汪琦 李雄英 吳智娟 黃巧玲

膚寧洗劑微生物限度檢查方法的建立及驗(yàn)證

汪琦 李雄英 吳智娟 黃巧玲

膚寧洗劑；微生物限度；檢查方法

膚寧洗劑是由黃柏、白鮮皮、白芷、地膚子等中藥制成的復(fù)方制劑，具有清熱燥濕、祛風(fēng)止癢的功效，用于急性皮炎、濕疹伴有滲出或膿性分泌物等治療。按照其用藥途徑，根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）[1]相關(guān)規(guī)定，微生物限度檢查應(yīng)進(jìn)行需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定，及金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的檢查。為使供試品的微生物得到真實(shí)反映，必須使其在該檢驗(yàn)條件下的樣品濃度不足以抑制污染微生物的生長，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性[2－3]。在對膚寧洗劑進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)其有一定的抑菌作用，故建立膚寧洗劑的微生物限度檢查方法并對其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，從而為同類藥物的微生物限度檢查提供科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器高壓蒸汽滅菌器、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫電熱培養(yǎng)箱、生物安全柜、紅外滅菌器。

1.2 培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：151027）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號150825）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號150801）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號150806）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號150801）、pH7．0氯化鈉－蛋白胨緩沖液（批號140508）。以上培養(yǎng)基均購買自北京路橋技術(shù)股份有限公司，并且通過2015版《中國藥典》所規(guī)定的相關(guān)適用性試驗(yàn)，按使用說明書配制。

1.3 供試品膚寧洗劑（批號160222，160223，151006），杭州市第三人民醫(yī)院制劑中心。

1.4 試驗(yàn)用菌株及菌液制備金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、銅綠假單胞菌【CMCC（B）10104】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】、黑曲霉菌【CMCC（F）98003】。

以上菌種均由浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院提供，傳代次數(shù)均為第5代。

2 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

2.1 菌液制備取經(jīng)33℃培養(yǎng)18～24h后的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)物1個(gè)白金耳，用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的菌懸液；取經(jīng)23℃培養(yǎng)48～72h后白色念珠菌的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物1個(gè)白金耳，用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的菌懸液；取經(jīng)23℃培養(yǎng)120～168h后的黑曲霉菌的沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，用3mL 0．9%氯化鈉溶液將孢子洗脫，再用無菌毛細(xì)吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0．9%無菌氯化鈉溶液稀釋成每1mL含50～100cfu的孢子懸液。金黃色葡萄球菌菌液取10－7稀釋級，銅綠假單胞菌菌液取10－6稀釋級，枯草芽孢桿菌菌液取10－6稀釋級、白色念珠菌菌液取10－6稀釋級、黑曲霉菌菌液取10－4稀釋級。

2.2 供試液的制備量取供試品10mL，加pH7．0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，制成1：10的供試液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組（1）平皿法：取已制備的供試液1mL，及五種試驗(yàn)菌菌液，分別注入平皿中，迅速倒入45℃完全溶化的相應(yīng)培養(yǎng)基15～20mL，每株菌平行制備2個(gè)平皿，待冷凝后，置所需溫度下倒扣培養(yǎng)至規(guī)定的時(shí)間，觀察計(jì)數(shù)。（2）培養(yǎng)基稀釋法：取已制備的供試液0．2mL及五種試驗(yàn)菌菌液，其余方法同平皿法。（3）薄膜過濾法：取標(biāo)號A、B、C、D、E五個(gè)錐形瓶，加0．9%無菌氯化鈉溶液50mL，將制備好的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌液各0．1mL分別置A、B、C、D、E五個(gè)錐形瓶中，混勻。用少量沖洗液潤濕濾膜，取供試液1mL用薄膜過濾法濾過。取總量200mL0．9%無菌氯化鈉溶液沖洗供試品，最后分別將A、B、C、D、E五個(gè)錐形瓶內(nèi)的菌懸液倒入濾筒，濾過。測定需氧菌總數(shù)：轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行兩份，置33℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至規(guī)定的時(shí)間，觀察計(jì)數(shù)。測定霉菌和酵母菌總數(shù)：轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，平行兩份，置23℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至規(guī)定的時(shí)間，觀察計(jì)數(shù)。

2.3.2 菌液組取pH7．0氯化鈉－蛋白胨緩沖液替代供試品溶液，同試驗(yàn)組操作。

2.3.3 供試品對照組取制備好的供試液1mL，不加菌液，同試驗(yàn)組操作。試驗(yàn)組的菌落回收率（%）=

2.4 控制菌檢查法驗(yàn)證

2.4.1 試驗(yàn)組（1）常規(guī)法：取已制備的供試液各10mL，分別至盛有100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基兩個(gè)錐形瓶中，再加入50～100cfu金黃色葡萄球菌菌及銅綠假單胞菌菌懸液各1mL，于33℃培養(yǎng)24h。取上述培養(yǎng)物分別劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基及溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，于33℃培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果。（2）薄膜過濾法：取已制備的供試液各10mL，用薄膜過濾法過濾，再用0．9%無菌氯化鈉溶液總量為200mL沖洗，將膜取出，置于100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，再加50～100cfu金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌菌懸液各1mL，其余與同常規(guī)法。

2.4.2 供試品對照組不加菌液，方法同試驗(yàn)組。

2.4.3 陰性對照組以10mL稀釋液代替供試品，方法同試驗(yàn)組。

3 結(jié)果

按平皿法、培養(yǎng)基稀釋法及薄膜過濾法三種方法測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)中的供試品對照組的菌落數(shù)，在規(guī)定條件下培養(yǎng)。結(jié)果三種方法中3個(gè)批次藥品的供試品對照組本底組菌落數(shù)均為零。

