劉文娟胡霖霖劉義宋明芬蔣海寅張永華

加味酸棗仁湯對(duì)睡眠剝奪大鼠細(xì)胞免疫功能紊亂的調(diào)節(jié)作用

劉文娟1胡霖霖1劉義1宋明芬1蔣海寅2張永華1

目的觀察加味酸棗仁湯對(duì)睡眠剝奪所致大鼠細(xì)胞免疫功能紊亂的調(diào)節(jié)作用。方法選擇SPF級(jí)SD大鼠40只，隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組、中藥組各10只。正常組大鼠給予無干擾常規(guī)喂養(yǎng)7天；余三組均采用平臺(tái)隨機(jī)移動(dòng)法造模7天，造模開始模型組同時(shí)予生理鹽水灌胃、西藥組予勞拉西泮片0．105mg/（kg·d）、中藥組予加味酸棗仁湯6．3g/（kg·d）灌胃，共7天。測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量，通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定，測(cè)定靜脈血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+，以及血清中白細(xì)胞介素－2（IL－2）、白細(xì)胞介素－6（IL－6）、IL－2/IL－6水平。結(jié)果與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降[（205±12．11）g比（254±13．33）g，P＜0．01]，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平與垂直得分顯著升高[（66．64± 11．82）分比（44．71±13．82）分，（26．43±4．82）分比（16．38±5．45）分，P＜0．01），CD4+/CD8+、IL2/IL6明顯下降[（1．16±0．64）比（1．74±0．52），（0．13±0．14）比（0．35±0．28），P＜0．05]。與模型組比較，中藥組體質(zhì)量明顯升高[（219±14．45）g比（205±12．11）g，P＜0．05]，但和西藥組比較無明顯差異[（219±14．45）g比（217±13．23）g，P＞0．05）]，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平和垂直得分明顯下降[（51．35±13．37）分比（66．64±11．82）分，（21．73±4．39）分比（26．43±4．82）分，P＜0．05]，但明顯高于西藥組[（51．35±13．37）分比（46．12±14．87）分，（21．73±4．39）分比（15．83±5．42）分，P＜0．05]；CD4+/CD8+、IL2/IL6比值明顯升高[（2．26±0．65）比（1．16±0．64）,（0．29±0．19）比（0．13±0．14），P＜0．01]，并明顯高于西藥組[（2．26±0．65）比（1．71±0．71），（0．29±0．19）比（0．17±0．11），P＜0．01]。結(jié)論加味酸棗仁湯能改善睡眠剝奪導(dǎo)致的模型大鼠體質(zhì)量下降和行為學(xué)改變，并能糾正其細(xì)胞免疫功能紊亂。

大鼠；睡眠剝奪；加味酸棗仁湯；細(xì)胞免疫

睡眠剝奪對(duì)于人體生理心理的影響十分明顯，它可以造成機(jī)體疲勞、作業(yè)能力下降、免疫力下降、警覺水平降低等不良反應(yīng)[1]。目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究均證實(shí)睡眠剝奪改變了免疫系統(tǒng)的組成，包括T細(xì)胞亞群的比例和細(xì)胞因子水平[2－3]。本研究旨在通過觀察睡眠剝奪大鼠T細(xì)胞亞群和其所分泌細(xì)胞因子的變化，探討加味酸棗仁湯對(duì)睡眠剝奪所致大鼠細(xì)胞免疫功能紊亂的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性成年Sprague－Dawley（SD）大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g。由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK（浙）2014－0001。自由進(jìn)食及飲水，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，室溫（22±2）℃，相對(duì)濕度40%左右，光照周期為12h（8AM－8PM）。

1.2 藥物勞拉西泮（商品名：羅拉，規(guī)格：0．5mg，海南大西洋制藥廠有限公司）購(gòu)于本院藥劑科，參考徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4]中動(dòng)物與人體的每公斤體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，大鼠給藥量為1mg/60kg×6．3=0．105mg/kg，用蒸餾水配制成0．011mg/ mL濃度灌胃。加味酸棗仁湯（主要成分：酸棗仁、茯苓各15g，川芎、生梔子、淡豆豉各10g，生甘草5g），購(gòu)于本院藥劑科。根據(jù)動(dòng)物與人體的每公斤體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表，大鼠的生藥給藥劑量應(yīng)為65g/ 60kg×6．3=6．3g/kg，藥物浸泡30min后，水煮提取2次，合并煎液，濃縮為含生藥0．63g/mL，高壓滅菌4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組、中藥組，每組10只?？紤]灌胃對(duì)大鼠造成的情緒刺激，故正常組不予灌胃，給予無干擾喂養(yǎng)7天，余三組造模7天，同時(shí)西藥組予勞拉西泮片0．105mg/（kg·d）、中藥組給予加味酸棗仁湯6．3g/（kg·d）、模型組予生理鹽水灌胃（1mL/100g），1天1次，連續(xù)灌胃，共7天。

