白菁安，邊艷琴，牛旭艷，樊丹平，呂 誠(chéng)，姜 淼，趙 寧△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700； 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 201203)

【實(shí)驗(yàn)研究】

川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠血小板活化和炎癥反應(yīng)的影響?

白菁安1，邊艷琴2，牛旭艷1，樊丹平1，呂 誠(chéng)1，姜 淼1，趙 寧1△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700； 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 201203)

目的：探討川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠血小板活化和炎癥反應(yīng)的影響。方法：將50只SD大鼠隨機(jī)取10只作為正常組，其余制備大鼠關(guān)節(jié)炎模型，將成模大鼠分為模型組(CIA組)、川芎嗪組(TMP組)、來(lái)氟米特組(LEF組)、川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特組(T+L組)，各藥物干預(yù)組分別給予相應(yīng)藥物，計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)并觀察關(guān)節(jié)病理變化，檢測(cè)血清CRP及PDGF- BB水平，血漿GMP- 140及VCAM- 1水平。結(jié)果：與正常組比較，CIA組大鼠關(guān)節(jié)滑膜出現(xiàn)明顯細(xì)胞增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成浸入軟骨， CRP及PDGF- BB水平、GMP- 140及VCAM- 1水平均顯著上升；與CIA組比較，各藥物干預(yù)組大鼠關(guān)節(jié)病理變化中滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳和骨破壞形成均有改善，大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均減小，雙后肢關(guān)節(jié)紅腫程度評(píng)分均降低，CRP、 PDGF- BB蛋白水平、GMP- 140水平及VCAM- 1水平均降低，其中聯(lián)合用藥組效果優(yōu)于TMP組和LEF組。結(jié)論：川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特能夠顯著抑制膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的血小板活化和炎癥反應(yīng)，對(duì)于RA患者具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎；川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特；血小板活化

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthrits,RA) 是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥反應(yīng)、滑膜增生、血管翳形成進(jìn)而侵蝕關(guān)節(jié)軟骨及骨組織為基本病理改變的疾病。來(lái)氟米特是世界公認(rèn)的治療RA的常用藥物[1],可以減輕RA炎癥反應(yīng)和對(duì)關(guān)節(jié)的破壞。但臨床研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于血小板活化性高的RA患者，目前單純應(yīng)用來(lái)氟米特治療效果并不甚滿意[2]。但有研究表明，利用活血化瘀法聯(lián)合來(lái)氟米特治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，可提高來(lái)氟米特治療效果[3]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，血瘀證與血小板活化關(guān)系非常密切[4]，血小板黏附、活化、聚集進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成，被認(rèn)為是血瘀證形成的基本病理生理基礎(chǔ)[5]，不僅如此，血瘀證更是RA基本病機(jī)之一[6]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，血瘀證與炎癥之間有密切聯(lián)系。通過(guò)抑制血小板活化，改善血瘀證，減低炎癥反應(yīng)的發(fā)生，可能是很多具有活血化瘀性質(zhì)中藥抗炎的分子基礎(chǔ)[7]。故本研究嘗試用來(lái)氟米特聯(lián)合具有降低血小板活化功能的活血化瘀藥川芎嗪[8]作用于II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠，觀察川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特對(duì)動(dòng)物模型血小板活化的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物

6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供(合格證號(hào)SCXK(京)2007- 004)。

1.2 試劑

磷酸川芎嗪片購(gòu)自燕京藥業(yè)有限公司(批號(hào)090912)，來(lái)氟米特購(gòu)自福建匯天生物藥業(yè)有限公司(批號(hào)120904)，大鼠GMP- 140ELISA 試劑盒購(gòu)自Elabscience公司(批號(hào)10043450)。II型膠原(批號(hào)120440)、不完全弗氏佐劑(IFA)(批號(hào)120449)購(gòu)自Chondrex公司，大鼠CRP的ELISA試劑盒(批號(hào)109551062)、PDGF- BB的ELISA試劑盒(批號(hào)106627009)購(gòu)自eBioscience公司。

1.3 模型制備

實(shí)驗(yàn)第1天取適量牛Ⅱ型膠原將其溶于0.1M乙酸，配成濃度2 mg/ml Ⅱ型膠原溶液，4 ℃過(guò)夜。此溶液再與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化后以滴加于水中不擴(kuò)散為度。取乳化后的混合物按200 μg Ⅱ型膠原/只大鼠于尾根部皮下免疫，1周后按100 μg Ⅱ型膠原/只于尾根部皮下加強(qiáng)免疫1次。正常組以等量生理鹽水于尾根部進(jìn)行皮下假免疫。加強(qiáng)免疫7 d后，至少1個(gè)足趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)發(fā)紅、腫脹的大鼠，即判定為造模成功。

