李幽幽，龔雙燕，李小璟，毛汐語，鄧益超，朱 玲，2，徐志文，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物生物技術中心，四川 成都 611134；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611134）

一例豬黃疸檢出戊型肝炎病毒的案例報道

李幽幽1，龔雙燕1，李小璟1，毛汐語1，鄧益超1，朱 玲1，2，徐志文1，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物生物技術中心，四川 成都 611134；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611134）

戊型肝炎（Hepatitis E,HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）感染引起的一種人畜共患病。豬戊型肝炎可分為臨床型和亞臨床型及健康型。臨床型即病豬有典型的特征性黃疸表現(xiàn)。病豬發(fā)病急，體溫比正常豬的體溫高0.5～1℃，咳嗽、鼻塞、呼吸困難、精神沉郁、食欲下降，嚴重的食欲廢絕，有的出現(xiàn)嘔吐、腹痛、腹脹、腹瀉，尿液呈淺黃色。少數(shù)豬可視黏膜有黃染，如眼結膜、鞏膜、口腔黏膜均黃染。懷孕母豬還會出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎。亞臨床型即患豬無臨床癥狀，但有肝炎的病理變化。

2017年4 月上旬，四川綿陽某規(guī)?；i場發(fā)生一起以2～3月齡保育豬呼吸困難、體溫升高、黃疸等為主要特征的傳染病。該病的發(fā)生給養(yǎng)豬場造成了嚴重的經(jīng)濟損失。經(jīng)流行病學調查、剖檢病變觀察及實驗室檢查確診為豬戊型肝炎病毒感染，現(xiàn)將診斷結果報告如下。

1 試驗材料

1.1 試驗試劑

DL 2 000 DNA Marker，SYBR Green Premix Ex TaqⅡ，2×Taq PLR Master Mix均購自天根生化科技（北京）有限公司。DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）、pMD19-T Simple Vecfor、質粒抽提試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。異丙醇（Isopropylalcohol）、三氯甲烷（Trichloromethane）均由四川西隴化工有限公司生產(chǎn)。TSA培養(yǎng)基由實驗室配置保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞由本實驗室保存。

1.2 試驗器材

手術刀，止血鉗，手術剪，超凈工作臺，離心機，培養(yǎng)箱等。

2 試驗方法

2.1 流行病學調查

根據(jù)現(xiàn)場調查和詢問管理員，獲得豬場相關信息，例如：存欄量、免疫程序、發(fā)病初期癥狀以及死亡率等情況，初步掌握豬場的流行病學情況。

2.2 剖檢病變

對送檢的3頭2～3月齡的病豬進行剖檢，觀察各器官組織的病理變化。

2.3 實驗室檢查

2.3.1 細菌學診斷 無菌取病死豬心臟、肝臟及肺臟病料在TSA瓊脂平板上劃線，于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～72 h，觀察細菌生長情況。

2.3.2 豬戊型肝炎病毒RT-nPCR檢測 取3頭病豬的糞便用PBS稀釋成10%的糞便懸液，12 000 r/ min離心10 min，取上清液采用Trizol法提取病料總RNA樣本。

引物由上海生工公司合成，預計擴增150bp（表1）。

表1 HEV的巢式PCR引物

cDNA的合成用Trizol法提取樣品中總RNA，按照Prime ScriptTn'RTreagent kit反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。反應體系為 10 μL：5×Prime ScriptTM RT Buffer 2.0 μL，Prime ScriptTn'RT Enzyme MixⅠ0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，外引物E2 0.5 μL，Total RNA 3.0 μL，RNase Free dH2O 3.5 μL；反應程序：42℃，30 min；85℃，5 min。將反轉錄產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第一輪PCR擴增：以cDNA為模板，使用檢測引物進行PCR擴增。反應體系10 μL：模板cDNA 1.0 μL；2×Master Mix 5.0 μL，外引物上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應條件：95.0℃預變性4min；95.0℃變性30 s；53.0℃退火30 s，72.0℃延伸30 s；35個循環(huán)；72.0℃延伸10 min。

第二輪PCR擴增：以一輪PCR產(chǎn)物為模板，使用檢測引物進行PCR擴增。反應體系：模板cDNA 1.0 μL；2×Master Mix 5.0 μL，內(nèi)引物上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應條件：95.0℃預變性4 min；95.0℃變性30 s；53.0℃退火30 s，72.0℃延伸30 s；35個循環(huán)；72.0℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

