張博達(dá)，徐 升，李俊玲，董 滟

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075； 2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，南充 637000； 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610073)

【實(shí)驗(yàn)研究】

三子養(yǎng)親湯對哮喘小鼠EOT- 1、EOT- 3影響的實(shí)驗(yàn)研究?

張博達(dá)1,2，徐 升1，李俊玲1，董 滟3△

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075； 2. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，南充 637000； 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610073)

目的：觀察三子養(yǎng)親湯對哮喘模型小鼠嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子- 1(Eotaxin- 1，EOT- 1)、嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子- 3(Eotaxin- 3，EOT- 3)的影響，探索三子養(yǎng)親湯作用的分子機(jī)制。方法：按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為三子養(yǎng)親湯高、中、低劑量組及孟魯司特組，模型組和空白對照組建立哮喘小鼠模型，測定其肺組織中EOT- 1、 EOT- 3蛋白與基因表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，孟魯司特組、三子養(yǎng)親湯高劑量組肺組織中EOT- 1、EOT- 3濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三子養(yǎng)親湯中劑量組肺組織中EOT- 1、EOT- 3濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：三子養(yǎng)親湯能改善哮喘小鼠癥狀，其機(jī)制可能與下調(diào)EOT- 1和EOT- 3的表達(dá)有關(guān)。

支氣管哮喘；三子養(yǎng)親湯；氣道炎癥；平滑肌細(xì)胞；嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞 (如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等)和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，三子養(yǎng)親湯能抑制哮喘炎癥狀態(tài)，而嗜酸性粒細(xì)胞在肺部組織的募集、活化趨化因子方面發(fā)揮了重要作用[1]。因此，本實(shí)驗(yàn)從EOT- 1、EOT- 3入手，探索三子養(yǎng)親湯改善哮喘炎癥狀態(tài)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇鼠齡4～8周的C57BL小鼠共65只，平均體質(zhì)量(18～22)g。小鼠購于成都達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司(合格證號SCXK(川)2008- 24)，所有實(shí)驗(yàn)小鼠均喂飼于成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。飼養(yǎng)條件要求：所有小鼠以標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)鼠飼料喂養(yǎng)，12 h持續(xù)燈光照射，室溫維持在25 ℃左右，相對濕度維持于50%～70%。所有小鼠能自行進(jìn)食、飲水，在上述條件適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后正式開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑

“三子養(yǎng)親湯”湯劑由萊菔子12 g、白芥子12 g、紫蘇子12 g組成，試驗(yàn)藥物購自四川中藥材公司，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑科統(tǒng)一煎煮、濃縮；孟魯司特片10 mg，杭州默沙東制藥有限公司；OVA，sigma公司；Mouse Eotaxin1 ELISA kitIB- 22899試劑盒、 Mouse Eotaxin3 ELISA kitIB- 22897試劑盒、上海江萊生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，武漢博士德生物技術(shù)公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

倒置生物顯微鏡CKX- 31，日本奧林巴斯公司；超臨界萃取儀，SFT- 1000美國SFT公司；酶標(biāo)儀，Multlskan Mk3賽默飛世爾儀器有限公司；小鼠肺功能儀 EMKA，F(xiàn)rance。

1.4 動(dòng)物分組及造模

60只SPF級C57BL小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組5只、孟魯司特組5只、哮喘模型組20只和三子養(yǎng)親湯高、中、低組各10只。哮喘小鼠模型采用腹腔注射卵蛋白加霧化激發(fā)復(fù)制，分別于第1天和第14天于腹腔內(nèi)注射0．1%卵蛋白加氫氧化鋁凝膠混合液(二者比例為1∶4，pH7.4)。15～28 d在自制玻璃箱中霧化吸入2%卵蛋白生理鹽水5 ml，每日1次，每次持續(xù)30 min，連續(xù)激發(fā)14 d?？瞻捉M以相同方法霧化吸入0.9%生理鹽水5 ml。