1.4 分組及給藥

將50只雄性SD大鼠按體質(zhì)量分層，隨機(jī)取10只作為正常組，其余40只采用牛II型膠原誘導(dǎo)制備大鼠關(guān)節(jié)炎模型，對(duì)成模大鼠(40只)按組織腫脹程度采用分層隨機(jī)方法分為模型組(CIA組)、川芎嗪組(TMP組)、來(lái)氟米特組(LEF組)、川芎嗪+來(lái)氟米特組(T+L組)各10只，加強(qiáng)免疫后7 d開(kāi)始給藥。TMP組給予川芎嗪(25 mg/kg/d)、LEF組給予來(lái)氟米特(10 mg/kg/d)，T+L組給予川芎嗪+來(lái)氟米特藥物(TMP25 mg/kg/d+LEF10 mg/kg/d),CIA組和正常組給予同等容積的蒸餾水。灌胃給藥每天1次，持續(xù)4周，并每隔2 d進(jìn)行1次稱重。實(shí)驗(yàn)過(guò)程動(dòng)物始終保持在12 h光照、12 h黑暗、溫度20～22 ℃、濕度控制在45%～65%之間，給藥期間正常供給飼料和飲水。

1.5 取材

末次給藥后當(dāng)天大鼠禁食不禁水，第2天稱重后，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，一部分收集于含有2%EDTA- Na2抗凝劑的抗凝管中，4 ℃ 3000rpm離心10 min，收集上層血漿置于-80℃保存?zhèn)溆茫黄溆嗍占陔x心管中，3000 rpm 4 ℃離心15 min取血清，-80℃保存、備用。取雙側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)，剔除關(guān)節(jié)周圍軟組織，置于福爾馬林液固定備用。

2 方法

2.1 指標(biāo)檢測(cè)

2.1.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)(Arthritis index,AI) 于給藥第1、8、12、16、20、24、28天分別對(duì)各大鼠雙后足關(guān)節(jié)紅腫程度進(jìn)行AI評(píng)分。評(píng)分方法參照5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)[9]，將2只后踝關(guān)節(jié)的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)，每個(gè)動(dòng)物最大為8 分。

2.1.2 踝關(guān)節(jié)病理觀察 將各組大鼠踝關(guān)節(jié)在含10%EDTA- Na2的脫鈣液中脫鈣，時(shí)間約持續(xù)2個(gè)月，期間每3 d更換1次脫鈣液。脫鈣完成后，用10%甲醛固定，然后酒精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色。

2.1.3 ELISA檢測(cè) 恢復(fù)試劑盒至室溫，確定所需微孔條數(shù)目及相關(guān)試劑用量。Wash Buffer(20×)稀釋、Assay Buffer(20×)稀釋、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、樣品稀釋、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本、空白孔加樣，1×Biotin- Conjugate配制及加樣；室溫孵育、洗板，1×HRP配制及加樣，室溫孵育及洗板；TMB底物溶液顯色，Stop Solution終止顯色，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化

圖1顯示，在給藥初各組大鼠之間AI評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，從給藥第8天開(kāi)始，所有大鼠AI值開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。與CIA組比較，在給藥第12天開(kāi)始，T+L組大鼠AI值開(kāi)始出現(xiàn)顯著降低(P<0.01)；在給藥第16天開(kāi)始，TMP、LEF和T+L組大鼠AI值均顯著低于CIA組(P<0.05或P<0.01)，且一直持續(xù)至給藥結(jié)束；在給藥第28天時(shí)，與TMP、LEF組比較T+L組大鼠AI值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T+L組從給藥第12天開(kāi)始到給藥結(jié)束，AI值均顯著低于CIA組，相較LEF組下降趨勢(shì)較穩(wěn)定，表明川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特對(duì)CIA作用起效早，療效較穩(wěn)定。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分注：與CIA組比較:*P<0.05，**P<0.01

3.2 各組大鼠關(guān)節(jié)病理變化

圖2顯示，正常組大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)滑膜增生及血管翳形成，關(guān)節(jié)面平整光滑；與正常組比較，CIA組大鼠滑膜細(xì)胞大量增生，滑膜增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳大量形成并向軟骨內(nèi)侵襲，關(guān)節(jié)融合成片，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，關(guān)節(jié)腔明顯變窄；與CIA組比較，TMP組、LEF組和T+L組大鼠關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管翳形成均有改善，骨破壞明顯減輕，尤以T+L組作用更顯著。

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)病理變化(HE染色 ×100)注：A:正常組；B:CIA組；C：TMP組；D：LEF組；E:T+L組

