周悅榕，李丹妮，吳劍平，嚴(yán) 鳳，潘 娟，張 婧，顧 欣

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬糞便中6種抗生素殘留的基質(zhì)效應(yīng)研究

周悅榕，李丹妮，吳劍平，嚴(yán) 鳳，潘 娟，張 婧，顧 欣*

(上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于液質(zhì)聯(lián)用分析中。該文通過(guò)評(píng)價(jià)“離子抑制率”指標(biāo)，系統(tǒng)考察了應(yīng)用超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-ESI-MS/MS)測(cè)定豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、金霉素、泰樂(lè)菌素6種抗生素殘留的基質(zhì)效應(yīng)。樣品經(jīng)McIlvaine-Na2EDTA緩沖溶液提取后，采用HLB固相萃取柱凈化，濃縮富集后用0.1%甲酸-甲醇溶液(85∶15，體積比)溶解。經(jīng)SB C18RRHD色譜柱分離，以甲醇-0.1%甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在正離子電噴霧下采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。結(jié)果表明，豬糞便基質(zhì)對(duì)6種抗生素的測(cè)定存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)校正法并優(yōu)化樣品處理?xiàng)l件可以對(duì)基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的影響進(jìn)行補(bǔ)償與消除。該研究為提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度提供了借鑒。

基質(zhì)效應(yīng)；離子抑制率；超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)；抗生素；豬糞便

20世紀(jì)90年代初，抗生素被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[1-2]，主要用于動(dòng)物疾病預(yù)防與治療，作為飼料添加劑提高飼料利用率及作為動(dòng)物的促生長(zhǎng)劑等[3-5]。抗生素類(lèi)藥物進(jìn)入動(dòng)物消化道后，僅少部分經(jīng)過(guò)羥基化、裂解和葡萄糖苷酸化等代謝反應(yīng)成為無(wú)活性的物質(zhì)，大部分抗生素(約60%～90%)以原形或代謝物形式經(jīng)畜禽糞、尿和有機(jī)肥等排入農(nóng)田、土壤、大氣、河流湖泊、地下水等環(huán)境媒介中，最終通過(guò)食物鏈危及人類(lèi)健康[1-15]。本實(shí)驗(yàn)室曾建立了一種通過(guò)采集活體動(dòng)物糞便測(cè)定獸藥殘留的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)[16]。該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，能實(shí)時(shí)監(jiān)控養(yǎng)殖環(huán)節(jié)獸藥使用情況，同時(shí)通過(guò)活體樣本采集的方式確保了動(dòng)物本身的安全。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)通過(guò)確定質(zhì)量的母離子匹配相應(yīng)特征質(zhì)量的子離子進(jìn)行目標(biāo)物檢測(cè)，以其良好的特異性與高靈敏度著稱(chēng)。基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effects)是LC-MS/MS分析時(shí)存在的一個(gè)非常顯著的現(xiàn)象，會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定量產(chǎn)生極大影響，從而受到檢測(cè)者的高度重視[17-19]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督局(FDA)發(fā)布的《生物分析方法確證指南》(2001)[20]、歐洲醫(yī)藥評(píng)價(jià)署(EMEA)發(fā)布的《生物分析方法的驗(yàn)證指南原則》(2011)[21]均明確指出，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MSn)對(duì)生物樣品中目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)和方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)，需要做基質(zhì)效應(yīng)考察。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室原有檢測(cè)方法進(jìn)行改良，利用超高效液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS/MS)技術(shù)建立了同時(shí)測(cè)定豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、金霉素、泰樂(lè)菌素6種抗生素殘留的分析方法，系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了整個(gè)定量線(xiàn)性范圍內(nèi)豬糞便樣品基質(zhì)對(duì)6種抗生素測(cè)定的基質(zhì)效應(yīng)，并提出了針對(duì)性的消除方法，進(jìn)一步提高了UPLC-ESI-MS/MS法測(cè)定豬糞便中6種抗生素殘留結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters XevoTMTQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧(ESI+)離子源(美國(guó)Waters公司)；MassLynx v4.1質(zhì)譜工作站(美國(guó)Waters公司)；PL202-L感量為0.01 g、AB135-S感量為0.000 01 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；MS3 B S25旋渦混勻器、KS-260旋渦振蕩器(德國(guó)IKA公司)；Sk7210HP 超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)公司)； Millipore A10超純水系統(tǒng)(密理博(上海)貿(mào)易有限公司)；3 mL/40 mg Waters Oasis?HLB Extraction Cartridge固相萃取柱(美國(guó)Waters公司)； VisiprepTM-DL 型固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)；N-EVAP112 氮吹儀(美國(guó)Orangaomation公司)；親水PTFE 0.22 μm針式濾器(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

