張欽

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州450046）

UPLC-MS/MS分析運(yùn)動(dòng)飲料中水溶性維生素

張欽

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州450046）

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析運(yùn)動(dòng)飲料中 VB1、VB2、VB5、VB6、VB7、VB9、VB12、煙酸、煙酰胺、VC10 種水溶性維生素的方法。樣品前處理⒚10％乙醇沉淀提取后，采⒚Waters Atalantis T3色譜柱（2.1mm×150mm，3μm）分離，以0.1％甲酸-10.0％甲醇為流動(dòng)相的梯度洗脫模式下，10種水溶性維生素在10.0ng/mL～1 000.0ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為 0.999 3～0.999 9，檢出限范圍為 0.10 μg/kg～11.5 μg/kg，定量限范圍為 0.35μg/kg～38.0 μg/kg，加標(biāo)回收率為90.3％～99.5％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0％～3.6％。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；運(yùn)動(dòng)飲料；水溶性維生素

運(yùn)動(dòng)飲料是根據(jù)人體運(yùn)動(dòng)的生理消耗而配置的，通過(guò)合理補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)代謝物質(zhì)使運(yùn)動(dòng)員抗疲勞能力提高，優(yōu)化肌肉和肝糖原儲(chǔ)備來(lái)提高運(yùn)動(dòng)能力[1-2]。運(yùn)動(dòng)飲料中主要含有碳水化合物，電解質(zhì)，維生素，氨基酸等成分，能補(bǔ)充人體所需的營(yíng)養(yǎng)成分，平衡新陳代謝。其中維生素是維持人體正常的物質(zhì)代謝和某些特殊生理功能不可缺少的一類低分子有機(jī)化合物，在人體生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作⒚[3-5]。在我國(guó)標(biāo)準(zhǔn) GB 15266-2009《運(yùn)動(dòng)飲料》中[6]，僅針對(duì) VC、硫胺素、核黃素這3種維生素作出了限量要求，其他維生素未作出限量要求，但是針對(duì)特殊人群的飲料，有必要了解其中的維生素的種類以及含量，以便保障人們科學(xué)、定量地?cái)z入維生素。因此，急需建立一種方便可行、可同時(shí)檢測(cè)多種維生素的檢測(cè)方法以滿足實(shí)際工作需求。

目前對(duì)水溶性維生素的測(cè)定方法有微生物法、分光光度法以及高效液相色譜法等[6-15]，這些方法中一次只能對(duì)幾種維生素進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，耗材消耗多。本研究利⒚質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的選擇性和特異性，結(jié)合運(yùn)動(dòng)飲品的基質(zhì)成分相對(duì)簡(jiǎn)單，可簡(jiǎn)化提取過(guò)程的特點(diǎn)，建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法可同時(shí)對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料中10種水溶性維生素進(jìn)行測(cè)定，靈敏度高，線性范圍寬，極大地提高了檢測(cè)效率，在實(shí)驗(yàn)室的推廣可行性較高，可為運(yùn)動(dòng)飲品中多種維生素營(yíng)養(yǎng)同時(shí)定量提供技術(shù)支持和參考。

1 材料㈦方法

1.1 儀器㈦試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；API4000四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)AB公司。

標(biāo)準(zhǔn)品VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB6（吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC：美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）：美國(guó)Fisher Scientific公司。

1.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：WatersAtalantisT（32.1mm×150mm，3μm）；

流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30℃；

流動(dòng)相A為0.1％甲酸水溶液，B為10.0％甲醇；流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采⒚針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，先對(duì)各個(gè)目標(biāo)物進(jìn)行母離子全掃描，然后對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，分別選定定性離子和定量離子，并對(duì)噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時(shí)間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1）VB1標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取 100.0mg 的 VB1標(biāo)準(zhǔn)品，加入5.0mL水使其完全溶解后⒚甲酸調(diào)節(jié)pH值至2.0后定容至10.0mL避光保存。

2）VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液： 稱取 100.0mg的 VB2標(biāo)準(zhǔn)品，加入4.0mL水和1.0mL氨水使其完全溶解后定容至10.0mL避光保存。

3）VB5、VB6、VB12、煙酸、煙酰胺、VC標(biāo)準(zhǔn)溶液：各稱取100.0mg的標(biāo)準(zhǔn)品，加入水使其完全溶解后定容至10.0mL避光保存。

4）VB7、VB9標(biāo)準(zhǔn)溶液： 各稱取100.0mg的標(biāo)準(zhǔn)品，加入4.0mL水和1.0mL氨水使其完全溶解后⒚甲酸調(diào)節(jié)pH值至7.0后定容至10.0mL避光保存。

