張玉紅,馬玲，白荷

(1.鞏義瑞康醫(yī)院，河南 鄭州 451200;2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450003; 3.河南漢鈞文化傳播有限公司，河南 鄭州 450009)

針藥結合對腦缺血再灌注損傷大鼠MPO、ICAM-1和IL-lβ的影響

張玉紅1,馬玲2，白荷3

(1.鞏義瑞康醫(yī)院，河南 鄭州 451200;2.鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院，河南 鄭州 450003; 3.河南漢鈞文化傳播有限公司，河南 鄭州 450009)

目的：研究五神針(針刺百會、四神聰穴)結合不同劑量的當歸四逆湯加減對大鼠腦缺血再灌注后腦組織髓過氧化物酶(MPO)活性、黏附分子-1(ICAM-1)及白細胞介素-1β(IL-1β)表達的影響。方法：將108只SD大鼠隨機分假手術組、模型組、尼莫地平片組、針藥低劑量組、針藥中劑量組和針藥高劑量組，每組再分為3個亞組，每亞組6只。除假手術組外均建立腦缺血再灌注模型，尼莫地平片組采用尼莫地平片干預，針藥低劑量組、針藥中劑量和針藥高劑量組分別采用五神針結合低劑量、中劑量和高劑量當歸四逆湯加減進行干預，模型組和假手術組給予等量的生理鹽水。采用運動功能檢測法評估各組大鼠的運動能力；TTC染色法檢測各組大鼠腦梗死體積;采用紫外分光光度比色法檢測MPO;采用免疫組化法檢測腦組織中ICAM-1和IL-1β的表達。結果：尼莫地平片組和針藥高劑量組第3 d、5 d與模型組、針藥低劑量組和針藥中劑量組比較，行為異常均有明顯改善(P均<0.05)，腦梗死體積明顯減少(P均<0.05)，MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達有顯著的改善(P均<0.05)，針藥高劑量組與尼莫地平片組比較無顯著性差異(P>0.05)。 結論：五神針結合高劑量當歸四逆湯加減能夠明顯縮小腦缺血再灌注后的腦梗死體積，減輕運動功能缺損，有效改善MPO活性、ICAM-1和IL-lβ蛋白的表達，對缺血后的腦組織具有保護作用。

五神針；當歸四逆湯加減；腦缺血再灌注；髓過氧化物酶；黏附分子-1；白細胞介素-1β

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury)是腦的血流中斷，造成缺血區(qū)域缺血缺氧甚至是壞死的病理改變，當再灌注時不但不能恢復腦神經功能反而會加重腦的損傷，即所謂的腦缺血再灌注損傷[1]。目前西醫(yī)采用抗腦缺血再灌注損傷藥物進行治療[2]，療效雖好，但副作用較大；中醫(yī)藥對腦缺血再灌注方面的治療具有獨特的優(yōu)勢，能夠多途徑、多靶點、多向調節(jié)的作用于腦損傷部位，安全有效[3-4]。筆者多年來一直致力于針刺結合中藥湯劑治療腦缺血的臨床研究，取得了較好的療效[5-6]。為探索其在治療腦缺血再灌注疾病的內在機理，筆者研究五神針(針刺百會、四神聰穴)結合不同劑量當歸四逆湯加減對大鼠腦缺血再灌注后MPO活性、ICAM-1及IL-1β表達的影響，為臨床應用提供實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級SD大鼠90只，雌雄各半，體質量(240±18)g，由河南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK(豫)2010002。按照隨機數字表法隨機分為6組：假手術組、模型組、尼莫地平片組、針藥低劑量組、針藥中低劑量組和針藥高劑量組，每組18只；每組再分為3個亞組，每亞組6只。

1.2 試驗儀器和試劑

JD-PT型動物實驗跑臺(上海繼德教學實驗器械廠)；XJ80-2型醫(yī)用離心機(金壇市恒豐儀器廠)；1141002型號凝膠拍照儀(美國Wealtec公司)；免疫組化用試劑盒(北京中山生物技術有限公司)；尼龍線栓(線頭直徑(0.32±0.02)mm，北京沙東生物技術公司)；QR-3268型石蠟切片機(美國AO型轉輪式切片機)；華佗牌針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格為0.18 mm×25 mm，批號GB2024-1994)；尼莫地平片(山東明仁福瑞達制藥股份有限公司，批號H37022797)；3%戊巴比妥(湖北武漢，批號302-17-0)；所有中藥飲片均來自河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院。