組別鼠數(shù)CRP(μg/ml)PDGF-BB(ng/ml)GMP-140(ng/ml)VCAM-1(ng/ml)正常組10453.95±176.1853.79±20.4142.61±8.07167.62±36.23CIA組10844.44±159.95a134.14±36.54a104.52±14.14a456.48±74.31aTMP組10653.66±113.33b87.68±21.37b52.09±12.45b232.80±28.48bLEF組10563.27±88.78b68.06±36.71b91.74±10.35284.35±57.21bT+L組10489.66±88.94b59.32±22.08b56.07±10.61b224.68±81.21b,c,d

注：與正常組比較:aP<0.01；與CIA組比較:bP<0.05；與TMP組比較:cP<0.05；與LEF組比較:dP<0.01

3.3 各組大鼠血清CRP和PDGF- BB蛋白水平、血漿VCAM- 1蛋白水平和GMP- 140水平變化

表1顯示，與正常組比較，CIA大鼠血清CRP和PDGF- BB蛋白水平、血漿VCAM- 1蛋白水平和GMP- 140水平均顯著上升(P<0.01)；與CIA組比較，TMP、LEF、T+L組大鼠血清CRP和PDGF- BB水平均顯著下降(P<0.05)；T+L組與TMP、LEF組比較有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與CIA組比較，TMP、T+L組大鼠血漿GMP- 140水平均顯著下降(P<0.05)，LEF組大鼠血漿GMP- 140水平與CIA大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與CIA組比較，TMP、LEF、T+L組大鼠血漿VCAM- 1水平均顯著下降(P<0.01)；與TMP、LEF組比較，T+L組大鼠血漿VCAM- 1水平均顯著下降(P<0.05)；TMP組與LEF組比較，VCAM- 1變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

RA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇。血瘀證是RA的基本病機(jī)之一。“血瘀”在RA發(fā)病過(guò)程中既可以成為主要的發(fā)病因素,又可作為其主要的病理機(jī)制而貫穿于整個(gè)疾病的始終[10]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，血瘀證與血小板活化密切相關(guān)，血小板的活化參與了血瘀證的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，是血瘀證產(chǎn)生的重要病理生理基礎(chǔ)[6]。

膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen- induced arthritis,CIA)模型在關(guān)節(jié)腫脹、滑膜炎、骨膜新骨形成、關(guān)節(jié)股侵蝕和骨丟失等方面與人類RA非常接近，是研究人類RA和其他自身免疫性關(guān)節(jié)炎理想的動(dòng)物模型[11]。

CRP在感染、炎癥、組織損傷后主要由肝細(xì)胞大量分泌產(chǎn)生釋放入血[12]，是臨床評(píng)價(jià)RA病情活動(dòng)及療效的重要指標(biāo)，在臨床被廣泛使用[13]。

GMP- 140被認(rèn)為是血小板活化的特異性標(biāo)志物[14]。GMP- 140可以介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞的黏附功能，介導(dǎo)白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上滾動(dòng)，引起炎癥反應(yīng)同時(shí)激活血小板微顆粒，釋放促炎因子IL- 1、IL- 6等炎性因子和更多的GMP- 140[15]，由此循環(huán)往復(fù)地促使RA滑膜炎癥持續(xù)存在和病情的進(jìn)展。

血管細(xì)胞間黏附分子(vascular adhesion molecule- 1，VCAM- 1)在非炎癥狀態(tài)表達(dá)很低，當(dāng)受到炎癥刺激時(shí)，與表達(dá)在單核細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞表面的α4β1整合素結(jié)合，使單核細(xì)胞、白細(xì)胞被捕獲并黏附在內(nèi)皮細(xì)胞表面，聚集于炎癥局部。RA最重要的病理特征是持續(xù)存在的滑膜炎，具體表現(xiàn)為滑膜組織中炎性細(xì)胞的大量浸潤(rùn)和血管翳的形成，而黏附分子包括VCAM- 1和GMP- 140在炎性細(xì)胞向滑膜組織浸潤(rùn)侵襲中均發(fā)揮重要作用，是介導(dǎo)RA滑膜炎癥過(guò)程中單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附的主要介質(zhì)[16]。

血小板源生長(zhǎng)因子(platelet- derived growth factor, PDGF)可以顯著加重RA關(guān)節(jié)炎癥，促進(jìn)滑膜襯里層細(xì)胞的增生及加速骨破壞等作用[17]。PDGF還有很強(qiáng)的致炎性，可以促進(jìn)IL- 1β誘導(dǎo)PGE2的合成增加，促進(jìn)TNF- α上調(diào)滑膜細(xì)胞中IL- 8的表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞活化并增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬能力等作用[18-19]。

