王鈺婷++李瑞雪++孫帆++王偉++汪泰初

摘 要 核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）是被子植物分子系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記。對(duì)收集的12份安徽地方特色桑種質(zhì)資源提取總DNA，用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行測(cè)序分析；根據(jù)魯?；蛐蛄校_定ITS序列范圍，并進(jìn)行序列比對(duì)；通過(guò)分析序列長(zhǎng)度、G+C含量、變異位點(diǎn)及遺傳分歧，探討了安徽桑樹種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系，為更深入地研究桑屬植物間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供重要的參考資料。

關(guān)鍵詞 桑樹種質(zhì)資源 ；ITS序列 ；進(jìn)化分析

中圖分類號(hào) Q341

An Analysis on Genetic Relationship of Mulberry Germplasm Resources

Collected in Anhui Province Based on ITS Marker

WANG Yuting LI Ruixue SUN Fan WANG Wei WANG Taichu

（Sericultural Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei，Anhui 230061）

Abstract Ribosome transcribed spacer（ITS）is the most widely used nuclear DNA sequence in molecular systems. The sequencing analysis was carried out by using the total DNA extraction and PCR amplification method. According to the sequence of Morus multicaulis gene，the ITS sequence range was determined and sequence alignment was performed. By analyzing the sequence length，G + C content and mutation loci and genetic divergence，the phylogenetic relationship between the collected mulberry germplasm in Anhui Province was discussed， which provided the basic reference for the further study of phylogenetic evolution between mulberry plants.

Key words Mulberry germplasm resources ；ITS marker ；phylogeny

桑屬（Morus）為?？频哪Ｊ綄伲蒐inne（1753）建立。桑樹自然雜交普遍，形態(tài)學(xué)上種間界限相對(duì)模糊，屬內(nèi)種數(shù)、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系歷來(lái)存在較大爭(zhēng)議，因而在分子系統(tǒng)學(xué)中分類十分困難。從20世紀(jì)90 年代起，利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)圍繞桑屬植物的親緣關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化等開展了一系列的研究[1-2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（intergenic transcribed spacer，ITS）序列是核基因組中進(jìn)化較快的DNA片段，遺傳信息位點(diǎn)十分豐富。

核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）位于核糖體基因中18S、26S之間，是被5.8S分隔開的2段DNA片段[3]，分別為ITS1和ITS2（圖1）。在被子植物基因組中，ITS序列是高度重復(fù)的串聯(lián)序列，由于沒有加入成熟核糖體，選擇壓力小，進(jìn)化速度快，而其相對(duì)長(zhǎng)度又具有保守性，適宜于對(duì)低分類群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[4-6]，能夠滿足探討屬內(nèi)種間和較近的族間、屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的要求[7-8]，已經(jīng)逐漸成為被子植物親緣關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化分析的重要工具[9]。向仲懷等[10]于1995年應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記，最早開展對(duì)桑屬分子系統(tǒng)學(xué)的研究，獲得了桑屬9個(gè)種的DNA多態(tài)性指紋圖譜，得到了系統(tǒng)樹狀圖。馮麗春等[11]也通過(guò)RAPD的方法，分析了桑屬12個(gè)種、2個(gè)變種的遺傳多樣性。楊光偉等[12]采用顯性分子標(biāo)記RAPD技術(shù)，對(duì)桑屬植物親緣關(guān)系的分析結(jié)果認(rèn)為川桑是最原始的。Zhao等[13]在對(duì)桑屬進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究時(shí)將RAPD標(biāo)記和微衛(wèi)星DNA結(jié)合，分析結(jié)果表明蒙桑（M.mongolica）最原始。汪偉等[14]測(cè)定了亮氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因內(nèi)含子序列（trnL），探討了桑屬的遺傳距離，結(jié)果認(rèn)為蒙桑是最原始的類群。史全良等[15]首次對(duì)蒙桑的ITS序列進(jìn)行了報(bào)道。趙衛(wèi)國(guó)等[16]收集了桑屬9個(gè)種和3個(gè)變種，一共13份桑資源材料，將構(gòu)樹作為外類群，對(duì)ITS序列進(jìn)行了測(cè)定，系統(tǒng)分析的結(jié)果認(rèn)為，桑屬為單系；蒙桑親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，在系統(tǒng)進(jìn)化樹中首先被分出，鬼桑和雞桑聚為一枝，白桑進(jìn)化程度最高。

本研究收集了12種安徽特色桑品種資源（表1），對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的ITS序列進(jìn)行了遺傳變異以及系統(tǒng)進(jìn)化分析，期望能從分子水平上更為準(zhǔn)確地獲知安徽省分布桑種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系，為進(jìn)一步探討桑屬植物的進(jìn)化、起源提供基礎(chǔ)的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所桑苗選育中心。所有供試材料經(jīng)專家鑒定后，采摘上部枝條的嫩葉，用硅膠干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室用于提取基因組DNA。材料名稱及來(lái)源見表1。

1.2 方法

1.2.1 桑葉DNA的提取和檢測(cè)