1.3 模型制備

造模前各組大鼠連續(xù)灌胃15 d，禁食1 d。模型組、尼莫地平片組、針藥低劑量組、針藥中劑量組、針藥高劑量組的大鼠給予3%戊巴比妥(38 mg/kg)腹腔注射麻醉，然后仰臥固定，常規(guī)備皮消毒，頸中切口，從肌群間向深部分離暴露其頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)，分別近心端掛線結扎，微動脈夾暫時夾閉近心端距頸總動脈分叉處5 mm處，眼科剪45°在CCA遠端上剪一小口，將制備好的線栓沿切口插入，將預先置于頸內動脈上的掛線適度系住防止出血，后移去微動脈夾，用眼科鑷緩慢推進線栓，使線栓頭端通過CCA分叉進入ICA時將栓線弧度調整為右下方，遇阻力停止，即達大腦中動脈起始部，完全阻斷其血流，插入深度自CCA分叉處16～18 mm，將先前的掛線扎緊固定栓線，然后縫合肌肉皮膚，栓線尾端外露部分標記，缺血達到2 h后小心外拉栓線約1 cm使其球端回至CCA內，即形成再灌注，在缺血期間及再灌注后保持正常體溫，間隔抽吸氣道分泌物使呼吸道保持通暢。假手術組大鼠經同樣麻醉后只分離血管，結扎。

1.4 干預方法

1.4.1 尼莫地平片組

劑量為0.126 g/kg，使用前加蒸餾水按1 g/L配制成混懸液,每日3次。

1.4.2 針藥組

在造模后24 h，同時給予五神針結合當歸四逆湯加減進行治療。針刺穴位定位方法依據《實驗針灸學》[7]，百會，四神聰(百會穴前、后、左、右各開2 mm，共4個穴位)。百會針刺手法：采用平補平瀉手法，捻轉持續(xù)1 min，留針20 min。四神聰針刺手法：采用平刺手法，得氣后用捻轉補法，留針20 min。每日1次，6天為1個療程，療程間休息1日，連續(xù)治療4個療程。在針刺同時給予當歸四逆湯加減進行治療。組方:當歸20 g，熟地黃15 g，川芎10 g，桂枝10 g，牛膝10 g，赤芍10 g，細辛3 g，大棗 6枚，炙甘草6 g。水煎煮，給藥劑量為低劑量組10.96 g/kg，中劑量組21.92 g/kg，32.88 g/kg，早中晚各1次。

1.4.3 模型組和假手術組

給予等量的生理鹽水。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 運動功能檢測[8]

分別于造模后1 d、3 d、5 d進行網評試驗,檢測大鼠運動功能。大鼠可持續(xù)抓住網屏5 s，未滑落，計0分；大鼠可持續(xù)抓住網屏，有滑落但5 s內未掉下，計1分；大鼠抓住網屏5 s內掉下，計2分；網屏轉動過程中大鼠掉下，計3分。

1.5.2 腦梗死范圍的測定

運動功能檢測后，采用TTC染色法進行腦梗死范圍測定?？焖贁囝^取腦，去除小腦及低位腦干，余下部分置于-20℃冰箱內冷凍15 min，從前額極向后行冠狀位切片后，浸入2%TTC磷酸鹽緩沖液中，水浴箱中染色30 min。將染色后的腦組織放入多聚甲醛中固定24 h，數碼相機拍照后，計算腦梗死體積。腦組織非缺血部分呈現紅色，缺血部分呈現白色。應用image J2X圖片分析軟件計算各切片組織的腦梗死面積，然后根據公式計算出腦梗死的體積，計算公式為：v=(A1+…+An)t/2，t表示切片厚度，A表示梗死面積，最后算出腦梗死灶體積百分比。

1.5.3 腦組織MPO活性的測定

將腦組織從-70℃冰箱內取出、解凍、稱重，以試劑盒所提供的試劑配制成勻漿介質；按重量體積比為1∶19加勻漿介質制備成5%的組織勻漿；其余操作按試劑盒步驟進行；取出后在紫色分光光度計460 nm處，測定吸光度值。根據公式計算各腦組織的MPO值：MPO(單位/克濕片)=(測定管OD值-對照管OD值)/11.3×取樣量(g)。其中11.3為斜率的倒數，取樣量為所含組織濕片的量。