鹽酸二甲氧芐啶(純度>99%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；恩諾沙星(純度>99.8%)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；環(huán)丙沙星(純度>99.9%)購(gòu)自Sigma公司；金霉素(純度>92%)、泰樂(lè)菌素(純度>98%)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(純度>99%)均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；甲醇、乙腈、氨水、醋酸、氫氧化鈉、硝酸鎂、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸鈉(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸(分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；高純氮、高純氬(99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密稱(chēng)取6種抗生素藥物標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g(精確至0.000 01 g)，用適量甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度各為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冷藏保存，有效期6個(gè)月。

提取液溶液：McIlvaine-Na2EDTA(pH 4.0)緩沖液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取27.55 g Na2HPO4、37.22 g Na2EDTA和12.9 g檸檬酸，用1 000 mL二級(jí)水定容，配制成含0.1 mol/L Na2EDTA的McIlvaine緩沖液。用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)至pH 4.0，現(xiàn)配現(xiàn)用。

淋洗液：5%甲醇水溶液的配制：準(zhǔn)確量取5 mL甲醇并加入95 mL二級(jí)水，充分混合。

定容液：0.1%甲酸甲醇水溶液(85∶15，體積比，下同)：準(zhǔn)確量取15 mL甲醇，加入85 mL 0.1%甲酸水溶液，充分混合。

0.1%甲酸水溶液：準(zhǔn)確量取1 mL色譜純甲酸，加入999 mL 一級(jí)水，充分混合。

1.2 樣品采集及前處理

1.2.1 樣品的采集 將采集的新鮮糞便樣品，-20 ℃冷凍干燥并儲(chǔ)存。

1.2.2 提 取 稱(chēng)取豬糞便樣品1 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入10 mL Na2EDTA-McIlvaine(pH 4.0)緩沖液，充分振蕩10 min，8 000 r/min離心10 min，取出全部提取液。重復(fù)上述操作，合并2次上清液，充分混勻并準(zhǔn)確吸取4.0 mL提取液，在4 ℃下10 000 r/min 離心10 min后待用。

1.2.3 凈 化 HLB固相萃取小柱(3 mL/40 mg)先用3 mL甲醇、3 mL水活化。取4 mL離心備用液過(guò)柱，依次用 3 mL 5%甲醇溶液淋洗，3 mL甲醇洗脫。收集洗脫液于40 ℃水浴下用氮?dú)獯抵两?，?.0 mL 0.1%甲酸-甲醇水溶液(85∶15)溶解殘?jiān)芤哼^(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。若樣品液中含有的抗生素濃度超出儀器線(xiàn)性范圍，進(jìn)樣前可用0.1%甲酸甲醇水溶液(85∶15)稀釋至合適濃度。

1.3 儀器條件[16]

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent SB C18RRHD(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸溶液；梯度洗脫程序：0～2.0 min，20.0%～25.0% A；2.0～3.0 min，25.0%A；3.0～6.0 min，25.0%～80.0%A；6.0～7.0 min，80.0%A；7.0～7.1 min，80.0%～20.0%A；流速：0.3 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；電離模式：正離子模式(ESI+)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電離電壓：3.5 kV；錐孔溫度：500 ℃；脫溶劑氣流：800 L/h；反吹氣(氮?dú)?：50 L/h；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 6種抗生素的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量

