趙占娟，耿文一，樊紫瑜，洪閣，劉天軍

(1.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071002；2.暨南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程研究所,天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點實驗室，天津 300192)

新型水溶性卟啉類光敏劑的體外抗菌作用

趙占娟1，耿文一2，樊紫瑜1，洪閣3，劉天軍3

(1.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071002；2.暨南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程研究所,天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點實驗室，天津 300192)

為了探討新型卟啉類光敏劑光動力體外滅菌的活性,體外培養(yǎng)了抗藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) 3種菌株,分別檢測3種細菌對5種卟啉化合物(PA1—PA5)的吸收量,菌落計數(shù)法檢測PA1—PA5對3種細菌的光反應(yīng)、暗反應(yīng)濃度曲線;激光共聚焦顯微鏡檢測細菌吞噬光敏劑的情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種卟啉類化合物均具有較緩慢的光漂白率和較強的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力.激光共聚焦顯微鏡的檢測結(jié)果也表明，3類菌株可以選擇性地吸收化合物PA1—PA5.相比于其他4種光敏劑,PA1表現(xiàn)出明顯的殺菌性能，當(dāng)PA1濃度增加為31.25 μmol/L時，光照PA1對3種細菌的滅活率達100%.PA1對3種細菌的光動力滅菌效果最好，未來具有良好的使用前景.

光動力抗菌化學(xué)療法；創(chuàng)傷感染；光敏劑；卟啉衍生物

抗生素的不合理應(yīng)用致使細菌產(chǎn)生了嚴(yán)重的多重耐藥性，影響了人類的健康.因此尋求可以替代抗生素進行抗感染治療的藥物、方法就變得比較急切.光動力抗菌化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)是一種氧化損傷反應(yīng)，治療后病菌不會產(chǎn)生耐藥性[1-3].PACT的治療關(guān)鍵是具有理想的光敏劑.卟啉化合物及其衍生物在生物體內(nèi)廣泛存在，具有良好的光譜特性和較高的單線態(tài)氧的產(chǎn)量，具有抗腫瘤的特性同時在抗病毒、抗細菌方面也展現(xiàn)出良好的前景[4-5].目前，醫(yī)藥科技方面的研究多是在卟啉的性能及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進一步設(shè)計、合成及應(yīng)用研究[6]，而光敏劑的氧化損傷機制又與其化學(xué)結(jié)構(gòu)緊密相連.本實驗室將卟啉與氨基極性基團連接合成出了5種新型光敏化合物，對此類光敏化合物的體外抗菌活性效果進行了評價，探討將其應(yīng)用于抗菌的可行性.

1 材料及方法

1.1 光敏劑

光敏劑PA1—PA5為本實驗室合成產(chǎn)物，深紅色粉末，用二甲基亞峰(DMSO)作為溶劑配制原液濃度為10-2mol/L，體外實驗再用無菌的LB液體培養(yǎng)基進行稀釋使用.

1.2 主要儀器與試劑

半導(dǎo)體激光器(7404,Intense,USA，650 nm光纖輸出); 多功能酶標(biāo)儀(Thermo3001美國)； 無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)(Thermo美國)；十二烷基硫酸鈉(SDS)(天津市江天化工技術(shù)有限公司);激光共聚焦顯微鏡(LSM710 德國).

1.3 實驗菌株

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌Escherichiacoli(E.coli)(ATCC 25922),抗藥性金黃色葡萄球菌Methicillin resistantStaphylococcusaureus(MRSA) (臨床分離菌株),銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa(ATCC 27853)均由解放軍307醫(yī)院惠贈.

1.4 方法實驗

1.4.1 光漂白實驗(bleaching)[7]

用DMSO作為溶劑，將化合物PA1—PA5配成濃度為2.0×10-5mol/L的稀溶液，取 200 μL放入96孔板內(nèi)，用酶標(biāo)儀檢測化合物的光吸收值(300～800 nm).將上述溶液用激光(650 nm)照射5 min，能量密度為6 J/cm2.然后再用酶標(biāo)儀檢測各化合物的光吸收值(300～800 nm).共測定6次，總照射時間為30 min.觀察光吸收值的變化情況.