1.5 給藥

灌胃和激發(fā)階段同步進(jìn)行。在每天激發(fā)前1 h，對中藥組小鼠分別給予濃度10.8 g·kg-1·d-1、5.4 g·kg-1·d-1、2.7 g·kg-1·d-1的三子養(yǎng)親湯中藥湯劑1 ml灌胃。西藥組小鼠用孟魯司特0.004 g·kg-1·d-1藥量1 ml進(jìn)行灌胃，空白組使用生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃2周。

1.6 小鼠肺功能測試

末次激發(fā)后進(jìn)行小鼠無創(chuàng)肺功能測試，將小鼠置于EMKA肺功能霧化器中，按0 mg/ml、3.125 mg/ml、6.25 mg/ml、12.5 mg/ml、25 mg/ml、50 mg/ml由低到高霧化乙酰膽堿，并記錄Penh值5 min。

1.7 肺組織中EOT- 1、 EOT- 3含量檢測

用頸部脫臼法處死小鼠，剪開胸腔將實(shí)驗(yàn)小鼠左肺小心剝離，取5 g肺組織在無菌條件下勻漿，取勻漿細(xì)胞上清液。根據(jù)試劑盒測試要求處理受試樣品，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法按試劑說明檢測哮喘模型小鼠肺組織中EOT- 1、EOT- 3的含量。

1.8 形態(tài)學(xué)觀察

小鼠處死后，肺組織標(biāo)本以10%福爾馬林固定，以蘇木精- 伊紅(H&E) 染色，并作病理切片，觀察肺組織的形態(tài)變化。

1.9 EOT- 1、 EOT- 3 mRNA q- PCR 檢測

小鼠肺組織用Trizol試劑提取總RNA，并檢測其純度及完整性制備cDNA。將引物離心，用去離子水稀釋后與cDNA反應(yīng)，經(jīng)40個(gè)循環(huán)后所得結(jié)果用ΔΔCT法分析。

引物序列：從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中搜索基因序列，使用Primer Premier 引物設(shè)計(jì)軟件篩選各基因特異性引物。所有引物均交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE純化。

表1 本次檢測所用引物及堿基序列

1．10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺功能結(jié)果

表2顯示，各組小鼠肺功能Penh值與乙酰膽堿濃度呈正相關(guān)，濃度低于12.5 mg/ml時(shí)，各組肺功能與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；濃度高于12.5 mg/ml時(shí)，各組肺功能與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 小鼠肺功能結(jié)果

注：與空白組比較：#P<0.05

2.2 肺組織病理學(xué)觀察

光鏡下可見，空白組肺組織結(jié)構(gòu)完整，模型組及各治療組均可見不同程度的炎性細(xì)胞浸潤、肺大皰形成、上皮水腫以及部分痰栓形成。正常組肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺組織形態(tài)無異常(見圖A)；模型組支氣管黏膜出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞聚集、大量杯狀細(xì)胞，肺泡腔擴(kuò)大(見圖B)；三子養(yǎng)親湯高劑量組肺泡腔內(nèi)偶見炎細(xì)胞散落，上皮水腫明顯減輕，氣管管壁無顯著增厚(見圖C)；三子養(yǎng)親湯中劑量組內(nèi)聚集少量炎細(xì)胞，氣管管壁輕微增厚(見圖D)；三子養(yǎng)親湯低劑量組炎性浸潤與上皮水腫輕微緩解，氣管管壁有所增厚(見圖E)；孟魯司特組支氣管腺體可見增生，少量杯狀細(xì)胞聚集于氣道內(nèi)，少量黏液栓塞于小氣道內(nèi)(見圖F)。