*quantitative ion pair

1.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)方法

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配制：分別精密量取6種抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用適量甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液。準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g(精確至0.01 g)空白糞便，按“1.2”處理，即得空白糞便基質(zhì)液。向空白糞便基質(zhì)液中加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成質(zhì)量濃度分別為1、5、20、50、100 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。同時(shí)，用0.1%甲酸-甲醇水溶液(85∶15)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液配制成質(zhì)量濃度范圍相同的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。在“1.3”儀器條件下，供液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，以質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)，以定量離子對(duì)相應(yīng)的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，分別繪制6種抗生素的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)品均現(xiàn)配現(xiàn)用，并獲得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率K2與混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率K1，計(jì)算基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)中監(jiān)控離子響應(yīng)強(qiáng)度比試劑標(biāo)準(zhǔn)中相應(yīng)監(jiān)控離子響應(yīng)強(qiáng)度減少的百分比[22]，以評(píng)價(jià)糞便樣品對(duì)目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)因具有高分離性能、高選擇性與靈敏度、高準(zhǔn)確度與精密度、高分析速度與檢測(cè)通量等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于生物樣品中痕量物質(zhì)的分析與檢測(cè)。但采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行目標(biāo)化合物的痕量分析時(shí)，從色譜柱上共洗脫的非揮發(fā)性生物樣品基質(zhì)組分與目標(biāo)化合物離子在帶電液滴表面離子化的過(guò)程中相互競(jìng)爭(zhēng)，影響電噴霧接口處目標(biāo)化合物的離子化效率進(jìn)而導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，并表現(xiàn)為“離子增強(qiáng)”或“離子抑制”作用，從而對(duì)定量分析方法的準(zhǔn)確度和精密度產(chǎn)生影響[23-28]。其中，電噴霧離子源(Electrospray ionization ,ESI)受基質(zhì)效應(yīng)的干擾尤為顯著。

引起基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)來(lái)源主要為生物樣品中的內(nèi)源性成分(如：離子顆粒物成分、強(qiáng)極性化合物、各種有機(jī)物、目標(biāo)化合物的同類(lèi)物及其代謝產(chǎn)物等)和樣品前處理過(guò)程中引入的外源性成分(如：塑料管中殘留的聚合物、固相萃取柱填料、離子對(duì)試劑、有機(jī)酸、緩沖溶液、流動(dòng)相、色譜柱固定相流失物等)[27-28]。本研究的供試樣品“豬糞便”是一種成分復(fù)雜的生物樣品基質(zhì)。從畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)采集得到的糞便中水分占3/4，其余為固體成分(固體中30%為死細(xì)菌，10%～20%為脂肪，2%～3%為蛋白質(zhì)，10%～20%為無(wú)機(jī)鹽，30%為未消化的殘存食物和消化液中的固體成分)[6]。因此，糞便中的這些內(nèi)源性物質(zhì)與樣品前處理過(guò)程中引入的各類(lèi)外源性物質(zhì)所導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)將導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差。故本實(shí)驗(yàn)采用“離子抑制率[22,29-33](Ion suppression)”評(píng)價(jià)整個(gè)定量線(xiàn)性范圍內(nèi)樣品基質(zhì)對(duì)6種抗生素測(cè)定的影響。

據(jù)文獻(xiàn)[22,29-33]報(bào)道，離子抑制率計(jì)算公式為Ion suppression=(K2-K1)/K1，其中K2為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率，K1為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率。當(dāng)離子抑制率為0時(shí)，表示無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)離子抑制率大于0時(shí)，表示樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定存在基質(zhì)增強(qiáng)作用；當(dāng)離子抑制率小于0時(shí)，表示樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定存在基質(zhì)抑制作用。通過(guò)比較6種抗生素在豬糞便基質(zhì)中的離子抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2)發(fā)現(xiàn)：豬糞便樣品基質(zhì)對(duì)這6種抗生素的測(cè)定存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其中對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星、金霉素、泰樂(lè)菌素測(cè)定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)較為顯著。