準(zhǔn)確吸取上述10種維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再稀釋成濃度為 10.0、20.0、40.0、100.0ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)⒚。

1.3.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

運(yùn)動(dòng)飲料若直接上樣測(cè)定水溶性維生素，樣品中的干擾成分太多會(huì)影響測(cè)定，故要對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料中的一些干擾基質(zhì)進(jìn)行沉淀凈化。本試驗(yàn)結(jié)合10種水溶性維生素都是水溶性物質(zhì)的特性以及樣品為運(yùn)動(dòng)飲料的特性，比較了亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）+乙酸鋅溶液（219g/L）混合液、10％甲醇、10％乙醇、10％乙腈等4種提取溶劑對(duì)10種目標(biāo)物的提取效果。

1.3.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)及樣品測(cè)定

以已知目標(biāo)成分含量的運(yùn)動(dòng)飲料為基質(zhì)，加入10種水溶性維生素的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件和儀器條件，上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果㈦討論

2.1 色譜柱的選擇

食品中水溶性維生素的檢測(cè)比較常⒚的色譜柱有C18柱和T3柱[16-18]。因此，本試驗(yàn)比較了Waters BEH C1（82.1mm×150mm，3μm）和WatersAtalantisT（32.1mm×150mm，3μm）這2款不同的色譜柱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水溶性維生素大多以離子形態(tài)存在于溶液中，在C18柱上的保留能力較弱，目標(biāo)物的總離子流圖的分析效果不理想（如圖1所示）；但是在T3柱分析柱上由于其特殊鍵合力，能㈦水溶性維生素形成氫鍵的結(jié)合力強(qiáng)弱不同，在分離時(shí)更具有優(yōu)勢(shì)，目標(biāo)物的分離效果更好，所以本試驗(yàn)選擇T3柱作為10種水溶性維生素的分析色譜柱（如圖2所示）。

2.2 流動(dòng)相體系的影響

在選擇T3柱作為10種水溶性維生素的分析色譜柱的前提下，參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-23]，本試驗(yàn)對(duì)甲醇-水、甲醇-0.1％甲酸以及10％甲醇-0.1％甲酸3種流動(dòng)相進(jìn)行比較，分別對(duì)10種水溶性維生素的分析影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10％甲醇-0.1％甲酸作為流動(dòng)相，10種水溶性維生素的分離效果最好，目標(biāo)峰的分離度高，峰形尖銳，基線溫定。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采⒚針泵連續(xù)進(jìn)樣的方式，在正離子模式（ESI+）下，分別對(duì)濃度為100ng/mL的VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB（6吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其分子離子，優(yōu)化各母離子的錐孔電壓。再在上述母離子的基礎(chǔ)上，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選擇兩組豐度最高的離子，較高的作為定量離子，次之的為定性離子，并對(duì)噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描停滯時(shí)間、去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為：噴霧電壓4 000 V、離子源溫度400℃、氮?dú)饬髁?0 L/min、掃描停滯時(shí)間50 ms，其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

依照表2所設(shè)定質(zhì)譜的條件，以及超高效液相色譜的條件，選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple reaction monitoring model，MRM）進(jìn)行檢測(cè)，10種水溶性維生素能在10min內(nèi)快速分離，10種目標(biāo)物的MRM圖如圖3所示。

圖1 使⒚C18色譜柱10種維生素總離子流圖Fig.1 The total ion chromatograms of 10 kinds of water-soluble vitamins using the C18column

圖2 使⒚HSS T3色譜柱10種維生素總離子流圖Fig.2 The total ion chromatograms of 10 kinds of water-soluble vitamins using a HSS T3column

表2 10種水溶性維生素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table2 Mass spectrometric parameters for 10 kinds of watersoluble vitamins

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證10種水溶性維生素在優(yōu)化好的儀器條件中的線性關(guān)系，配制了濃度為 10.0、20.0、40.0、100.0、1 000.0ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，10種水溶性維生素在10.0ng/mL～1 000.0ng/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999），并得到10種目標(biāo)組分的檢出限范圍為0.10 μg/kg～11.5 μg/kg，定量限范圍為 0.35 μg/kg～38.0 μg/kg，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 提取溶劑的選擇

在對(duì)VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB6（吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC等10種目標(biāo)物提取的過(guò)程中，目標(biāo)成分易被破壞以及樣品中沉淀所吸附，所以在前處理過(guò)程中既要考慮要保護(hù)好目標(biāo)成分也要避免目標(biāo)物被沉淀所吸附。本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[24-28]，結(jié)合10種水溶性維生素都是水溶性物質(zhì)的特性以及樣品為運(yùn)動(dòng)飲料的特性，比較了亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）+乙酸鋅溶液（219g/L）混合液、10％甲醇、10％乙醇、10％乙腈等4種提取溶劑對(duì)10種目標(biāo)物的提取效果，見(jiàn)圖4。