2.3 肺組織中EOT- 1、 EOT- 3蛋白與基因的含量測定結(jié)果

表3顯示，與空白對照組比較，各組EOT- 1、EOT- 3蛋白與基因表達(dá)均增加(P<0.05)；與哮喘模型組比較，用藥組中除三子養(yǎng)親湯低劑量組外，哮喘模型小鼠肺組織中EOT- 1、EOT- 3蛋白與基因表達(dá)均降低(P<0.05)，提示三子養(yǎng)親湯高中劑量及孟魯司特能降低EOT- 1、EOT- 3蛋白與基因的表達(dá)；與孟魯司特組比較，除三子養(yǎng)親湯低劑量組外，哮喘模型小鼠肺組織中EOT- 1、EOT- 3含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示三子養(yǎng)親湯中高劑量組對EOT- 1、EOT- 3的抑制與孟魯司特組相當(dāng)。

表3 三子養(yǎng)親湯對哮喘小鼠EOT- 1、EOT- 3蛋白與基因的影響

注：與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組小鼠肺組織病理切片觀察(HE×100)注： A.正常組；B.模型組； C.三子養(yǎng)親湯高劑量組； D.三子養(yǎng)親湯中劑量組；E.三子養(yǎng)親湯低劑量組；F.孟魯司特組

3 討論

哮喘是與激活的肥大細(xì)胞密切相關(guān)的炎癥反應(yīng)性疾病。肥大細(xì)胞可被特異性抗原激活，通過IgE途徑釋放組胺及引起白三烯的合成，這些介質(zhì)可以增加氣道平滑肌張力引起氣流阻塞。小鼠肺功能中乙酰膽堿濃度>12.5 mg/ml時(shí)，模型組Penh值對比空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，支氣管激發(fā)試驗(yàn)陽性，確定其為哮喘造模成功。

嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘中重要的炎癥細(xì)胞，EOT因其在體內(nèi)外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)對嗜酸性粒細(xì)胞有很強(qiáng)的選擇趨化性而得名。研究發(fā)現(xiàn)，抗原誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞在肺部組織的募集中eotaxin起主要作用。嗜酸性粒細(xì)胞被活化后可以分泌大量包含在嗜酸性顆粒內(nèi)的活性物質(zhì)，引起氣道上皮細(xì)胞損傷，并導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性(AHR)、慢性氣道阻塞及氣道炎癥等臨床癥狀。

EOT可分為3類，即EOT- 1、EOT- 2、EOT- 3，分別被稱為CCL11、CCL24、CCL26[2]。Berkman等闡明，哮喘對象的氣道受到變態(tài)反應(yīng)激發(fā)后Eot- 3mRNA的表達(dá)不斷增加，但未見Eot- 1，提示Eot- 3在遲發(fā)的哮喘反應(yīng)中起重要作用。EOT除在嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞有明確的表達(dá)外[3]，還能在多種器官、組織和細(xì)胞中表達(dá)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，人支氣管平滑肌細(xì)胞經(jīng)過IL- 1β、IL- 9、IL- 13、IL- 4的刺激能表達(dá)Eot。其中IL- 9能誘導(dǎo)Eot- 1的表達(dá)，而IL- 4和IL- 13能誘導(dǎo)支氣管平滑肌細(xì)胞表達(dá)Eot- 3，故支氣管平滑肌細(xì)胞被認(rèn)為是哮喘時(shí)導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞聚集Eot的重要來源細(xì)胞[4]。