1.5.4 免疫組化法檢測腦組織ICAM-1和IL-lβ蛋白表達水平

從4%多聚甲醛中取出腦組織，蒸餾水浸泡2 h，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)脫蠟等同HE染色。石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，100%酒精Ⅰ10 min，100%酒精Ⅱ10 min，95%酒精Ⅰ5 min，95%酒精Ⅱ5 min，80%酒精5 min，蒸餾水沖洗3 min×3次。3% H2O2孵育5～10 min，以滅活內源性過氧化物酶。 蒸餾水水洗3 min×3次。抗原修復：將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(pH值6.0)，微波爐中加熱至沸騰5～10 min后，冷卻至室溫。再重復進行一次。 PBS緩沖液(pH值7.2)沖洗2 min×3次。擦干周圍的PBS液，不洗，滴加5%BSA(正常山羊血清)，室溫封閉20 min，滴加1∶100比例稀釋的兔抗大鼠IL-1β，然后放入4℃冰箱內過夜。從冰箱內取出，PBS緩沖液沖洗2 min×3次。 擦干周圍的PBS液后，滴加山羊抗兔二抗IgG，置于室溫(37℃)20 min。PBS緩沖液沖洗2 min×3次。加試劑SABC:滴加稀釋的鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合素(SABC)，室溫孵育20 min。PBS緩沖液沖洗5 min×4次。加DAB顯色劑：使用DAB顯色試劑盒。在1 ml蒸餾水中加試劑盒中的A、B各1滴，搖勻后加至切片,室溫中顯色。蒸餾水沖洗顯色的片子5 min，浸于蘇木精中復染。蒸餾水沖洗復染后的片子后，將載玻片放入70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精及二甲苯Ⅰ、Ⅱ中，每個試劑放2 min。浸泡在二甲苯中，搬通風柜中。光學顯微鏡下，以細胞漿內出現的棕黃色顆粒者為陽性細胞。光鏡下，每張切片隨機觀察5個不同的視野，計算平均陽性細胞率。

平均陽性細胞率(%)=陽性細胞數/計數細胞總數×100%

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 運動功能評分情況比較

假手術組未出現明顯的運動功能異常；模型組、尼莫地平片組、針藥低劑量組、針藥中劑量組和針藥高組大鼠第1 d均出現嚴重的運動功能缺損的表現；尼莫地平片組和針藥高劑量組第3 d、5 d與模型組比較，行為異常均有明顯的改善(P<0.01)，與針藥低劑量組和針藥中劑量組比較，行為異常均有明顯的改善(P<0.05)，針藥高劑量組與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結果見表1。

表1 各組運動功能評分比較

注：與假手術組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05；與尼莫地平片同期比較，▲P>0.05。

2.2 腦梗死體積情況比較

假手術組未出現明顯體積的腦梗死；模型組、尼莫地平片組、針藥低劑量組、針藥中劑量組和針藥高劑量組大鼠第1 d均出現大面積的腦梗死的表現；尼莫地平片組和針藥高劑量組第3 d、5 d與模型組、針藥低劑量組和針藥中劑量組比較，腦梗死體積均有明顯的減少(P<0.01)，針藥高劑量組與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結果見表2。

表2 各組腦梗死體積比較

注：與假手術組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05；與尼莫地平片同期比較，▲P>0.05。

2.3 MPO活性、ICAM-1和IL-lβ的蛋白表達情況比較

假手術組MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白的表達未出現明顯的變化；模型組、尼莫地平片組、針藥低劑量組、針藥中劑量組和針藥高劑量組大鼠第1 d均出現MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達的明顯異常；尼莫地平片組和針藥高劑量組第3 d、5 d與模型組、針藥低劑量組和針藥中劑量組比較，MPO活性、ICAM-1蛋白和IL-lβ蛋白表達均有明顯的改善(P<0.01)，針藥高劑量組與尼莫地平片組比較無顯著差異(P>0.05)。結果見表3，免疫組化圖見圖1、圖2。

表3 各組MPO、ICAM-1和IL-lβ比較

注：與假手術組同期比較，*P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05；與尼莫地平片同期比較，▲P>0.05。

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注5 d IL-1β蛋白表達比較(免疫組化，×40)

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注5 d ICAM-1蛋白表達比較(免疫組化，×40)