1.4 模型建立參照Meerlo的造模方法[5]，采用BW－NSD404睡眠剝奪儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司），大鼠在光照前4h（正常休息階段）被允許睡在飼養(yǎng)籠里，每天剩下的20h，睡眠剝奪大鼠被放置在隨機(jī)移動(dòng)的平臺(tái)里。正常組大鼠被放置在不移動(dòng)平臺(tái)里。

2 觀察指標(biāo)及方法

2.1 大鼠行為學(xué)評(píng)定實(shí)驗(yàn)前及治療后采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定[6]：將大鼠置于正方形曠場(chǎng)箱中央，記錄大鼠5min內(nèi)的行為表現(xiàn)，包括水平穿越格數(shù)（水平運(yùn)動(dòng)得分）、直立次數(shù)（垂直運(yùn)動(dòng)得分）。同時(shí)測(cè)定大鼠體質(zhì)量。

2.2 T細(xì)胞亞群及白細(xì)胞介素－2（IL－2）、白細(xì)胞介素－6（IL－6）檢測(cè)造模7天后，處死大鼠，下腔靜脈取血2mL，肝素鈉抗凝，雙熒光抗體標(biāo)記法測(cè)定CD4+、CD8+、CD4+/CD8+，儀器為美國(guó)BECKMAN COULTER公司EPICS XL流式細(xì)胞儀。采集大鼠靜脈血，1000×g離心10min，酶聯(lián)免疫吸附劑法檢測(cè)血清IL－2、IL－6。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量變化實(shí)驗(yàn)前各組大鼠體質(zhì)量均無顯著差異（P＞0．05）。實(shí)驗(yàn)后正常組體質(zhì)量顯著增加（P＜0．01）。模型組、西藥組、中藥組體質(zhì)量均不同程度下降（P＜0．05或P＜0．01）。與模型組比較，中藥組與西藥組顯著高于模型組（P＜0．05或P＜0．01），但中藥組與西藥組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（g，）

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（g，）

注：與造模前比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01

組別正常組模型組西藥組中藥組鼠數(shù)10101010造模前235±15．12236±13．14230±14．12233±13．66造模后254±13．33**▲▲205±12．11** 217±13．23*▲219±14．45*▲

3.2 各組大鼠行為學(xué)改變與正常組比較，模型組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)水平與垂直得分均顯著升高（P＜0．01）。與模型組比較，中藥組、西藥組水平與垂直得分均顯著降低（P＜0．05或P＜0．01），但中藥組高于西藥組（P＜0．05）。見表2。

3.3 各組大鼠T細(xì)胞亞群變化與正常組比較，模型組CD4+T細(xì)胞顯著下降（P＜0．01），CD8+T細(xì)胞顯著升高（P＜0．01），CD4+/CD8+比值顯著下降（P＜0．05）。與模型組比較，中藥組與西藥組CD4+T細(xì)胞均顯著升高（P＜0．01或P＜0．05），并且中藥組明顯高于西藥組（P＜0．05）；中藥組CD8+T細(xì)胞明顯下降（P＜0．01），西藥組下降不明顯（P＞0．05）；中藥組和西藥組CD4+/CD8+比值明顯升高（P＜0．01或P＜0．05）,并且中藥組明顯高于西藥組（P＜0．05）。見表3。

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分（分，）

表2 各組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分（分，）

注：與正常組比較，**P＜0．01；與模型組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；與西藥組比較，＃P＜0．05

組別正常組模型組西藥組中藥組鼠數(shù)10101010水平得分44．71±13．8266．64±11．82** 46．12±14．87▲▲51．35±13．37▲＃垂直得分16．38±5．4526．43±4．82** 15．83±5．42▲▲21．73±4．39*▲＃