3 試驗結果

流行病學調查了解該豬場保育豬存欄量為1 000頭。其免疫程序嚴格按照春、秋兩防給豬群免疫接種了豬瘟、偽狂犬病等疫苗，在疫病流行期間，發(fā)病豬表現(xiàn)為體溫先升高后正常，并伴隨呼吸道病癥狀，眼結膜、鞏膜、口腔黏膜、皮膚等均黃染，死亡豬100頭，死亡率達10%（100/1 000）。

剖檢結果顯示，胃底腺體區(qū)觀察到彌漫性出血點；喉頭、腎、盲腸黏膜、回盲瓣區(qū)域均有針尖大的出血點，并伴有腸脹氣現(xiàn)象；脾臟邊緣呈鋸齒狀；皮膚、皮下脂肪均呈較嚴重的黃染現(xiàn)象；肝臟無明顯病理變化。

無菌取病死豬心臟、肝臟及肺臟病料在TSA瓊脂平板上劃線，于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～72 h，結果并未分離出致病菌。

利用RT-nPCR方法檢測病豬的糞便中是否有戊型肝炎病毒，經(jīng)凝膠電泳顯示出150 bp左右大小的條帶，與預期結果相符，見圖1。將PCR產(chǎn)物送往公司測序結果為HEV，說明該豬場存在豬戊型肝炎病毒感染的情況。

圖1 PCR檢測結果電泳

4 分析及討論

戊型肝炎病毒是一種人畜共患病，并在發(fā)達國家和發(fā)展中國家流行，然而，該病的流行主要發(fā)生在亞洲、非洲及墨西哥等發(fā)展中國家。近年來，該病在我國的發(fā)病率也有所提高。

本試驗對發(fā)病豬場進行了流行病學調查、病理剖檢后，對發(fā)病豬有嚴重黃疸情況尤其關注，推測發(fā)病豬可能有肝部疾病，結合臨床癥狀和病理變化，對發(fā)病豬進行了病毒的核酸鑒定，檢測病豬是否攜帶有HEV。結果顯示，HEV為陽性，但是值得關注的是，HEV造成的病變并不能導致10%如此高的死亡率，所以筆者推測可能是與其他病毒病混合感染才造成了病豬的死亡。令人感興趣的是，該豬場的工作人員是否也有可能已經(jīng)感染了HEV，由于條件所限未能驗證，值得后續(xù)關注。

（編輯：柳青）

鍛煉可緩解慢性疲勞綜合征

【英國《每日電訊報》網(wǎng)站6月22日報道】一項新的研究顯示，每天加強鍛煉可能有助于慢性疲勞綜合征患者減少疲勞感和改善精神狀態(tài)。

倫敦大學瑪麗皇后學院的科學家召集200人參加了一項為期12周的計劃：他們要么在一名理療醫(yī)師的鼓勵下每天少許延長散步的時間；要么接受一項包括用藥物治療抑郁癥、疼痛和失眠的醫(yī)療計劃。

3個月后，以百分制計，鍛煉小組的疲勞值平均評分比對照組低了4分。研究人員稱這是一種適度但具有意義的影響。鍛煉小組的身體功能評分也比對照組高出6分。鍛煉小組中有1/5的人還自訴感覺“好多了”或“好太多了”。

論文第一作者露西·克拉克說：“我們發(fā)現(xiàn)，在治療師指導下以自助方式進行的分級鍛煉計劃是安全的，并對某些慢性疲勞綜合征患者降低疲勞有幫助。這表明它也許可以作為一種有益的幫助患者控制慢性疲勞綜合征癥狀的初始治療。我們現(xiàn)在將觀察這些效果在12周之后是否能得到維持。我們的目的是小心翼翼地逐步取得改善，而不是過度催促實驗對象加大強度直至遭遇挫折?！?/p>

大約0.7%的人患有慢性疲勞綜合征，這種疾病的特征是在缺乏其他診斷情況下表現(xiàn)出的長期的極度疲勞。

這項自助鍛煉計劃的內(nèi)容是患者在形成每天運動的習慣后，慢慢增加身體活動的強度，并由一名理療醫(yī)師通過電話或通信軟件對其進行全程支持。這項研究發(fā)表在英國《柳葉刀》周刊上。

（轉自參考消息[N]，2017-06-25）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)04-0097-02

2017-06-26

四川省科技支撐計劃（2014NZ0043）；國家“十二五”科技支撐計劃（2015BAD12B04-2.3）

李幽幽（1992-），女，四川江油人，在讀碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學方向的研究.

E-mail:sclyy@hotmail.com

朱 玲，教授，博士.E-mail:abtcxzl72@126.com