3 討論

腦血管病歸屬于中醫(yī)學“中風”的范疇，包括缺血性中風和出血性中風[9]。中醫(yī)學認為風、火、痰、瘀阻于腦絡而出現半身不遂、口眼歪斜、半身麻木等臨床癥狀[10]。心、腦、腎、肝缺血再灌注損傷、動脈粥樣硬化、心絞痛、心梗都可歸屬于血行不暢形成的病癥[11-12]。各種原因導致的某一器官缺血、缺氧，血流障礙及血流異常而出現的水腫、炎性改變、組織變性等一系列病理改變，都可以概括為血瘀證，應用活血化瘀藥物可活其血脈、化其瘀滯[13]。治療機制主要體現在減輕細胞內鈣的超載、抑制炎癥反應，減少炎癥因子的釋放及清除氧自由基等。此外活血化瘀的藥物還具有抑制炎癥反應、調節(jié)免疫功能、抑菌和抗病毒的作用[14]。

西醫(yī)認為腦缺血再灌注是一個復雜的多因素的通過多種途徑導致?lián)p傷的病理過程，腦缺血后會出現一個級聯(lián)反應[15]，如興奮性氨基酸的釋放、酸中毒、過度炎癥反應、細胞內離子失衡、細胞內鈣超載、自由基的損傷和凋亡細胞基因的激活等，這些因素往往都不是單獨存在的，而是相互關聯(lián)相互重疊，共同造成腦缺血再灌注損傷[16]。

IL-1β對腦神經細胞產生的毒性效應與中醫(yī)中風毒邪學說有著相似之處。毒邪的生物學基礎就是腦缺血再灌注后產生的有害物質，其中炎癥因子的過量表達就屬于其中一種[17]。炎癥因子介導了炎癥反應和一系列相關的氧化自由基、興奮性氨基酸的神經毒和酸中毒等反應，是毒邪損傷腦組織的具體表現形式，這些毒性物質共同作用造成神經細胞的壞死和凋亡，導致腦組織的損害[18]。ICAM-1表達是啟動白細胞與血管內皮細胞黏附的決定因素。而黏附分子受到炎性細胞因子和炎性介質的刺激過度表達是腦缺血再灌注損傷的始動因素。正常情況下ICAM-1處于低表達或不表達，在刺激因素、動脈硬化、糖尿病、高血壓、缺氧及腦缺血再灌注等因素的誘導下，ICAM-1表達明顯上調[19]。在腦缺血再灌注時，內皮細胞受損及炎性介質的釋放，使各種黏附分子表達明顯增加。MPO的活性降低，可減輕對腦組織的損害，腦梗面積縮小以及神經功能不同程度的好轉，這些都足以證明針藥結合針對炎癥反應對腦組織的毒性效應有很好的解毒治療作用。

針刺對腦血管疾病的治療具有獨特的優(yōu)勢，針刺百會能夠調節(jié)氣血運行，增加腦組織供氧量，改善人和動物的智力功能，保護神經細胞，修復受損神經元[20-21]。四神聰最早源至《銀海精微》，針刺四神聰可以益氣活血、補腦益智，改善血流變、增加腦組織供氧量，從而促進腦部血液循環(huán)。針刺上述穴位具有活血化瘀、益智健腦的功效，可行氣活血，擴張腦血管，增加腦組織供氧量，促進神經組織修復，而神經組織功能的恢復和腦部的血液循環(huán)密切相關。當歸補血湯出自《傷寒論》，原方由熟地黃，當歸，桂枝，白芍，細辛，通草，大棗和炙甘草組成，具有溫經散寒，養(yǎng)血通脈的功效。以赤芍易白芍祛瘀而不傷正，活血而不破血，藥雖平和，療效尚好;加入川芎辛溫香燥，可活血行氣，走而不守，能行散，上行可引藥人巔頂，直達上部氣血；活血應養(yǎng)血和血，忌峻猛克伐，以熟地黃替代通草，補血滋潤，益精填髓。諸藥共用具有益氣活血、健腦益智的功效，能補益氣血，促進腦部氣血運行，增加腦組織供氧量，修復受損腦組織。

五神針配合高劑量當歸補血湯加減可益氣活血，改善腦組織血液高凝的狀態(tài)，擴張腦血管，促進腦組織血液循環(huán)，促進腦缺血再灌注， 修復腦組織神經元， 腦髓充盛則腦竅得聰，增強患者的認知和記憶能力，有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠MOP、ICAM-1和IL-1β，具有良好的安全性和穩(wěn)定性，與尼莫地平具有相似的治療作用。

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河南省中醫(yī)藥科學研究專項課題(No.2014ZY02060)

張玉紅(1968-)，女，副主任中醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥治療神經系統(tǒng)疾病研究工作。

2017-02-20

修回日期：2017-03-01

R285.5

：A

：1002-2406(2017)05-0037-05