孫德君 柴華 馮艷男 楊朋欣 秦立鑫/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

禽Ⅰ群腺病毒血清4型感染的診斷與防治

孫德君 柴華 馮艷男 楊朋欣 秦立鑫/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

禽腺病毒分為3群。禽腺病毒Ⅰ群來自雞、火雞、鵝等禽類，具有共同的群特異抗原。Ⅱ群包括火雞出血性腸炎、大理石脾病和雞脾腫大癥的病毒，這些病毒有可與Ⅰ群相區(qū)別的群特異抗原。Ⅲ群是與產(chǎn)蛋下降綜合征有關(guān)的病毒以及來自鴨的相關(guān)病毒，具有與Ⅰ群部分相同的共同抗原。

與禽腺病毒Ⅱ群、Ⅲ群不同，禽腺病毒Ⅰ群作為病原體的作用尚未完全明確，作為自然感染的原發(fā)性病原體仍有爭議。一般認(rèn)為它可引起包涵體肝炎（IBH）。張澤紀(jì)等（1986）報道從廣東3個大型雞場進(jìn)口AA雞父母代雞群采取203份血樣用瓊脂擴(kuò)散試驗檢查結(jié)果，包涵體肝炎陽性率達(dá)7．5%～81%。越來越多的事實證明它在傳染性法氏囊病和傳染性貧血中可引起繼發(fā)性病原的作用。

雞包涵體肝炎(Inclusion Body Hepatitis， IBH)是由Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus Ⅰ，F(xiàn)AV-Ⅰ)引起的一種急性傳染病，該病以侵害肝臟為特征，可在肝細(xì)胞中形成嗜酸性或嗜堿性包涵體。其臨床癥狀表現(xiàn)為個別雞突然死亡，死亡雞多體況良好，發(fā)病雞表現(xiàn)為食欲不振，羽毛粗亂，嗜睡，嚴(yán)重貧血，雞冠褪色，出現(xiàn)一過性水樣便(卡爾尼克等， 1991)，一般在 48 h 內(nèi)死亡或康復(fù)。 有研究表明，F(xiàn)AV-Ⅰ為機(jī)體常在的條件性致病病原，雞馬立克氏?。∕D）、傳染性法氏囊?。↖BD）和雞傳染性貧血（CIA）等免疫抑制病能夠明顯增加 IBH 的發(fā)病率，增加該病的危害。尤其是傳染性法氏囊?。↖BD），其引起的免疫抑制，是IBH 發(fā)生的一大誘因，因此控制傳染性法氏囊病的發(fā)生是預(yù)防 IBH的一種重要手段。該病呈急性經(jīng)過，死亡率高，給禽業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

一、發(fā)病情況

該雞場飼養(yǎng)了2 000多只30日齡肉雞，臨床可見呼吸困難，雞群中出現(xiàn)零星雞只死亡。病雞萎頓、蹲伏、羽毛蓬松，精神萎靡、雞冠和面部皮膚蒼白、排白綠色稀便。剖檢病死雞，主要病理變化為：可見大量心包積液、肝色淺質(zhì)脆、腫大充血。

圖1 病死雞心包積液、肝色淺質(zhì)脆、腫大充血

二、病理剖檢病變

IBH 特征性病理剖檢變化表現(xiàn)在肝臟和骨髓。肝臟腫大，邊緣鈍圓，表面有不同程度的出血點(diǎn)或條索狀出血斑，質(zhì)脆，褪色，呈淡黃色，膽囊充盈，內(nèi)有大量膽汁淤積。偶爾可見肝臟有大小不一的壞死灶，并伴隨血細(xì)胞浸潤，使肝臟觸之有凹凸不平的感覺。骨髓呈灰白色或黃色膠凍樣病變、體積變小，法氏囊萎縮，內(nèi)膜有出血點(diǎn)或出血斑，且切面無光澤。胸腺點(diǎn)狀出血、萎縮、且顏色變深。脾臟體積變化不大，偶見個別病例脾臟腫大、出血。腎臟呈灰白色、腫大，表面有癖斑和疲點(diǎn)。肺充血、水腫，除此之外，可見大腿部肌肉、胸肌以及皮下組織有明顯出血，脂肪黃染。