表2 定容液與糞便基質(zhì)樣品中6種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與離子抑制率

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的消除

目前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法中基質(zhì)效應(yīng)的消除方法主要有：改善儀器條件(如：優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件，改用不同的離子源等)，選擇合適的樣品前處理方法，選擇性質(zhì)相近或穩(wěn)定的同位素內(nèi)標(biāo)校正，采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法、標(biāo)準(zhǔn)加入法等[22-27]。本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行定量，并與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋校正曲線(xiàn)法的定量結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明：通過(guò)空白糞便基質(zhì)液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋?zhuān)苁箻?biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液在電噴霧接口處具有一致的離子化條件，采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法進(jìn)行定量，能起到消除樣品中基質(zhì)效應(yīng)的作用，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

同時(shí)，在日常檢測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)，原有方法中使用親水性C18粉吸附提取液中懸浮糞便基質(zhì)的做法存在缺陷[16,27-28]。因?yàn)槲絼┯H水性C18粉將成為一種人為引入的外源性基質(zhì)成分促進(jìn)基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生，并且在大批量的檢測(cè)過(guò)程中難以準(zhǔn)確把握C18粉的用量。C18粉的過(guò)量使用不僅會(huì)導(dǎo)致金霉素和泰樂(lè)菌素的損失，而且會(huì)造成固相萃取柱的阻塞。因此，在以確保前處理方法對(duì)目標(biāo)化合物的提取效能為前提，并盡可能避免由前處理步驟引入其他的外源性基質(zhì)成分而導(dǎo)致額外的基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)兼顧前處理方法的簡(jiǎn)便性與可操作性的條件下，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)原有方法[16]進(jìn)行了調(diào)整，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)本研究改良的實(shí)驗(yàn)方法效果良好。

2.3 樣品前處理方法的比較

本研究將本實(shí)驗(yàn)室原有方法[16]在提取時(shí)加入吸附劑改為增加提取液用量，并在完全提取后對(duì)少量過(guò)柱樣液做高速冷凍離心處理，沉淀提取液中的蛋白質(zhì)與懸浮雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用空白糞便樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，比較了本實(shí)驗(yàn)室原有方法的樣品前處理方法與改良后樣品前處理方法對(duì)6種抗生素的提取效果。各目標(biāo)化合物的添加量均為5倍定量下限(LOQ)，制得的空白基質(zhì)加標(biāo)樣品按兩組分別以原方法與本研究確定的“1.2”步驟進(jìn)行樣品預(yù)處理，“1.3”步驟進(jìn)行儀器測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行，用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，改良后的樣品前處理方法對(duì)6種抗生素的回收率均高于原方法，提取效果更佳。增加提取液用量不僅有利于樣品前處理方法對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率，同時(shí)能稀釋樣品中的雜質(zhì)成分，起到降低基質(zhì)效應(yīng)的作用。

表3 兩種樣品前處理方法對(duì)6種抗生素提取的批內(nèi)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

*without information

2.4 方法有效性驗(yàn)證

2.4.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 精密量取6種抗生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用適量甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液。分別精密量取一定體積的該標(biāo)準(zhǔn)品混合中間液，并添加到1 g(精確至0.01 g)空白糞便中，配制成10、30、50、100、200、500 μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)樣，按照確定的前處理步驟與儀器條件進(jìn)行樣品前處理與儀器測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，定量離子對(duì)相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明：二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、泰樂(lè)菌素在10～500 μg/kg、環(huán)丙沙星和恩諾沙星在30～500 μg/kg、金霉素在50～ 500 μg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2.4.2 檢出限與定量下限 文獻(xiàn)[34]采用高效毛細(xì)管電泳的方法檢測(cè)畜禽糞便中氟喹諾酮類(lèi)與四環(huán)素類(lèi)的獸藥殘留，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法對(duì)恩諾沙星與金霉素的定量下限均為0.098 mg/kg。本研究取空白糞便樣品做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按“1.2”確定的實(shí)驗(yàn)步驟操作，取信噪比S/N≥3為檢出限(LOD)，S/N≥10為定量下限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明：經(jīng)本研究改良方法具有較低的檢出限和定量下限，優(yōu)于現(xiàn)有報(bào)道，檢測(cè)靈敏度高，能滿(mǎn)足對(duì)糞便樣品中痕量抗生素物質(zhì)的檢測(cè)需求。