續(xù)表2 10種水溶性維生素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Continue table 2 Mass spectrometric parameters for 10 kinds of water-soluble vitamins

圖3 10種水溶性維生素的MRM圖Fig.3 MRM chromatogram of 10 kinds of water-soluble vitamins

表3 10種水溶性維生素的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限㈦定量限Table3 Retention time， standard curve， correlation coefficient， detection limit and quantitative limit of 10 kinds of water-soluble vitamins

圖4 提取液對(duì)10種水溶性維生素平均回收率的影響Fig.4 The effect of extract solution on the average recovery rate for 10 kinds of water-soluble vitamins

結(jié)果如圖4所示，4種提取溶劑中，10％乙腈為提取溶劑時(shí)，運(yùn)動(dòng)飲料中的維生素回收率最高，其次為10％乙醇、10％甲醇；亞鐵氰化鉀溶液（106g/L）+乙酸鋅溶液（219g/L）混合液為提取溶劑時(shí)，樣品中的基質(zhì)沉淀效果明顯，但是維生素的回收率不高，可能是混合液對(duì)運(yùn)動(dòng)飲料中的水溶性的維生素有破壞作⒚；其中10％乙醇提取率雖不及10％乙腈的提取效果好，但是考慮到乙腈的毒性比乙醇大，以及成本問(wèn)題，所以本試驗(yàn)還是選擇10％乙醇作為運(yùn)動(dòng)飲料的提取溶劑。

2.6 加標(biāo)回收㈦相對(duì)偏差

在前處理?xiàng)l件㈦儀器條件下，利⒚已測(cè)定10種維生素含量的運(yùn)動(dòng)飲料進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，在分別添加0.05、0.1、1.0mg/kg 3個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個(gè)濃度平行測(cè)定5次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方法的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table4 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表4可見(jiàn)，10種水溶性維生素的加標(biāo)回收率為90.3％～99.5％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.0％～3.6％，表明本試驗(yàn)所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論

建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB（6吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC10種水溶性維生素分析的方法。結(jié)果表明，通過(guò)優(yōu)化后的質(zhì)譜條件，在MRM掃描模式下，10種水溶性維生素組分能在10min實(shí)現(xiàn)快速分離檢測(cè)。樣品經(jīng)過(guò)10％乙醇提取后，可有效去除運(yùn)動(dòng)飲料中的復(fù)雜基質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的凈化，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)運(yùn)動(dòng)飲料中VB（1硫胺素）、VB（2核黃素）、VB（5泛酸）、VB6（吡哆醇）、VB（7生物素）、VB（9葉酸）、VB1（2氰鈷胺）、煙酸、煙酰胺、VC 10種水溶性維生素。本方法具有快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，可對(duì)較寬濃度范圍內(nèi)的多種維生素進(jìn)行同步分析，有助于提高食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的分析效率，降低成本，為運(yùn)動(dòng)飲料中水溶性維生素的測(cè)定提供營(yíng)養(yǎng)價(jià)值參考。

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Determination of Water-soluble Vitamins in Sports Drink by UPLC-MS/MS

ZHANG Qin
（Henan University of Animal Husbantry and Economy，Zhengzhou 450046，Henan，China）

The determination of 10 kinds of water-soluble vitamins， including vitamin B1， vitamin B2， vitamin B5， vitamin B6， vitamin B7， vitamin B9， vitamin B12， niacin， nicotinamide， vitamin C in sports drink ，was established by ultra high performance liquid chromatography mass spectrometry.After the sample was treated with 10％ethanol to precipitation extraction，the separation of target compound was performed on a Waters Atalantis T3chromatographic column（2.1mm×150mm， 3μm）using 0.1％formic acid-10.0％methanol as mobile phase under gradient elution mode.The linear range of 10 kinds of water-soluble vitamins was in the range of 10.0ng/mL～1 000.0ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 3-0.999 9.The detection limit was 0.10 μg/kg-11.5 μg/kg and the quantitative limit was 0.35 μg/kg-38.0 μg/kg.The recovery rate was 90.3％-99.5％， and the relative standard deviation（RSD）was 2.0％-3.6％.

ultra high performance liquid chromatography massspectrometry（UHPLC-MS/MS）；sportsdrink；water-soluble vitamins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.035

2017-03-23

張欽（1975—），男（漢），副教授，碩士，主要從事學(xué)校體育和社會(huì)體育。