1.4.2 化合物PA1—PA5的單線態(tài)氧測定方法[8]

1.4.2.1 2,5-二苯基-3,4-苯并呋喃(DPBF)溶液的制備

用1 mL DMSO溶解5.4 mg DPBF粉劑，配置成濃度為2×10-2mol/L的DPBF原液，再取2 μL DPBF原液和2 mL DMSO混勻得到2×10-5mol/L的DPBF溶液.

1.4.2.2 化合物的單線態(tài)氧測定

1)吸取100 μL DPBF(2×10-5mol/L)溶液放入96孔板內(nèi)并使用激光進行照射檢測光照對DPBF產(chǎn)生的消耗.

2)吸取100 μL藥物溶液(2×10-5mol/L)放入同上的96孔板內(nèi)進行激光照射檢測光照對藥物溶液的影響.

3)取濃度為2×10-5mol/L的光敏劑100 μL和濃度為2×10-5mol/L 的DPBF 100 μL混勻.用波長為650 nm的激光器對上述溶液進行照射，能量密度為6 J/cm2，光照后每隔10 s用酶標(biāo)儀檢測410 nm處的吸收光度值.檢測時間為120 s.

1.4.3 吸收速度的測定方法[9]

1.4.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%SDS作為溶劑配制化合物PA1—PA5溶液，濃度分別為 0.4、0.8、1.56、 3.13、 6.25、12.5、25、50 μmol/L;分別吸取100 μL上述溶液放入96孔培養(yǎng)板，每個濃度4個復(fù)孔;測每孔的熒光吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.3.2 測定3種細菌對PA1—PA5的吸收速度

取1 mL細菌進行離心(9 000g,1 min),倒掉上清液,然后用無菌PBS溶液稀釋(OD600=0.6～0.8).取8個離心管，每個離心管中先放入500 μL菌懸液，然后再加入500 μL濃度為25 μmol/L的PA1—PA5溶液并混勻.將這8個離心管分別暗孵育0、10、20、30、40、80、160、320 min，暗孵育完成后，將這8個離心管離心，傾去廢液，再用PBS清洗，保留菌團.在上述菌團中加入1 mL裂解液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的SDS溶液)裂解細菌.24 h后吸取100 μL裂解菌液放入96孔板中，酶標(biāo)儀檢測藥物熒光OD值(激發(fā)波長418 nm，發(fā)射波長658 nm)，然后再據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將測得的OD值轉(zhuǎn)化為藥物含量.

1.4.4 PA1—PA5對3種菌株的光動力滅菌作用[10]

用無菌PBS配制化合物PA1—PA5溶液，濃度為31.25、15.6、7.8、 3.9、 0 μmol/L.用無菌肉湯校正細菌濃度為109mL.取上述5個濃度的藥液各100 μL依次放入96孔板中，然后每孔再放入100 μL的菌液混勻，放入暗室中孵育30 min.依此步驟再制備1塊96孔板.用激光照射其中1塊96孔板10 min，能量密度為6 J/cm2.另一塊96孔板避光.檢測化合物的光毒性及暗毒性.光照后，從每個濃度的藥物細菌混合液中都吸取100 μL進行梯度稀釋，然后對每一個稀釋濃度都進行涂布，每個濃度2個平皿，然后倒置于36 ℃培養(yǎng)箱中，第2天再進行菌落計數(shù).以空白溶劑處理的細菌為對照.按以下公式計算細菌存活率.暗反應(yīng)組同光反應(yīng)組但不照光.

細菌存活率=給藥組菌落平均值/對照組菌落平均值×100%.