有研究表明，激活的血小板脫顆粒是信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的過(guò)程[20]，其中a顆粒包含大量黏附蛋白、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及黏附受體，釋放入血后引起炎癥反應(yīng)、細(xì)胞黏附等作用，從而放大血小板激活，募集外周血小板聚集，且可促進(jìn)血栓的穩(wěn)定[21]。另外研究表明，血小板活化能夠誘導(dǎo)RA中單核細(xì)胞表型向促炎表型轉(zhuǎn)變，促使單核細(xì)胞- 血小板聚合物的形成，誘導(dǎo)促炎因子瀑布式釋放，尤其對(duì)處于活動(dòng)期的RA患者，血小板活化對(duì)單核細(xì)胞的誘導(dǎo)作用更加明顯[22]。由此可見(jiàn)，血小板活化與炎癥反應(yīng)之間相互影響，炎癥反應(yīng)可以誘導(dǎo)血小板活化，血小板活化也可以加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在RA中，炎性反應(yīng)與血小板活化之間相互作用，形成一個(gè)炎癥- 血小板活化網(wǎng)絡(luò)，共同影響RA疾病的進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，CIA大鼠GMP- 140、VCAM- 1和PDGF- BB表達(dá)均顯著升高，提示CIA大鼠血小板活化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特可以顯著降低GMP- 140、VCAM- 1和PDGF- BB，結(jié)果顯示川芎嗪聯(lián)合來(lái)氟米特可能通過(guò)顯著抑制血小板活化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生治療RA，這與大鼠AI評(píng)分、關(guān)節(jié)病理及血清CRP水平結(jié)果一致，提示對(duì)于RA患者具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Effect of Ligustrazine Combined with Leflunomide on Platelet Activation and Inflammatory Response in Collagen Induced Arthritis Rats

BAI Jing- an1, BIAN Yan- qin2, NIU Xu- yan1, FAN Dan- ping1, LV Cheng1, JIANG Miao1, ZHAO Ning1△

(1.Institute of Basic Research in Clinical Medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2. Shuguang Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China)

Objective: To explore the effect of combination therapy of tetramethylpyrazine(TMP) with leflunomide (LEF) on collagen induced arthritis(CIA) rats. Methods: Totally 50 male SD rats were stratified by body weight.Ten of them were randomly recruited as the normal control group.The rest 40 were established rheumatoid arthritis(RA) model.Forty successfully model rats were randomly divided into 4 groups,i.e.,the CIA group,the TMP group, the LEF group,and the TMP plus LEF group,10 in each group.Each drug intervention group was used corresponding scheme.Observing each joint pathological changes of rats, Serum Levels of CRP and PDGF- BB,and plasma levels of GMP- 140 and VCAM- 1 were detected.Results Compared with normal control group, the joint synovial of CIA rats appear obvious cell proliferation, inflammatory cells infiltration, pannus formation in cartilage. Serum levels of CRP and PDGF- BB,and plasma levels of GMP- 140 and VCAM- 1 were significantly increased. Compared with the CIA group, the drug intervention group rats joint pathological changes in synovial hyperplasia, inflammatory cells infiltration and pannus formation were improved, bone destruction significantly was reduced, T + L group effect is more significant. Arthritis index of rats were decreased of T + L combination group is better than TMP and LEF group. Double joint swelling, hind limbs of rats AI scores are less.Compared with TMP and LEF group, T + L AI value combination group rats significantly reduced; Serum levels of CRP and PDGF- BB were lower, and T + L effect is better than that of TMP and LEF group; plasma levels of GMP- 140 and VCAM- 1 were lower, T + L effect is superior to TMP and LEF group. Conclusion Combination of TMP with LEF could significantly inhibit platelet activation and inflammatory reaction of collagen induced arthritis rats，which has potential application value for RA patients.

Rheumatoid arthritis; Collagen induced arthritis; Combination therapy of tetramethylpyrazine with leflunomide; Platelet activation

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81573845)-從EphB/ephrinB2逆向信號(hào)調(diào)控滑膜及骨髓中破骨細(xì)胞分化探討腎虛在絕經(jīng)后RA發(fā)展中的作用;中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)自主選題資助項(xiàng)目(Z0412)-川芎嗪聯(lián)合氟米特治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效分子機(jī)制研究

白菁安(1985-)，女，北京人，實(shí)習(xí)研究員，醫(yī)學(xué)碩士，從事類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病證關(guān)聯(lián)研究。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0953- 04

2017- 01- 24

△通訊作者：趙 寧，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病證關(guān)聯(lián)研究，Tel：15801013626,E- mail：zhaon2003@163.com。