表3 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化（%，）

表3 各組大鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化（%，）

注：與正常組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；與西藥組比較，＃P＜0．05

組別正常組模型組西藥組中藥組鼠數(shù)10101010 CD4+T 45．75±5．3437．87±4．39** 41．77±4．23▲45．24±3．68▲▲＃CD8+T 20．87±3．8926．62±3．41** 24．43±2．9620．12±3．57▲▲＃CD4+/CD8+ 1．74±0．521．16±0．64* 1．71±0．71▲2．26±0．65▲▲＃

3.4 各組大鼠血清IL－2、IL－6含量變化與正常組比較，模型組IL－2顯著下降（P＜0．01），IL－6水平顯著增高（P＜0．01），IL－2/IL－6顯著下降（P＜0．01）。與模型組比較，中藥組和西藥組IL－2明顯升高（P＜0．01或P＜0．05），中藥組IL－6明顯降低（P＜0．05），IL－2/ IL－6比值明顯升高（P＜0．05），西藥組變化不明顯，見表4。

表4 各組大鼠IL－2、IL－6含量比較（）

表4 各組大鼠IL－2、IL－6含量比較（）

注：與正常組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01；與西藥組比較，＃P＜0．05；IL－2：白細(xì)胞介素－2；IL－6：白細(xì)胞介素－6

組別正常組模型組西藥組中藥組鼠數(shù)10101010 IL－2（ng/mL）7．57±2．164．27±1．58** 5．66±1．63▲7．27±1．66▲▲＃IL－6（pg/mL）21．89±10．4539．13±11．67** 34．15±9．1725．77±9．89▲＃IL－2/IL－60．35±0．280．13±0．14** 0．17±0．110．29±0．19▲＃

4 討論

失眠或睡眠不足常常會(huì)影響心理、生理，從而出現(xiàn)心中懊惱、煩躁不安、口干眼干等陰虛火旺之癥。酸棗仁湯是治療肝陰不足失眠之要方，梔子豉湯是清熱除煩之良方。兩方合用對(duì)于改善陰虛火旺失眠具有較好的臨床效果。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test，OFT）是經(jīng)典的非條件反射模型，用以評(píng)價(jià)動(dòng)物的焦慮水平，OFT可以檢測(cè)小鼠自發(fā)活動(dòng)行為和探索行為，并利用這些特性比較動(dòng)物的焦慮程度。OFT實(shí)驗(yàn)歷史悠久,實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，被廣泛用于科研研究，用來檢測(cè)抗抑郁與焦慮藥物時(shí)，具有很好的表面效度[6]。

T淋巴細(xì)胞是參與機(jī)體免疫功能最重要的免疫細(xì)胞，而CD4+、CD8+T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞亞群的重要組成部分，CD4+/CD8+為免疫調(diào)節(jié)的重要指標(biāo)之一，無論升高或降低，均表明細(xì)胞免疫功能紊亂，其比值降低多見于免疫缺陷病、腫瘤、感染等，而升高多見于自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。研究發(fā)現(xiàn)[7]，睡眠剝奪和快速眼動(dòng)（REM）睡眠剝奪可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量下降。原始CD4+T淋巴細(xì)胞可分化為Th1、Th2，其中IL－2等是Thl輔助T細(xì)胞的標(biāo)記，其能提高巨噬細(xì)胞殺菌活性，同時(shí)是T淋巴細(xì)胞分泌的最主要的正相調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，具有抗腫瘤、抗感染等作用。Th2輔助T細(xì)胞產(chǎn)生IL－6，可刺激B細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，放大體液免疫反應(yīng)[8]。IL2/IL6能夠反映Th1/Th2平衡性，與免疫功能密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪后大鼠體質(zhì)量顯著下降，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的水平與垂直得分明顯升高（P＜0．01），說明睡眠剝奪可以導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量下降，同時(shí)帶來焦慮情緒；中藥、西藥干預(yù)后可以減輕睡眠剝奪所致體質(zhì)量下降和焦慮行為，其中對(duì)焦慮行為的改善方面西藥優(yōu)于中藥。睡眠剝奪后大鼠CD4+/CD8+、IL2/IL6均顯著下降（P＜0．01），提示機(jī)體免疫功能紊亂，機(jī)體抗感染、腫瘤能力下降；經(jīng)過中藥干預(yù)后，CD4+/ CD8+、IL2/IL6下降得到明顯改善（P＜0．05），并且效果明顯優(yōu)于西藥（P＜0．05）。由此推測(cè)加味酸棗仁湯對(duì)細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用除與減輕焦慮所致的免疫功能紊亂相關(guān)外，還可能是通過直接作用于T淋巴細(xì)胞而達(dá)到免疫調(diào)節(jié)作用。