1.4.5 成纖維BALB/c 3T3細胞的毒性檢測

取處于對數(shù)生長期的BALB/c 3T3細胞于96孔培養(yǎng)板內(nèi)進行培養(yǎng)，每個孔放入2×104個細胞，后放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h后去掉培養(yǎng)基，并用PBS洗滌，其中給藥組分別加入不同濃度(50、 25、12.5、 6.25、 3.125、1.56 μmol/L)的PA1—PA5，共6個劑量組，每組設(shè)置5個平行孔.對照組加入等體積的空白培養(yǎng)基.然后放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中暗孵育24 h.24 h后，用能量密度為6 J/cm2的激光器(650 nm)進行照射，照射后繼續(xù)暗孵育24 h.然后在96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL的MTT溶液(0.5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置4 h，倒掉上清液，每孔再加入150 μL二甲基亞砜溶劑溶解甲簪顆粒，輕輕振蕩.以空白溶劑處理的細胞為對照組，用酶標(biāo)儀測定光密度值(OD)，計算細胞的存活率.

存活率=給藥組平均OD值/對照組OD值×100%.

1.4.6 激光共聚焦顯微鏡測定3種細菌對化合物PA1—PA5的吞噬[11]

常規(guī)培養(yǎng)3種細菌至對數(shù)生長期.取上述MRSA,E.coli,P.aeruginosa菌液，離心(9 000g,1 min)，倒掉上清液，用無菌PBS溶液清洗菌團，再重懸菌液至吸光度OD600=0.6～0.8.然后將菌懸液稀釋10倍使用.取濃度為25 μmol/L 的PA1溶液500 μL放入無菌試管中，再放入500 μL的稀釋MRSA菌液后混勻，然后放置于暗室孵育30 min.孵育完成將試管離心，棄上清液并用PBS重懸菌液，然后用移液槍吸取少許接種在共聚焦培養(yǎng)皿中，晾干.將共聚焦培養(yǎng)皿用激光共聚焦顯微鏡檢測并拍照，觀察化合物被3類細菌吞噬的情況.E.coli,P.aeruginosa細菌操作步驟同MRSA.其他4種化合物PA2—PA5的操作方法同上.

2 結(jié)果

2.1 5種卟啉類化合物光漂白動力學(xué)

評判光敏劑優(yōu)劣的一個重要指標(biāo)就是檢測其光漂白穩(wěn)定性.光敏劑的穩(wěn)定性可以保證PACT的治療效果.從圖1中可以看出，化合物PA1—PA5經(jīng)過30 min的照射，418 nm處的最大吸收都略有下降，其中PA1下降的最少，約1.9%；PA5下降的最多，約12.3%.化合物PA1具有一定的光穩(wěn)定性，為其作為光敏劑提供了依據(jù).

a.PA1; b.PA2; c.PA3; d.PA4; e.PA5; f.the absorption spectrum of compounds PA1—PA5.圖1 化合物PA1—PA5的光漂白曲線 Fig.1 Photobleaching curve of compound PA1—PA5

2.2 單線態(tài)氧產(chǎn)生量的測定

光敏劑被激發(fā)后與分子氧結(jié)合產(chǎn)生單線態(tài)氧的多少直接影響PACT的效果，因而單線態(tài)氧產(chǎn)率可以作為考察光敏劑抗菌特性的一個重要指標(biāo).同時單線態(tài)氧也是光敏劑對靶向目標(biāo)產(chǎn)生的主要氧化損傷產(chǎn)物，因此監(jiān)測光敏劑在體外環(huán)境產(chǎn)生的單線態(tài)氧產(chǎn)率可以預(yù)測PACT治療的效果.通過比較法測定5種卟啉類化合物PA1—PA5的單線態(tài)氧，結(jié)果如表1所示.從表 1中可以看到在體外環(huán)境中光照化合物PA1產(chǎn)生的單線態(tài)氧產(chǎn)率(0.69)高于其他4種光敏劑及四苯基卟啉(TPP)(0.64)[12]，可以滿足臨床光動力治療的需要.

