陳 超 任 俊 朱建華 賈 珉，#

結直腸癌組織乳脂肪球表皮生長因子8蛋白表達與臨床病理特征和患者生存率的關系*

陳 超1任 俊2朱建華1賈 珉1，#

目的：探討乳脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)蛋白在結直腸癌(CRC)組織中的表達及其與臨床病理特征和患者生存率的關系。方法：留取手術切除CRC癌組織(CRC組)及相應癌旁組織(Control組)各88例，應用免疫組織化學法(SP法)檢測癌組織及癌旁組織MFG-E8蛋白表達，統計分析各組MFG-E8蛋白高表達率的差異，以及CRC組中MFG-E8低表達組、陽性表達組和強陽性表達組患者臨床病理因素和總生存率的差異。結果：CRC組癌組織MFG-E8蛋白高陽性表達率為73.86%(65/88)，顯著高于Control組28.41%(25/88)(P<0.01)。MFG-E8蛋白表達強度僅與淋巴結轉移有關(P<0.05)，而與患者年齡、臨床T和M分類、臨床分期及腫瘤分型無顯著相關(P>0.05)；MFG-E8陰性表達組及強陽性表達組患者總生存率均顯著低于陽性表達組(P<0.01)。結論：MFG-E8在CRC患者癌組織中陰性表達及強陽性表達均可促進CRC的淋巴結轉移，并提示預后較差。

結直腸癌；乳脂肪球表皮生長因子8；預后

結直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在國內呈逐年上升趨勢，嚴重影響著國民健康[1]。腫瘤細胞侵襲轉移難以治療。其侵襲轉移過程包含癌細胞的黏附、運動、基質降解和新生血管形成等環(huán)節(jié)。乳脂肪球表皮生長因子8(MFG-E8)是一種存在于多種物種體內的親脂性多效糖蛋白，可促進吞噬性清除凋亡細胞，維持正常組織穩(wěn)態(tài)[2]。目前，其與腸道癌癥方面的作用，如與CRC的關系尚不清楚。本文應用免疫組織化學法測定MFG-E8在CRC組織的表達情況，分析其與CRC臨床病理特征及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源及分組

收集2006-07-2009-05武漢市第一醫(yī)院病理確診的結直腸癌手術切除癌組織(CRC組)及癌旁組織(Control組)各88例。CRC患者中男47例，女41例。年齡24-90歲，中位年齡71歲。按1992版Dukes分期標準進行臨床分期：1 期8例，2期48例，3期30例，4期2例。要求術前未做放化療，術后行以氟尿嘧啶為主的方案化療并隨訪，隨訪截止日期為2014-08 CRC組依據癌組織中MIG-E8強度分為3個亞組，即陰性表達組、弱陽性+陽性表達組(陽性表達組)和強陽性表達組。

1.2 主要試劑

鼠抗人MFG-E8多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司(SC-8029)，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)試劑盒購自上海長島公司(B1012)，抗體稀釋液、 DAB顯色劑購自美國DAKO公司(GT100920、002948)。

1.3 SP染色及結果判讀

1.3.1 SP染色：4μm 厚石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶10min，微波爐加熱修復抗原3min，加一抗(MFG-E8 1∶50 稀釋)4℃冰箱過夜，加二抗37℃ 10min，DAB 顯色，蘇木精復染，脫水透明封片，以抗體稀釋液代替一抗做陰性對照,以已知陽性的胃癌組織免疫SP染色切片作為陽性對照。

1.3.2 結果判定：細胞漿中出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達細胞。染色后，10×40高倍視野下，隨機選取4個視野，先行三方面染色情況評分[3]：(1)著色：無染色，0 分；淡黃色，1 分；棕黃色，2 分；棕褐色，3 分。(2)染色陽性細胞百分比：無陽性細胞，0 分；<10%，1 分；10%-50%，2 分；50%-90%，3 分；≥90%，4 分。(3)染色方式評分：無染色，0 分；散在染色，1 分；局灶染色，2 分；彌漫染色，3分。再按以上3項評分的乘積判斷陽性表達強度?！?分為陰性(-)表達；5-8 分為弱陽性(±)表達，9-18 分為陽性(+)表達，19-36 分為強陽性(+++)表達，見圖1。以上結果均至少由兩位病理科醫(yī)生以盲法觀察確定。

