禮 穎，王春雪

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

豬瘟疫苗（傳代細(xì)胞源）生產(chǎn)工藝研究

禮 穎，王春雪

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

豬瘟是一種傳染性疾病，是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。由豬瘟病毒引起，因其流行廣、發(fā)病率及死亡率高，豬瘟的防控工作也變得越來(lái)越艱巨。接種疫苗是控制豬瘟的主要途徑，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)豬瘟傳代細(xì)胞源的工藝優(yōu)化研究，以獲得較好的生產(chǎn)工藝技術(shù)參數(shù)，從而確保提高產(chǎn)品效價(jià)和穩(wěn)定性。

ST細(xì)胞；消化；接毒，效價(jià)

豬瘟由豬瘟病毒（CSFV）引起，流行廣，發(fā)病率及死亡率較高，是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一[1-4]。隨著我國(guó)豬瘟的流行越來(lái)越復(fù)雜，豬瘟的防控工作也變得越來(lái)越艱巨。接種疫苗是控制豬瘟的主要途徑[5-12]。

豬瘟活疫苗的生產(chǎn)中越來(lái)越多的采用傳代細(xì)胞源生產(chǎn)工藝方法，此方法簡(jiǎn)化生產(chǎn)過(guò)程，減少了動(dòng)物源的原材料的使用，但在培養(yǎng)過(guò)程中效價(jià)的穩(wěn)定性與高低成為工藝研究重點(diǎn)，本文主要采用一些試驗(yàn)方法，使抗原效價(jià)有所提高，并確定其關(guān)鍵工藝參數(shù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞及毒株

使用細(xì)胞為ST細(xì)胞，保存液氮罐中，生產(chǎn)用為10代以?xún)?nèi)；種毒為豬瘟兔化弱毒株（脾毒），保存溫度-80℃冰柜，生產(chǎn)用毒種（3代）。

1.2 主要試劑及試驗(yàn)動(dòng)物

5倍MEM溶液、7.5%碳酸氫鈉溶液、犢牛血清、青鏈霉素溶液、EDTA-胰酶分散液；檢測(cè)用培養(yǎng)基普通瓊脂、普通肉湯、40%葡萄糖溶液、酪胨瓊脂斜面（G.A）、硫乙醇酸鹽酪胨湯（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P）；試驗(yàn)過(guò)程中所使用動(dòng)物為大耳白家兔。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞制備

ST細(xì)胞消化5～10 min后培養(yǎng)48 h的形態(tài)觀(guān)察見(jiàn)圖1，細(xì)胞消化45～50 min后培養(yǎng)48 h的形態(tài)觀(guān)察見(jiàn)圖2，細(xì)胞消化65～70 min后培養(yǎng)48 h的形態(tài)觀(guān)察見(jiàn)圖3，ST細(xì)胞傳代過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)情況記錄見(jiàn)表1。

從工作細(xì)胞庫(kù)中取出1支凍存ST細(xì)胞置37℃水浴中融化，待凍存細(xì)胞液完全溶解，放置離心機(jī)中，1 000 r·min-1離心7 min。棄上清，移入裝有含營(yíng)養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h換液繼續(xù)培養(yǎng)，待形成良好細(xì)胞單層后擴(kuò)大培養(yǎng)至轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。

圖1 ST細(xì)胞消化5～10 min后培養(yǎng)48 h的形態(tài)

圖2 細(xì)胞消化45～50 min后培養(yǎng)48 h的形態(tài)

圖3 細(xì)胞消化65～70 min后培養(yǎng)48 h的形態(tài)

取生長(zhǎng)良好單層的ST細(xì)胞，用PBS溶液中和細(xì)胞表面殘留物質(zhì)后棄掉，再加入E-EDTA溶液，37℃溫室中進(jìn)行消化，待消化至肉眼可見(jiàn)瓶壁表面出現(xiàn)針尖樣劃痕或間隙，顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、脫落時(shí)，棄掉部分消化液（剩余10～30 mL消化液），于37℃溫室中繼續(xù)消化。

201501批：待消化5～10 min后，加入少量營(yíng)養(yǎng)液對(duì)單層細(xì)胞進(jìn)行吹打，制成細(xì)胞懸液，采取按1∶3分裝比例傳代增殖。

表1 ST細(xì)胞傳代過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)情況

201502批：待消化45～50 min后，加入少量營(yíng)養(yǎng)液對(duì)單層細(xì)胞進(jìn)行吹打，制成細(xì)胞懸液，采取按1∶3分裝比例傳代增殖。

201503批：待消化65～70 min后，加入少量營(yíng)養(yǎng)液對(duì)單層細(xì)胞進(jìn)行吹打，制成細(xì)胞懸液，采取按1∶3分裝比例傳代增殖。

3組細(xì)胞均置于37℃溫室增殖培養(yǎng)，對(duì)ST細(xì)胞的形態(tài)及增殖情況進(jìn)行觀(guān)察，并記錄。

2.2 接 毒

不同接毒量的試驗(yàn)效果對(duì)比見(jiàn)表2，3%接毒24 h ST細(xì)胞的形態(tài)觀(guān)察見(jiàn)圖4，5%接毒24 h ST細(xì)胞的形態(tài)觀(guān)察見(jiàn)圖5。