表1 5種光敏化合物的單線態(tài)氧產(chǎn)率

2.3 3種細菌對5種化合物的吞噬速度

從圖2中看出，3類細菌對5種化合物的最大吸收峰都發(fā)生在前30 min內(nèi)，30 min以后吸收曲線趨于平穩(wěn).鑒于30 min 細菌的吸收能達到最大，故本次實驗選擇暗孵育的時間為30 min.

2.4 5種化合物光動力抗菌活性

圖3中a、c、e表示光照PA1—PA5對3種細菌的滅菌曲線(光反應(yīng))，b、d、f表示不用激光照射PA1—PA5對3種細菌的滅菌曲線(暗反應(yīng)).光照化合物PA1表現(xiàn)出明顯的殺菌效果，而光照化合物PA5幾乎沒有滅菌效果.當(dāng)PA1濃度增大到31.25 μmol/L時，此時光照PA1幾乎全部殺死3種細菌，同時暗毒性也較低.相比于其他4種化合物，PA1對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有很好的抗菌性能.

圖2 MRSA,Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa對PA1—PA5的吸收量Fig.2 Uptake amount of compounds PA1—PA5 by MRSA, E.coli and P.aeruginosa changes against incubation time

a、c、e.6 J/cm2；b、d、f. 0 J/cm2.圖3 化合物PA1—PA5的光毒性和暗毒性Fig.3 Photoinactivation of compounds of PA1—PA5

2.5 5種化合物的毒性檢測

選用BALB/c小鼠的3T3成纖維細胞來評價5種化合物的光毒性及暗毒性.從圖 4中可以看出，5種化合物對成纖維細胞產(chǎn)生的光毒性均高于暗毒性.而且PA1—PA5對成纖維細胞的光毒性隨著劑量的增加而增加，達到最大濃度(31.25 μmol/L)時，成纖維細胞的存活率分別為10.6%、10%、11%、0.4%和13%，而在此濃度作用下，MRSA、E.coli和P.aeruginosa3種細菌的存活率約為0，幾乎全部被滅活.

2.6 激光共聚焦檢測PA1—PA5在3種細菌中的吞噬情況

光敏劑能否被細菌吞噬并進入到細菌內(nèi)部對其PACT療效非常關(guān)鍵[13].將光敏劑PA1—PA5與3種細菌懸液混勻并暗孵育30 min，然后用激光共聚焦顯微鏡顯示化合物被3種菌株吞噬的情況.光敏化合物被細菌吞噬后進入細菌體內(nèi)再受到激發(fā)就會產(chǎn)生紅色熒光.圖5顯示化合物PA1發(fā)出的紅色熒光最強，表明PA1被3種菌吞噬的最多，PA2的紅色熒光也較強，說明被3種菌吞噬的也較多，而PA3、PA4、PA5中紅色熒光最弱,間接表明體內(nèi)僅有少量光敏劑進入.說明3種細菌對PA1—PA5的吸收具有選擇性.

a.6 J/cm2；b.0 J/cm2.圖4 化合物PA1—PA5的毒性Fig.4 Photoinactivation of compounds of PA1—PA5 for BALB/c 3T3 cell

a.E.coli; b.MRSA; c.P.aeruginosa.圖5 PA1—PA5被3種細菌的吞噬情況Fig.5 Confocal laser scanning microscopic images of (a)Escherichia coli (b) MRSA (c)Pseudomonas aeruginosa

3 討論

人類為了有效滅活耐藥菌株，需要抗生素的量越來越大，使得藥物的副作用大大增加，導(dǎo)致了正常菌群被抑制或殺滅,增加了由病原微生物導(dǎo)致的多種感染性疾病的發(fā)病率.光動力抗菌化學(xué)療法(PACT)是將激光技術(shù)、光化學(xué)技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)有機結(jié)合的新產(chǎn)物，使病原菌很難產(chǎn)生耐藥性[3].光敏劑具有光活性及強抗菌能力，可以選擇性地聚積在靶向組織內(nèi)，通過激光激發(fā)靶細胞，釋放光化產(chǎn)物殺死靶細胞，達到殺菌的目的[14].卟啉化合物是一類具有特殊生物功能的化合物，是構(gòu)成葉綠素、血紅蛋白等大分子的主要成分，參與生物體內(nèi)一系列的重要過程，在新陳代謝中起著重要的作用.

