg/ml比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），詳見表1。采用GraphPad軟件算出其IC50值為15.05μg/ml，概率法計(jì)算得出IC25值為7.95μg/ml。

表1 不同濃度順鉑處理后S i H a細(xì)胞O D值及抑制率的比較

2.2 各組SiHa細(xì)胞凋亡情況 以橫坐標(biāo)為FITC染色、縱坐標(biāo)為PI染色時(shí)，Q1象限代表細(xì)胞碎片，Q2象限代表中晚期凋亡，Q3象限代表早期凋亡，Q4象限代表正常活細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)Q2+Q3凋亡細(xì)胞率。在沒有加入順鉑的情況下，“空化效應(yīng)”并不會引起細(xì)胞的凋亡，Control組凋亡率為（0.855±0.427）%，MEUS組凋亡率為（1.019±0.309）%，順鉑IC25組凋亡率為（4.340±0.271）%、順鉑 IC25+MEUS組凋亡率為（8.453±0.265）%，4組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Control組和MEUS組凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；加入順鉑處理24h后，順鉑IC25+MEUS組凋亡率明顯高于順鉑IC25組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；順鉑IC25+MEUS組、順鉑IC25組與Control組、MEUS組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2），可見“空化效應(yīng)”增加了順鉑引起的細(xì)胞凋亡；為對比觀察超聲聯(lián)合微泡的化療增敏效果，加測得到用順鉑IC50藥物濃度處理的細(xì)胞凋亡率為（12.450±1.501）%。

3 討論

超聲微泡對比劑最早用于血池顯影、提高成像對比度，臨床上已廣泛應(yīng)用并取得良好效果。隨著超聲醫(yī)學(xué)與生物工程學(xué)的發(fā)展，微泡對比劑開始在治療領(lǐng)域發(fā)揮其特殊作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MEUS產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”能打開細(xì)胞膜表面孔道，利于基因或大分子藥物進(jìn)入細(xì)胞核，從而提高藥物對細(xì)胞的作用，這一過程被稱作超聲“聲孔效應(yīng)”[4]。隨后的研究表明“聲孔效應(yīng)”是一種瞬態(tài)的、可逆的現(xiàn)象，并不會影響細(xì)胞的活力，因此可將超聲“聲孔效應(yīng)”作為一種有效的、非侵入的輔助治療模式[5]。本實(shí)驗(yàn)也再次證實(shí)，機(jī)械指數(shù)0.5、頻率4MHz超聲聯(lián)合微泡并不會引起細(xì)胞凋亡。有多項(xiàng)研究表明，MEUS產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”能增強(qiáng)殺腫瘤的效果[6]，優(yōu)化化療藥物在腫瘤組織中的聚集減少藥物不良反應(yīng)[7-9]，甚至能逆轉(zhuǎn)某些癌癥的耐藥性[10]。這種治療模式可以通過增強(qiáng)藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用來治療癌癥，例如加拿大多倫多大學(xué)的Woloschak等[6]曾將多西他賽與微泡同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)荷前列腺腫瘤的裸鼠體內(nèi)，注射后立即用超聲照射，24h后與多西他賽單藥組對比，發(fā)現(xiàn)前者的腫瘤壞死面積是后者的4倍。而且對比通過超聲擊破載藥微泡的方式給藥，本研究所使用治療模式可以不受微泡載藥量的限制，適用范圍更加廣闊。