表2 不同接毒量的試驗(yàn)效果對(duì)比

圖4 3%接毒24 h ST細(xì)胞的形態(tài)

圖5 5%接毒24 h ST細(xì)胞的形態(tài)

細(xì)胞數(shù)達(dá)到90%～100%剛形成單層的ST細(xì)胞，隨機(jī)選取1轉(zhuǎn)瓶繼續(xù)傳代作為對(duì)照組，剩余隨機(jī)分成3組（201504、201505、201506），用同步接毒的方法分別接入含3%、4%和5%的豬瘟兔化弱毒株（脾毒）病毒維持液，37℃溫室中轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。接種后每日觀(guān)察1～2次，對(duì)ST細(xì)胞病變情況進(jìn)行觀(guān)察并記錄，選擇有80%單層細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE時(shí)即可收獲。采用倍比稀釋法對(duì)病毒含量測(cè)定。

每只兔耳靜脈注射1 mL（平行注射兩只兔子）。測(cè)量體溫，按兔體產(chǎn)生體溫反應(yīng)確定病毒量是否合格。符合定型熱反應(yīng)（++）為合格可進(jìn)行第2次傳代。

接種家兔的體溫反應(yīng)分為4類(lèi)：定型熱反應(yīng)（++）潛伏期24～48 h，體溫上升呈明顯曲線(xiàn)，＞常溫1℃以上至少有3個(gè)溫次，并稽留18～36 h；輕熱反應(yīng)（+）潛伏期24～72 h，體溫上升有一定曲線(xiàn)，＞常溫0.5℃以上至少有兩個(gè)溫次，并稽留12～36 h；可疑反應(yīng)（±）潛伏期不到24 h或＞72 h，體溫曲線(xiàn)起伏不定，或稽留＜12 h，或稽留＞36 h而不降；無(wú)反應(yīng)（-）體溫正常。

2.3 無(wú)菌檢驗(yàn)

不同溫度對(duì)待測(cè)樣品的影響見(jiàn)表3。

將待測(cè)樣品接種TG小瓶（50 mL·瓶-1），接種量為1.0 mL·瓶-1，置37℃培養(yǎng)，3 d后吸取培養(yǎng)物，分別接種GA斜面、TG小管各2支和GP小管1支，接種量為0.2 mL·支-1，一支GA斜面和TG小管置37℃培養(yǎng)，一支GA斜面、TG小管和GP小管置25℃培養(yǎng)，均培養(yǎng)5 d，每日觀(guān)察結(jié)果并記錄。

3 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，ST細(xì)胞消化45～50 min后補(bǔ)液傳代，培養(yǎng)48 h后觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)良后，形態(tài)完整且分布均勻，細(xì)胞團(tuán)較少。ST細(xì)胞消化5～10 min后補(bǔ)液傳代與ST細(xì)胞消化65～70 min后補(bǔ)液傳代，培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞分布不均、細(xì)胞團(tuán)較多。因此，ST細(xì)胞消化時(shí)間選擇45～50 min，消化效果顯著提高。

結(jié)果表明，按3%、4%和5%3種不同接毒劑量感染ST細(xì)胞，收獲的3種病毒液TCID50值間有差別，其中5%接毒量收獲的病毒液RID值略偏高，4%和5%接毒量收獲的病毒液RID值與3%接種量收獲的病毒液RID值差異顯著。5%接毒量的細(xì)胞在接毒后24 h已出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），48 h后細(xì)胞病變＞80%，可以收獲；3%接毒量的細(xì)胞在接毒后24 h未見(jiàn)細(xì)胞病變出現(xiàn)，48 h出現(xiàn)細(xì)胞病變，72 h后細(xì)胞病變較高，＞80%，因此根據(jù)生產(chǎn)需要在接毒時(shí)選擇5%接毒量進(jìn)行生產(chǎn)。

表3 不同溫度對(duì)待測(cè)樣品的影響

4 結(jié) 論

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，ST細(xì)胞消化時(shí)間選擇45～50 min，消化效果顯著提高，根據(jù)生產(chǎn)需要在接毒時(shí)選擇5%接毒量進(jìn)行生產(chǎn)。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)豬瘟傳代細(xì)胞源的工藝優(yōu)化研究，獲得較好的生產(chǎn)工藝技術(shù)參數(shù)，提高了產(chǎn)品的效價(jià)和穩(wěn)定性。

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The Study on Optimization of Production Processes to the Classical Swine Fever Vaccine(Cell Line Origin)

LI Ying,WANG Chunxue

（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

Swine fever is an infectious disease,which is one of the major diseases that endangers the development of pig industry in our country.It was caused by swine fever virus,which had a wide prevalence,high morbidity and mortality,and the prevention and control of CSFV was more and more difficult.Vaccination was the main way to control hog cholera,and the experiment researched on the optimization of the process of swine fever passage cell source,in order to obtain better production technology parameters,so as to improve the titer of potency and stability of theproduct.

ST cells;digestion;toxicity;potency

S828；S852.65+1

：A

：1001-0084（2017）07-0026-04

2017-06-18

禮穎（1974-），女，遼寧遼中人，獸醫(yī)師，主要從事疫苗生產(chǎn)的研究與應(yīng)用。