圖1 CRC組和Control組MFG-E8蛋白各種表達強度(SP，×400)

1.4 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件。計數資料用百分率(%)表示，組間比較用χ2檢驗，相關性分析用Spearman，生存率分析應用Kaplan-meier法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC組與Control組MFG-E8蛋白表達強度比較

統計分析以陰性表達+弱陽性表達為低表達，陽性表達+強陽性表達為高表達。CRC組MFG-E8高表達率明顯高于Control組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 MFG-E8在CRC組織及癌旁組織中的表達情況(n，%)

注：與Control組比較，1)P<0.01

2.2 CRC組MFG-E8蛋白表達強度與臨床病理因素分析

從表2可見，MFG-E8蛋白表達強度僅與淋巴結轉移(N分類)相關(P<0.05)，MFG-E8蛋白表達強度與其它臨床病理特征：年齡、T分類、M分類、臨床分類、腫瘤分型均無關(P>0.05)。

表2 MFG-E8蛋白表達強度與臨床病理特征的關系

2.3 CRC組MFG-E8蛋白表達強度與患者生存率分析

CRC組不同MFG-E8蛋白表達強度患者總生存率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。陰性表達組和強陽性表達組患者總生存率均明顯短于陽性表達組患者(P<0.01)，而陰性表達組與強陽性表達組患者總生存率差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 CSC患者癌組織MFG-E8蛋白不同表達強度者生存曲線

3 討論

MFG-E8蛋白于1990年在哺乳動物的乳腺中被首先發(fā)現[4]，是一種分泌型的多效糖蛋白, 分子量約為53kDa，其基因位于人類15號染色體。有研究表明，MFG-E8在多種腫瘤細胞上表達，如惡性黑色素瘤[5]、甲狀腺癌[6]、乳腺癌[7,8]等，并對預后有一定影響。但其在腸道腫瘤如CRC的表達及與病理因素和預后的關系少有報道。

本研究中CRC患者癌組織MFG-E8蛋白高表達率為73.86%，顯著高于癌旁組織28.41%，提示高表達的MFG-E8蛋白可能參與CRC的發(fā)生和發(fā)展機制。同時, MFG-E8蛋白強陽性表達僅與病理因素中淋巴結轉移顯著相關，而與年齡、T分期、臨床分期、腫瘤分型之間無明顯關系，表明MFG-E8蛋白在結腸癌組織中的高表達可以促進腫瘤淋巴結轉移，(M分類由于M1數量太少，而無法獲得有意義的統計學數據)，而且MFG-E8蛋白強陽性表達組患者總生存率低于陽性表達組，這與已有文獻報道[6,8]對其它腫瘤研究的結果相近。

腫瘤細胞轉移不僅與腫瘤自身特性有關，還與腫瘤所處微環(huán)境穩(wěn)定性密不可分。合適強度的MFG-E8表達，在吞噬細胞和腫瘤細胞之間起橋連作用，MFG-E8蛋白既與腫瘤細胞外翻的磷脂酰絲氨酸結合，同時與吞噬細胞的αvβ3/αvβ5整合素受體結合，導致整合素構象變化，通過CrkⅡ-DOCK180-Rac1復合物活化Rac1,使吞噬細胞的細胞骨架發(fā)生重組，促進吞噬細胞吞噬腫瘤細胞[10,11]，維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，減少或阻止腫瘤細胞侵襲轉移。但MFG-E8蛋白過度表達可能不利于兩細胞間的橋連，引起吞噬障礙，阻止機體對腫瘤細胞的吞噬清除及炎癥反應，增加腫瘤細胞的侵襲力[12]。因而出現MFG-E8表達增強時，機體對腫瘤細胞的吞噬清除發(fā)生障礙，加快腫瘤的侵襲和轉移，導致患者預后較差。

本文結果還表明CRC患者MFG-E8陰性表達組與患者臨床病理特征和總生存率的關系與強陽性組表現相同，即MFG-E8陰性表達僅與CRC患者淋巴結轉移有關，且總生存率顯著低于陽性表達組。 推測其原因可能由于MFG-E8陰性表達時，沒有足夠數量的MFG-E8作為αvβ3和αvβ5整合子的配體，來介導黏著蛋白的聚集以及細胞內的信號級聯反應起始過程[13]，導致在吞噬細胞和腫瘤細胞之間建立橋連作用不足，降低了機體對腫瘤細胞的清除能力，導致CRC患者預后較差。