本實驗室在卟啉結(jié)構(gòu)周邊引入多氨基極性基團合成了一系列新型光敏劑PA1—PA5.實驗結(jié)果表明，光敏劑PA1有很強的單線態(tài)氧產(chǎn)生能力,且具有一定的光穩(wěn)定性.體外抑菌實驗顯示PA1對3種細菌具有明顯的殺菌效果，當(dāng)PA1濃度上升為31.25 μmol/L時，對3種細菌的滅活率達100%.而在此濃度范圍內(nèi)PA1對BALB/c成纖維細胞的損傷卻較小.激光共聚焦顯微鏡也顯示被3種細菌吞噬的光敏化合物PA1受到激發(fā)而產(chǎn)生較強的紅色熒光，提示PA1能夠進入細菌內(nèi)部.以上結(jié)果表明光敏劑PA1介導(dǎo)的PACT對MRSA、E.coli和P.aeruginosa3種細菌的抗菌作用較強，作為新型抗菌光敏劑的使用具有良好的前景.PACT殺傷細菌的機制目前還處在猜測之中,有研究認為光敏劑在特定波長光的激發(fā)下，產(chǎn)生多種活性氧簇,損傷病菌質(zhì)膜[15]或?qū)е虏【鶧NA損傷[16]，達到治療的目的.但新型光敏劑PA1的滅菌機制還需要進一步的研究來證實.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Invitrostudy on antimicrobial activity of new water-soluble porphyrin photosensitizers

ZHAO Zhanjuan1,GENG Wenyi2,FAN Ziyu1,HONG Ge3,LIU Tianjun3

(1.Medical College, Hebei University, Baoding 071002, China; 2.Medical College, Jinan University,Guangzhou 510632, China;3.Key Laboratory of Biomedical Mater of Tianjin,Institute of Biomedical Engineering, Chinese Academy of Medical Sciences,Tianjin 300192,China)

The aim of this study is to investigate the photodynamic antibacterial activity of new porphyrin-based photosensitizers, and provide the experimental basis for the application of photodynamic antibacterial in clinic.Three strains were culturedinvitroMRSA,Escherichiacoli, andPseudomonasaeruginosa, respectively,and the uptake of five compounds(PA1—PA5) by three bacteria was tested.The light reaction and dark reaction concentration curves of the PA1—PA5 against three bacteria were determined by colony counting method, and laser confocal microscopy was used to detect bacterial phagocytosis of photosensitizers.All of the five porphyrins had relatively slow photobleaching rate and strong singlet-state generation ability.The results of laser confocal microscopy also showed that the three types of bacteria were selective for the uptake of PA1—PA5.PA1 showed significant bactericidal properties compared to the other four photosensitizers.With irradiation PA1 on three bacteria,the inactivation rate was 100%,when the concentration was increased to 31.25 μmol/L.PA1 as a new type of antibacterial photosensitizer shows a broad prospect as it shows the best effect on photodynamic sterilization of three bacteria.

photodynamic antimicrobial chemotherapy; wound infection; photosensitizer;porphyrin derivative

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.04.010

2016-09-02

河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)項目(2015A2001)；中西部高校綜合實力提升工程專項經(jīng)費；天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點實驗室開放性課題

趙占娟(1974—)，女，河北博野人，河北大學(xué)副教授，博士，主要從事激光醫(yī)學(xué)研究. E-mail: zhaozhanjuanv@163.com

劉天軍(1965—)，男，河南輝縣人，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事分子設(shè)計方面的研究.E-mail：liutianjun@hotmail.com

O43；Q631；R641

A

1000-1565(2017)04-0393-07