取約0.2 g新鮮葉片，于液氮中研成粉；將上述粉末轉(zhuǎn)入預(yù)冷的2 mL離心管中，立即加入1 mL CTAB提取緩沖液，于65 ℃保溫30 min，其間不時(shí)搖動(dòng)；加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，以12 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，顛倒離心管混勻，以12 000 r/min離心10 min；將上層液相轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中，加入1倍體積的異丙醇，混勻，室溫下放置30 min；以4 000 r/min離心10 min，去上清液，用70 %乙醇漂洗，沉淀吹干，風(fēng)干后加入40 μL的TE緩沖液溶解DNA；用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用Tanon UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

根據(jù)GenBank提供的序列設(shè)計(jì)引物序列如下：

ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積50 μL，反應(yīng)體系為：DNA模板（100 ng/μL）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，10×Easy Taq Buffer 5 μL，Easy Taq DNA polymerase 1 μL，ddH2O 35 μL。

擴(kuò)增程序： 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

用1.2 %瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接轉(zhuǎn)化，送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果用Sequencher4.1.4軟件拼接，用Clustalx軟件進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)已公布的魯桑（ AM042003）18S rRNA基因3′端、26S rRNA基因5′端堿基序列，確定本試驗(yàn)各供試材料的ITS序列范圍，除去非序列部分；用DNAstar軟件分析序列的長(zhǎng)度、G+C含量及變異位點(diǎn)；用PAUPVersion4.0b10軟件中的MP法分析不同桑樹種質(zhì)間的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 總基因組提取結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，12份供試桑樣品所得條帶整齊單一，無(wú)拖尾現(xiàn)象， DNA提取質(zhì)量較好（圖2），將其回收后存放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，12份供試桑樣品的目的條帶單一（圖3），證明引物特異性良好。

2.3 12份安徽地方桑品種的ITS序列

12份供試桑種質(zhì)資源ITS序列長(zhǎng)度、G+C含量見表2。ITS序列的604個(gè)位點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)522個(gè)固定位點(diǎn)，82個(gè)變異位點(diǎn)，80個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)為7。其中5.8 S高度保守，在檢測(cè)的樣品中未發(fā)現(xiàn)變異；ITS1序列區(qū)間變異較多，ITS2序列區(qū)間存在少量變異，主要核苷酸多樣性Pi值為0.014 22，Theta值為0.039 23，數(shù)值都很低，認(rèn)為桑屬ITS序列沒有出現(xiàn)假基因，這與被子植物的ITS致同進(jìn)化規(guī)律是一致的。根據(jù)Pi值的分布，變異主要發(fā)生在ITS1，其次是ITS2，5.8 S的變異很低。

2.4 桑種質(zhì)資源的親緣關(guān)系

利用DNASTAR分析軟件對(duì)供試桑材料的ITS序列進(jìn)行了同源性分析，發(fā)現(xiàn)桑屬植物內(nèi)大部分材料間的相似系數(shù)在90 %以上，親緣關(guān)系較近；以構(gòu)樹作為外類群，用PAUP Version 4.0b10軟件，采用最大簡(jiǎn)約法（MP法）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。系統(tǒng)進(jìn)化樹先分出構(gòu)樹，把其余供試桑種質(zhì)資源材料分為2大枝，其中分支1先將華明桑分出，7707、皖桑1號(hào)、皖桑優(yōu)1號(hào)聚為一支；分支2先將長(zhǎng)果桑、紅星5號(hào)單獨(dú)分出，而金寨九龍桑、孿枝桑、皖花桑、皖果桑、皖雜2號(hào)、雜品1號(hào)聚為一支，說(shuō)明它們有較近的親緣關(guān)系。

3 討論

分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的建樹結(jié)果表明，?？浦械臉?gòu)屬與桑屬分別單獨(dú)聚為一類，說(shuō)明桑屬屬于單系，這一結(jié)果與Zhao等[13]對(duì)葉綠體trnL-trnF間隔區(qū)序列的研究結(jié)果相一致。桑樹為異花授粉植物，在自然界分布廣泛，很容易發(fā)生自然雜交，因而具有相對(duì)復(fù)雜的遺傳背景。傳統(tǒng)的分析方法如形態(tài)學(xué)、同工酶、染色體核型分析等，不能夠解決桑樹在系統(tǒng)進(jìn)化以及分類中出現(xiàn)的許多分歧，更不能夠適應(yīng)急需的種質(zhì)資源鑒定以及桑樹育種的需求。在桑樹中已陸續(xù)開展了分子標(biāo)記研究，但主要是利用RAPD 技術(shù)來(lái)進(jìn)行探討，具有一定的局限性。因此，本研究對(duì)收集的部分安徽省特色桑屬植物的ITS序列進(jìn)行了分析，通過(guò)揭示DNA分子核苷酸的變異來(lái)研究桑屬的系統(tǒng)發(fā)育，比一般方法更直觀、準(zhǔn)確。將來(lái)有望在桑屬植物中利用多重序列來(lái)研究其系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化。

分子標(biāo)記作為遺傳標(biāo)記的一種重要類型，具有數(shù)量多、多態(tài)性高、以DNA為存在形式等一系列優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)在種質(zhì)資源的鑒定和分類、目標(biāo)基因的定位、遺傳圖譜構(gòu)建等方面取得了突破性的進(jìn)展。相信隨著新的分子標(biāo)記的不斷發(fā)現(xiàn)，在桑樹上利用分子標(biāo)記技術(shù)將有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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