綜上所述，檢測CRC患者癌組織中MFG-E8蛋白的表達水平，可預測患者預后，并為個體化治療提供重要的理論依據。

本文第一作者簡介：

陳 超(1984-)，男，漢族，碩士，主要從事腫瘤免疫學診斷工作

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2 Ensslin MA, Shur BD. The EGF repeat and discoidin domain protein, SED1/MFG-E8, is required for mammary gland branching morphogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007，104(8):2 715-2 720.

3 李杰寶，張家衡，乳脂肪球因子8在乳腺浸潤性導管癌中的表達及臨床意義[J].中華實驗外科雜志，2015，32(7)：1 666-1 668.

4 Stubbs JD, Lekutis C, Singer KL, et al. cDNA cloning of a mouse mammary epithelial cell surface protein reveals the existence of epidermal growth factor-like domains linked to factor VIII-like sequences[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1990，87(21):8 417-8 421.

5 Oba J, Moroi Y, Nakahara T, et al. Expression of milk fat globule epidermal growth factor-VIII may be an indicator of poor prognosis in malignant melanoma[J]. Br J Dermatol，2011，165(3): 506-512.

6 Huang Y, Prasad M, Lemon WJ, et al. Gene expression in papillary thyroid carcinoma reveals highly consistent profiles[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(26):15 044-15 049.

7 馮先華，李金麗，崔天盆. 血清MFG-E8與CA153、CEA水平對乳腺癌診斷價值的探討[J].中國實驗診斷雜志，2012，16(4)：618-620.

8 Tibaldi L, Leyman S. New blocking antibodies impede adhesion, migration and survival of ovarian cancer cells, highlighting MFGE8 as a potential therapeutic target of human ovarian carcinoma[J]. PLoS One, 2013，8(8):e72 708.

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12 Lauber K, Keppeler H, Munoz LE,et al. Milkfat globule-EGF factor 8 mediates the enhancement of apoptotic cellclearance by glucocorticoids[J].Cell Death Differ, 2013，20(9):1 230-1 240.

13 Motegi S, Leitner WW, Lu M, et al. Pericyte-derived MFG-E8 regulates pathologic angiogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011,31(9):2 024-2 034.

·信 息 欄·

CNKI研制成功《醫(yī)院科研成果統計分析與評價數據庫》，日前通過專家鑒定

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Study on the Correlation between MFG-E8 Protein Expression with Clinicopathological Features and Survival in Colorectal Cancer

CHEN Chao1, REN Jun2, ZHU Jian-hua1, JIA Min1,#

1Department of Clinical Laboratory;2Department of Surgery,Wuhan First Hospital, Wuhan 430030,China;#

Objective: To explore the expression of milk fat globule EGF factor Ⅷ (MFG-E8) in colorectal cancer (CRC) tissues and the correlation with clinicopathological features and survival in CRC patients.Method: 88 CRC-related cases with follow-up information were made into tissue microarrays according to the paired principle of cancer tissues and the adjacent tissues. The expression of MFG-E8 was detected with immunohistochemical analysis and SPSS software was finally utilized to analyze the relationships between experimental data and clinical indicatives.Results:MFG-E8 expression increased significantly in colorectal cancer compared with normal mucosa tissues(control group) (P<0.01). In addition, both strong positive and negative expression of MFG-E8 were correlated with lymph node metastasis (P<0.05). Furthermore, patients with strong positive or negative expression of MFG-E8 showed shortened overall survivals (P<0.01),compared with patients with weakly positive and positive expression of MFG-E8.Conclusion: Both strong positive expression and negative expression of MFG-E8 might be involved in the progression of CRC and they were associated with patients' poor overall survivals.

Colorectal cancer;Milk fat globule-epidermal growth factor 8; Prognosis

武漢市衛(wèi)計委課題(武衛(wèi)2007-43號)

武漢市第一醫(yī)院，武漢 43000;1檢驗科；2外科；#

,E-mail:Pollyann@126.com

本文2017-04-03收到，2017-07-16修回

R735.3

A

1005-1740(2017)03-0038-05