表4 6種抗生素的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度 選擇豬糞便空白樣品作為供試對(duì)象，以定量下限(LOQ)的1倍、5倍、10倍 3個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行空白基質(zhì)加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，考察方法的準(zhǔn)確度與精密度。制得的空白基質(zhì)加標(biāo)樣品按照“1.2”與“1.3”條件進(jìn)行樣品前處理與儀器測(cè)定，每個(gè)批次內(nèi)同一加標(biāo)水平平行6次，重復(fù)3批次，用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，在3個(gè)加標(biāo)水平下，豬糞便中二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、泰樂(lè)菌素的回收率為66.3%～105.1%，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的回收率為71.0%～102.6%，金霉素的回收率為84.6%～104.9%。批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為3.8%～17.1%，批間RSD(n=3)為1.7%～15.7%。表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

表5 豬糞便中6種抗生素的批內(nèi)、批間回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4.4 實(shí)際樣品檢測(cè) 經(jīng)本研究改良的實(shí)驗(yàn)方法能滿(mǎn)足日常工作對(duì)畜禽糞便中6種抗生素殘留的檢測(cè)要求，結(jié)果見(jiàn)圖2。隨機(jī)抽樣上海市某區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)的10個(gè)糞便樣品，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，每份樣品平行2次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果顯示：金霉素、泰樂(lè)菌素、恩諾沙星在實(shí)際豬糞便樣品中的檢出率分別達(dá)到100%、50%、20%。

表6 實(shí)際樣品中6種抗生素的檢測(cè)結(jié)果

*N.D.:not detected ;D.:detected(the result is higher than LOD but lower than LOQ)

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)考察“離子抑制率”，系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)模式下，豬糞便樣品基質(zhì)對(duì)二甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、金霉素、泰樂(lè)菌素6種抗生素的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，豬糞便基質(zhì)對(duì)6種抗生素的測(cè)定存在不同程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)校正法以及改良的樣品前處理方法能予以有效地消除。本研究為快速檢測(cè)并準(zhǔn)確定量豬糞便中6種抗生素殘留提供了參考依據(jù)。

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50項(xiàng)食品安全國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)即將出臺(tái)

由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織在1963年創(chuàng)建的“食品法典委員會(huì)”在日內(nèi)瓦舉行第四十屆會(huì)議，與會(huì)成員考慮通過(guò)一系列新的國(guó)際食品標(biāo)準(zhǔn)，以保護(hù)消費(fèi)者健康并促進(jìn)開(kāi)展公平的食品貿(mào)易。

糧農(nóng)組織與世衛(wèi)組織發(fā)表媒體通報(bào)稱(chēng)，來(lái)自120多個(gè)國(guó)家的600多名代表此次齊聚日內(nèi)瓦，參加“食品法典委員會(huì)”第四十屆會(huì)議，將對(duì)50項(xiàng)國(guó)際食品安全標(biāo)準(zhǔn)以及30多項(xiàng)新的工作建議進(jìn)行討論，并對(duì)現(xiàn)行法典的文本進(jìn)行更新。