三子養(yǎng)親湯出自明·《韓氏醫(yī)通》，具有降氣消食、溫化痰飲之功，為臨床治療哮喘的常用效方，方由紫蘇子、白芥子、萊菔子3味藥組成。蘇子降氣行痰、止咳平喘，白芥子溫肺利氣、快膈消痰，萊菔子消食導(dǎo)滯、行氣祛痰，三者合用可使氣順痰消、食積得化、咳喘得平，用于咳嗽喘逆、痰多胸痞、食少難消、舌苔白膩、脈細(xì)滑等癥[5]?！叭印本敌袣庀抵罚韵麨檠a(bǔ)，合而為用，可使氣順喘停、喘咳自愈。本研究通過比較各組病理改變發(fā)現(xiàn)，三子養(yǎng)親湯具有減輕肺組織局部炎癥水腫、減少黏液分泌作用。通過觀察EOT- 1和EOT- 3、EOT- 1 mRNA、EOT- 3mRNA等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，三子養(yǎng)親湯能減少炎癥因子釋放，降低炎癥反應(yīng)發(fā)生，從而舒張支氣管緩解哮喘癥狀，其機(jī)制可能是通過下調(diào)EOT- 1mRNA、EOT- 3 mRNA的表達(dá)，降低肺組織中EOT- 1和EOT- 3的含量而發(fā)揮作用。

[1] WENZEL SE，TRUDEAU JB，BARNES S，et al. TGF- R and IL- 13 synergistically increase EOT- 1 production in human airway fibroblasts[J]. The Journal of Immunology，2002，169(8)：4613- 4619.

[2] KITAURAM，SUZUKIN，IMAIT，et al. Molecular cloning of a novel human CC chemokine(EOT- 3)that is a functional lig- and ofCC chemodine receptor3[J].J BiolChem，1999， 274(39)：27975- 27980.

[3] BEIIANAN N，OHNONA S，CHUNG FK，et al. EOT- 3 but not eotaxin gene expression is upregulated in asdnnatics 24 hours after allergen challenge[J]. Am J Respir CellMol Biol， 2001，24：682- 687.

[4] ZUYDERDUYNS，HIEMSTRAPS，BABEKF，et al. TGF- beta differentially regulates TH2 cytokine- induced eotaxin and EOT- 3 release by human airway snooth muscle cells[J]. JAllergy C linImmunol， 2004，114(4)： 791- 798.

[5] 熊成熙，鄭德明.試述三子養(yǎng)親湯的構(gòu)理與運(yùn)用[J].安徽中醫(yī)臨床雜志，2003，15 (6)：537.

Experimental Study on the Effects of Sanzi Yangqin Decoction on EOT-1 and EOT-3 in Asthmatic Micee

ZHANG Bo- da1,2, XU Shen1, LI Jun- ling1, DONG Yan3△

(1. Chengdu University of TCM,Chengdu 610075, China; 2. North Sichuan Medical College,Nanchong 637000, China;3.Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610073, China)

Objective：Research on the mechanism of Sanzi Yangqin Decoction controlling asthma. Method：Take sixty- five 4- 8 week old C57BL mice，randomly divided into the normal group and the experimental group. The mice model of chronic asthma was established through OVA sensitization. Then gavaged various doses of Sanzi Yangqin decoction or Montelukast. Deteating the EOT- 1 and EOT- 3 levels in the lung tissue homogenate. Results： Compared with the model group，the Eotaxin1 level in the cell supernatant of mice in the Montelukast group and SZ- H group is obviously reduced，Eotaxin3 level in the cell supernatant of mice in the SZ- L group is free from noted change，having no statistical significance. Conclusion： Sanzi Yangqin Decoction could reduce the EOT- 1and EOT- 3 levels in the lung tissue homogenate of mice with asthma.

Asthma; Sanzi yangqin decoction; Airway inflammation; Smooth muscle cells; Eotaxin

四川省科技廳科技攻關(guān)計(jì)劃(2014SZ- 0071)-三子養(yǎng)親湯通過抑制 CysLTs通路改善哮喘癥狀的機(jī)制研究

張博達(dá)(1982- )，男，四川南充人，講師，醫(yī)學(xué)博士，從事呼吸系統(tǒng)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

△通訊作者：董 滟(1963- )，女，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)內(nèi)科學(xué)呼吸系統(tǒng)的臨床與研究，E-mail:27517113@qq.com。

R285.5

B

1006- 3250(2017)07- 0934- 03

2017- 01- 10