按平皿法、培養(yǎng)基稀釋法及薄膜過濾法三種方法測定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)中的試驗(yàn)組及菌液中的菌落數(shù)，在規(guī)定條件下培養(yǎng)。結(jié)果平皿法及培養(yǎng)基稀釋法中五種陽性菌種的回收率均低于0．5，低于2015版《中國藥典》規(guī)定的0．5～2的回收率，而薄膜過濾法的五種陽性菌種的回收率均在0．5～2的范圍內(nèi)。說明該產(chǎn)品具有抑菌作用，可采用薄膜過濾法進(jìn)行該產(chǎn)品的微生物限度檢查。見表1。

采用常規(guī)法及薄膜過濾法對控制菌的檢查，結(jié)果常規(guī)法中試驗(yàn)組、供試品對照組及陰性對照組三批次膚寧洗劑中均未檢出金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌；而薄膜過濾法中試驗(yàn)組三批次膚寧洗劑中檢出金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌，均為（++），供試品對照組及陰性對照組三批次膚寧洗劑中均未檢出金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌。

4 討論

膚寧洗劑含有多種中藥成分，據(jù)文獻(xiàn)[4－8]報(bào)道，黃柏、白鮮皮、地膚子均有不同程度的抑菌作用。其中任何一味中藥具有的抑菌作用均可能影響該制劑微生物限度檢查的準(zhǔn)確性，但其抑菌作用對該制劑的微生物限度檢查到底有多大影響則無法確定，故采取2015年版《中國藥典》規(guī)定的三種方法對其進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，來確定最為合適的檢查方法。平皿法常用于無抑菌作用及抑菌作用較弱的藥物，對抑菌作用較強(qiáng)或強(qiáng)的藥物一般采用培養(yǎng)基稀釋法及薄膜過濾法[9－10]。為了藥品的檢出結(jié)果可靠、準(zhǔn)確、無假陰性，應(yīng)在檢驗(yàn)前消除其自身的抑菌作用所造成的干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定中，膚寧洗劑對五種陽性菌均具有不同程度的抑菌作用。采用平皿法及培養(yǎng)基稀釋法檢查均達(dá)不到2015年版《中國藥典》的規(guī)定，而采用薄膜過濾法則可消除膚寧洗劑的抑菌作用從而達(dá)到規(guī)定；控制菌檢查中常規(guī)法未檢測出金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌，而薄膜過濾法可檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，故本制劑的控制菌檢查選用薄膜過濾法。

表1 三種方法陽性菌菌落數(shù)及回收率結(jié)果（cfu/mL，）

表1 三種方法陽性菌菌落數(shù)及回收率結(jié)果（cfu/mL，）

方法平皿法組別試驗(yàn)組菌液組菌種160222需氧菌霉菌和酵母菌試驗(yàn)組菌液組回收率160223試驗(yàn)組菌液組回收率151006培養(yǎng)基稀釋法試驗(yàn)組菌液組回收率160222試驗(yàn)組菌液組回收率160223試驗(yàn)組菌液組回收率151006薄膜過濾法試驗(yàn)組菌液組回收率160222試驗(yàn)組菌液組回收率160223試驗(yàn)組菌液組回收率151006回收率金黃色葡萄球菌21．0±11．382．5±4．90．323．5±6．489．5±9．20．316．0±7．188．0±9．90．234．5±3．588．5±4．90．432．5±3．591．0±4．20．430．5±2．185．5±12．00．482．5±6．487．0±5．70．980．0±11．381．5±3．51．081．0±11．376．5±3．51．1銅綠假單胞菌20．5±0．784．0±7．10．321．0±2．888．5±2．10．323．0±12．783．5±7．80．331．5±3．592．0±7．10．432．0±7．189．5±9．20．426．0±2．882．5±4．90．480．5±7．885．5±3．50．981．5±7．876．0±4．21．181．0±8．587．5±6．41枯草芽孢桿菌21．0±2．886．0±9．90．319．5±3．579．5±6．40．319．5±0．781．0±8．50．329．0±5．786．5±12．00．427．0±2．880．5±2．10．432．5±2．188．5±2．10．467．0±4．285．5±9．20．872．5±9．282．5±13．40．979．0±8．578．5±13．41．1白色念珠菌16．5±3．589．0±8．50．221．5±2．182．5±4．90．321．0±4．274．0±7．10．330．5±4．987．5±4．90．424．0±2．886．0±11．30．330．5±4．983．5±7．80．490．5±6．480．5±3．51．270．0±8．577．5±7．80．974．5±10．681．0±12．71黑曲霉菌9．5±0．773．5±7．80．214．0±1．472．5±6．40．212．0±4．271．5±4．90．218．0±1．475．0±4．20．322．5±2．176．0±9．90．322．5±6．477．5±4．90．361．5±7．871．0±2．80．959．5±3．571．0±11．30．961．0±5．770．0±1．40．9白色念珠菌15．0±2．875．5±9．20．220．0±1．476．0±4．20．319．0±1．479．5±6．40．327．0±4．290．0±5．70．325．5±4．991．5±6．40．332．5±4．988．5±4．90．481．5±3．584．5±6．4167．0±7．179．5±3．50．971．0±12．792．5±4．90．8黑曲霉菌11．5±2．171．0±4．20．210．5±2．165．5±3．50．212．5±2．173．0±5．70．225．5±6．480．5±2．10．425．5±2．172．5±6．40．420．5±4．971．0±5．70．366．5±4．974．5±4．90．963．0±5．758．0±4．21．158．5±4．967．0±5．70．9

通過驗(yàn)證試驗(yàn)得出，膚寧洗劑的微生物限度檢查方法中，需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)及控制菌檢查均宜采用薄膜過濾法。

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（收稿：2016-12-25修回：2017-01-10）

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