鉑類藥物是目前治療子宮頸腫瘤的基礎(chǔ)化療藥物，臨床上宮頸癌應(yīng)用最廣的化療方式，就是以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案[2]。然而，由于順鉑具有腎毒性、耳毒性、神經(jīng)毒性等毒副反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用。宮頸癌SiHa細(xì)胞的耐藥機(jī)制尚不明確，可能與其細(xì)胞膜表面P-糖蛋白的過表達(dá)有關(guān)。P-糖蛋白是一種ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，普遍存在于癌細(xì)胞膜上，能阻礙細(xì)胞攝取藥物或?qū)|(zhì)內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外[11-12]。美國佛蒙特大學(xué)的Deng等[10]觀察到在經(jīng)MEUS處理的耐阿霉素MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，P-糖蛋白的表達(dá)降低，這使細(xì)胞攝取了更多的阿霉素，且外排減少。MEUS下調(diào)癌細(xì)胞表面P-糖蛋白的機(jī)制尚不明確，推測與超聲“空化效應(yīng)”產(chǎn)生的剪切力機(jī)械移除有關(guān)[13]。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞凋亡證實(shí)MEUS能增強(qiáng)SiHa細(xì)胞對順鉑化療的靈敏度。順鉑IC25組的細(xì)胞凋亡率為（4.340±0.271）%，這可能與低順鉑濃度時(shí)SiHa細(xì)胞的耐藥有關(guān)，順鉑 IC25+ MEUS組的細(xì)胞凋亡率為（8.453±0.265）%，其機(jī)制可能是由于MEUS增加了順鉑的殺傷作用，或者“空化效應(yīng)”下調(diào)了P-糖蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了SiHa細(xì)胞的耐藥性，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。順鉑IC25+MEUS組的細(xì)胞凋亡率接近于中高濃度藥物時(shí)順鉑 IC50處理的凋亡率為（12.450±1.501）%，可見在保證化療效果的前提下，可以通過MEUS減少化療藥物的使用劑量，從而降低藥物的毒副反應(yīng)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，MEUS聯(lián)合低濃度順鉑可顯著提升SiHa細(xì)胞化療療效，可達(dá)到較高濃度順鉑的化療效果，因此MEUS聯(lián)合低濃度順鉑有望在保證化療效果前提下，減少順鉑用量，從而減少藥物不良反應(yīng)，有望臨床推廣試驗(yàn)。本研究屬于體外細(xì)胞試驗(yàn)，還需動物、人體試驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Ultrasound combined with microbubble contrast agent SonoVue enhances sensitivity of human cervical cancer SiHa cells to cisplatin

HU Bei,XUE Nianyu,MU Qitian,et al.Medical School of Ningbo University,Ningbo 315000,China

Microbubble Cisplatin Cervical cancer Chemotherapy

2 0 1 7-0 5-2 4）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

d o i：1 0.1 2 0 5 6/j.i s s n.1 0 0 6-2 7 8 5.2 0 1 7.3 9.1 5.2 0 1 7-1 1 9 8

寧波市科技富民惠民項(xiàng)目（2 0 1 5 C 5 0 0 1 1）；寧波市醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2 0 1 3 A 1 0）

3 1 5 0 0 0 寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（胡貝、牟丹）；寧波市第一醫(yī)院超聲科（薛念余、張盛敏、許幼峰），血液科（牧啟田）

許幼峰，E-m a i l：2 3 7 1 3 3 4 4 1 3@q q.c o m

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of ultrasound combined with microbubble contrast agent SonoVue on chemosensitivity of human cervical cancer SiHa cells to cisplatin(DDP). Methods SiHa cells were divided into 4 groups:control group (C),microbubble enhanced ultrasound group (MEUS),low cisplatin concentration group (DDP),and low cisplatin concentration combined microbubble enhanced ultrasound group(MEUS+DDP).The SiHa cells were treated with SonoVue and ultrasound (MI 0.5,4M Hz)in MEUS and MEUS+DDP group.Cell proliferation rate was examined with CCK-8 assay,and the proportion of cell apoptosis was determined with flow cytometry after cells were treated for 24 h. Results There was no significant difference in apoptotic rate between MEUS and control groups(1.019±0.309%vs.0.855±0.427%,P＞0.05).The apoptotic rate of the DDP+MEUS group was significantly higher than that of DDP group(8.453±0.265%vs.0.455±0.427%, P＜0.001). Conclusion The ultrasound combined with microbubbles can significantly enhance the chemosensitivity of human cervical cancer SiHa cells to cisplatin.