三、病理組織學(xué)變化

病理組織學(xué)特征性變化在肝臟，表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性，肝臟實質(zhì)中可見由多個肝細(xì)胞形成的形狀不規(guī)則的壞死灶，有時可見小葉中心部位彌漫性細(xì)胞腫脹和壞死，伴發(fā)空泡變性和細(xì)胞膜破裂，肝細(xì)胞萎縮核固縮等變化。心臟病理變化不明顯，僅見心肌纖維中間有大量的淋巴細(xì)胞和血細(xì)胞浸潤。腎臟間質(zhì)血細(xì)胞浸潤，相鄰腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死，有的腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性并大量壞死，偶爾可見水泡變性。脾臟大量早幼粒細(xì)胞浸潤，白髓中央動脈周圍淋巴細(xì)胞散在壞死灶，鞘動脈四周網(wǎng)狀細(xì)胞明顯增生。 法氏囊淋巴小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，稀疏，偶爾會出現(xiàn)網(wǎng)狀細(xì)胞的輕度增生。肺間質(zhì)輕度水腫、有少量的紅細(xì)胞侵潤。

圖2 病死雞的心、肝、法氏囊、腎、脾、肺病理切片

四、實驗室診斷

1.引物的設(shè)計合成。根據(jù) GenBank 中已發(fā)表的Ⅰ群禽腺病毒 Hexon 基因核酸序列設(shè)計完成兩對引物，預(yù)計擴(kuò)增片段為500 bp。

上游引物為P1： 5'CGAGGTCTATACCAACACGAGCA-3'；下游引物為 P2： 5'-CGGCGCAGG TTAATGAAGTTATC-3'。引物由吉林庫美生物工程技術(shù)有限公司合成。

2.病毒分離與鑒定。取疑似雞包涵體肝炎病雞的肝臟剪碎，按 1∶5（W/V）比例加入滅菌PBS進(jìn)行勻漿處理，將勻漿液反復(fù)凍融 3次，4 000 r/min離心30 min，取上清液備用。上清液中加雙抗（青霉素、鏈霉素）各3 000 U/ml，置4℃過夜，以8 000 r/min離心10 min，取制備的上清液以卵黃囊途徑接種5日齡SPF雞胚，0．2 ml/胚，于 37℃孵育，每日觀察2次，收獲24～144 h內(nèi)死亡的雞胚尿囊液，收集死胚尿囊液，進(jìn)行HA試驗及PCR鑒定。

3.病毒DNA的提取及PCR擴(kuò)增。病毒液采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA DNA Extraction Kit Ver．5．0 提取試劑盒，按說明書進(jìn)行病毒DNA的提取。PCR反應(yīng)采用25 ul體系： 滅菌雙蒸水17 μl、10×PCR Buffer 2．5 μl、DNA 溶 液 2．0 μl、dNTP（2．5 mmol/μl）2 μl、上下游引物 1μl、Taq 酶 0．5 μl。PCR擴(kuò)增程序為： 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，95℃變性50s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，35個循環(huán)，72℃延伸 10 min。 PCR反應(yīng)完畢后，取6 μl PCR產(chǎn)物，1．0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，于紫外燈下觀察電泳結(jié)果。電泳結(jié)果顯示，待檢樣本中可擴(kuò)增出1條約500 bp的目的條帶(圖1)，而陰性對照未出現(xiàn)條帶。而用禽流感病毒、新城疫病毒和雞傳染性法氏囊病病毒的引物，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果均為陰性。再結(jié)合發(fā)病情況和剖檢變化，診斷為禽腺病毒4型感染。

圖1 禽腺病毒4型Hexon基因的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

四、防治措施

1．由于雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)和雞傳染性貧血因子(CAA)可能增強(qiáng)腺病毒的致病性，首先應(yīng)控制或清除這兩種病毒。腺病毒的抵抗力較強(qiáng)，此種病毒極易經(jīng)雞胚傳至另一雞群，因此防制工作必須從原種禽場做起。SPF雞群的經(jīng)驗證明水平傳播也是一個重要問題，要保持商品雞群沒有腺病毒感染是特別困難的。這就增加了其防控難度。因此，包涵體肝炎的預(yù)防關(guān)鍵還要從飼養(yǎng)管理和生物安全方面考慮。加強(qiáng)平時的飼養(yǎng)管理，盡量減少應(yīng)激，避免從發(fā)病雞場引進(jìn)雛雞等都能起到一定作用。保證雛雞具有較高的 IBD母源抗體水平，防止發(fā)生傳染性法氏囊病，對包涵體肝炎的預(yù)防也很重要。

2．Ⅰ群禽腺病毒具有群特異性抗原，而且有證據(jù)表明引起雞包涵體肝炎的病毒中以某些特定血清型為主，這些都提示研制疫苗存在很大的可行性。有些養(yǎng)殖場以發(fā)病雞的組織經(jīng)滅活后制成組織滅活苗，對種雞進(jìn)行免疫，可使后代獲得較高的母源抗體而得到保護(hù)。疑似感染 IBH 的雛雞，要盡快飼喂VC 和VK 以及對肝臟無損害的廣譜抗生素，可使損失降低到最低程度。由于IBH 主要侵害肝臟，因此切忌用對肝臟有損傷的藥物，否則將加大死亡率。

（略）