大會(huì)當(dāng)天首先通過(guò)了有關(guān)“動(dòng)物性食品中獸藥最大殘留限量”的最新標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)牛肉中的伊維菌素、雞肉等禽類(lèi)食品中的拉沙洛西鈉以及三文魚(yú)中的氟苯脲殘留量進(jìn)行了明確設(shè)定。同時(shí)，各國(guó)代表同意對(duì)《新鮮水果和蔬菜衛(wèi)生操作規(guī)范》進(jìn)行修訂，強(qiáng)調(diào)所有食品的生產(chǎn)、處理和準(zhǔn)備過(guò)程都涉及各種風(fēng)險(xiǎn)，但可以通過(guò)遵循良好的農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生措施來(lái)減少，以幫助控制微生物、化學(xué)和物理危害，最大限度地減少食源性疾病影響消費(fèi)者或?qū)残l(wèi)生造成負(fù)面影響的可能性。

“食品法典委員會(huì)”還通過(guò)了有關(guān)《營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽準(zhǔn)則》的編輯修改，其中包括維生素D和E的營(yíng)養(yǎng)參考值修訂，并批準(zhǔn)了有關(guān)“預(yù)防和減少大米砷污染操作規(guī)范”的擬議草案。此外，依據(jù)《2014-2019年戰(zhàn)略計(jì)劃》，食典委將對(duì)一系列新工作提案進(jìn)行審議，其中包括魚(yú)類(lèi)中甲基汞最高含量、修訂《最大限度減少和控制抗菌素耐藥性操作規(guī)范》、食品中不經(jīng)意出現(xiàn)的低水平化學(xué)物風(fēng)險(xiǎn)分析準(zhǔn)則、減少精煉油及相關(guān)產(chǎn)品中化學(xué)污染物的操作規(guī)范，并修訂《特定植物油標(biāo)準(zhǔn)》，其中將涉及核桃油、杏仁油、榛子油、阿月渾子油、亞麻籽油和鱷梨油等。

自1963年以來(lái)，在聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世衛(wèi)組織的推動(dòng)下，《食品法典》已經(jīng)成為消費(fèi)者、食品生產(chǎn)者和加工者、各國(guó)食品管理機(jī)構(gòu)和國(guó)際食品貿(mào)易的全球參照標(biāo)準(zhǔn)。

(信息來(lái)源：科技日?qǐng)?bào))

Study on Matrix Effects in Analysis of Six Antibiotics in Swine Manure by Ultra Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry

ZHOU Yue-rong,LI Dan-ni,WU Jian-ping,YAN Feng,PAN Juan,ZHANG Jing,GU Xin*

(Shanghai Animal Disease Control Centre，Shanghai 201103,China)

Matrix effects are universal phenomena in analysis of liquid chromatography-mass spectrometry.By evaluating ‘Ion suppression’,matrix effects of diaveridine,sulfameter,ciprofloxacin,enrofloxacin,chlorotetracycline and tylosin in swine manure detected by ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS)were systematically investigated.The sample was extracted with McIlvaine-Na2EDTA buffer solution,purified and concentrated by a HLB Extraction Cartridge.The residue was dissolved by 0.1% formic acid-methanol(85∶15，by volume).The target compounds were separated on an SB C18RRHD chromatographic column with 0.1% formic acid-methanol as mobile phase by gradient elution and detected in multiple reaction monitoring(MRM) mode via positive electrospray ionization(ESI+).The result showed that matrix enhancement effects existed in the detection of six antibiotics in swine manure.Furthermore,matrix-matched calibration curve and modified sample treatment could be used to compensate or eliminate the matrix effects in analysis of six antibiotics in swine manure.The study provided a reference for improving the accuracy and precision of the detection result.

matrix effects;ion suppression;ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS);antibiotics;swine manure

2017-04-11；

2017-05-10

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 [滬農(nóng)科攻字(2011)第4-9號(hào)]資助

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.08.011

O657.63；R978.1

A

1004-4957(2017)08-1010-08

*通訊作者：顧 欣，碩士，農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣研究員，研究方向：獸藥飼料與畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)，Tel：021-62689722，E-mail:guxun@sh163.net