［1］張舒，吳興裕.睡眠剝奪對(duì)工作能力影響的研究進(jìn)展［J］.中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志，1997，8（3）：186－189．

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［3］Shlomo-Yehuda，Benjamin Sredni，RafiLCarasso，etal. REM sleep deprivation in rats results in inflammation and interleukin－17 eleva tion［J］．Journalof Interferon&Cy tokine Research，2009，29（7）：393-398.

［4］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1861.

［5］MeerloP，KoehlM，VanDerBorghtK，etal.SleepRestriction Alters the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Response to Stress［J］.Journal of Neuroendocrinology，2002，5（14）：397-402.

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［8］LucaImeri，MarkR.How（andwhy）theimmunesystem makes us sleep［J］.Nature Reviews Neuroscience，2009，10（3）：199-210.

（收稿：2017-02-04修回：2017-04-20）

Regulation of Jiawei Suanzaoren Decoction to Cellular Immune Dysfunction Caused by Sleep Deprivationin Rats

LIU Wenjuan1,HU Linlin1,LIU Yi1,SONG Mingfen1,JIANG Haiyin2,ZHANG Yonghua1．1 HangZhou Sev－

enth People's Hospital，Hangzhou(310013),China;2 Key Laboratory of Diagnosis and Treatment for Infectious Disease,First Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310006),China

Objective Toobserve the regulation of Jiawei Suanzaoren decoction for cellular immune dysfunction in rats with sleep deprivation．Methods FortySD rats was randomly divided into four groups:control group,model group,western medicine group and Chinese medicine group．Control group was given normal feeding．Exceptcontrolgroup，others all used BW－NSD404 sleepd eprivationmachineto make model for 7 days．Model group wereadministered intragastrically with normal saline（NS）,western medicine group with lorazepam tablets（0．105mg/（kg·d））,chinese medicine group with Jiawei Suanzaoren decoction（6．3g/（kg·d））every day．The weight of rats were measured，CD4+,CD8+,CD4+/CD8+invein，was determined and serum IL－2,IL－6,and IL－2/IL－6 was detected．Open Field Test（OFT）was used to evaluate the behavior of rats．Results Compared with control group,the weight of rats in the model group reduced（205±12．11g vs 254±13．33g;P＜0．01）,the horizontal and vertical score raised in OFT（66．64±11．82 vs 44．71±13．82;26．43±4．82 vs 16．38±5．45;P＜0．01）,CD4+/CD8+and IL－2/IL－6 ratios were lower（1．16±0．64 vs 1．74±0．52;0．13±0．14 vs 0．35±0．28;P＜0．05）．Compared with model group,chinese medicine group had increasedbody weight（219±14．45,P＜0．05）,but no significant difference to that of western medicine group（217± 13．23,P＞0．05）,lower horizontal and vertical scores of OFT（51．35±13．37,21．73±4．39,P＜0．05），but higher than thatof western medicine group（46．12±14．87,15．83±5．42,P＜0．05）,higher CD4+/CD8+and IL－2/IL－6 ratios（2．26±0．65, 0．29±0．19,P＜0．01），and also higher than that of western medicine group（1．71±0．71,0．17±0．11,P＜0．01）．Conclusion Jiawei Suanzaoren decoction can improve the weight of rats with sleep deprivation and correct their behavior as well as adjusting the immune function disorder．

rats;sleepdeprivation;Jiawei Suanzaoren decoction;cellularimmune

book=659,ebook=27

杭州市衛(wèi)生計(jì)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No．2016A47）

1．杭州市第七人民醫(yī)院心身科（劉文娟、胡霖霖、劉義）、分子生物學(xué)研究室（宋明芬）；睡眠障礙診療中心（張永華）（杭州310013）；2浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（杭州310006）

張永華，Tel：13306510088；E－mail：zyh16916@163．com