賀 玲， 屈亞威， 王偉岸， 夏憫馨， 劉海峰

1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.武警總醫(yī)院消化內(nèi)科

近紅外熒光分子探針在胃癌分子成像中的應(yīng)用研究

賀 玲1,2， 屈亞威2， 王偉岸2， 夏憫馨2， 劉海峰2

1.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；2.武警總醫(yī)院消化內(nèi)科

目的 評(píng)估3種近紅外熒光分子探針在胃癌分子成像中的靶向性和熒光效應(yīng)，為胃癌熒光分子成像篩選可用的靶向分子探針。方法 選用3種近紅外熒光分子探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)，并以吲哚菁綠作為對(duì)照組，經(jīng)裸鼠胃癌皮下移植瘤模型尾靜脈注射探針后進(jìn)行活體熒光分子成像，量化分析腫瘤部位熒光信號(hào)強(qiáng)度。離體熒光分子成像觀察探針的生物分布和代謝。成像結(jié)束后，對(duì)移植瘤進(jìn)行組織學(xué)及3種探針相應(yīng)分子靶點(diǎn)(αvβ3、FRα、MMP)免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果 活體熒光分子成像結(jié)果顯示探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)均在荷瘤鼠腫瘤部位出現(xiàn)濃聚，濃聚高峰分別在注射后1 h、1 h、24 h。與對(duì)照組相比，上述3種分子探針有較好的靶向性和信噪比。離體熒光分子成像證實(shí)探針主要經(jīng)肝、腎代謝。免疫組化表明3種探針對(duì)應(yīng)的分子靶點(diǎn)在裸鼠胃癌皮下移植瘤均有表達(dá)。結(jié)論 以上3種探針可用于胃癌熒光分子成像。αvβ3、FRα、MMP可作為胃癌熒光分子成像的靶點(diǎn)。

近紅外；熒光分子成像；胃癌；探針；鼠模型

目前，早期胃癌及癌前病變的檢測(cè)主要依賴白光內(nèi)鏡觀察病變及活檢后的病理定性，而多數(shù)早癌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不明顯且病變活檢定位缺乏準(zhǔn)確性，導(dǎo)致漏診率很高[1]。近年來，將熒光分子成像(fluorescence molecular imaging, FLI)與消化內(nèi)鏡融合形成的熒光分子內(nèi)窺成像技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，有望成為早期胃癌檢測(cè)技術(shù)的新突破。熒光內(nèi)窺成像通過靜脈注射或表面噴灑熒光探針靶向病變區(qū)域，然后用相應(yīng)的設(shè)備激發(fā)使病變部位“發(fā)光”，進(jìn)而捕捉到熒光信號(hào)并對(duì)病變進(jìn)行觀察和檢測(cè)，使得在內(nèi)鏡下進(jìn)行消化道腫瘤分子診斷成為可能，其效果相當(dāng)于在體免疫組織化學(xué)檢查，同時(shí)也能指導(dǎo)腫瘤的靶向治療[2]。

要想實(shí)現(xiàn)熒光分子內(nèi)窺成像在早期胃癌診斷中的臨床轉(zhuǎn)化，必須有能和腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞間質(zhì)靶向性結(jié)合的熒光分子探針。因此開發(fā)特異性強(qiáng)、靶向性好、無毒的熒光探針成為研究熱點(diǎn)。另外，對(duì)比可見光波段的熒光成像，近紅外熒光成像擁有更強(qiáng)的組織穿透性和更高的信噪比[3]。故本實(shí)驗(yàn)選用近紅外窗的3種商業(yè)化靶向性熒光探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)，利用臨床可用的非靶向性熒光探針吲哚菁綠(indocyanine green, ICG)作對(duì)照，對(duì)胃癌裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)行活體和離體FLI，并對(duì)腫瘤組織進(jìn)行相應(yīng)的抗原抗體免疫組化檢測(cè)，從而驗(yàn)證這3種探針在胃癌分子成像中的靶向性和熒光效應(yīng)，為日后研發(fā)臨床可用的胃癌靶向性熒光分子探針助力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST探針購自美國PerkinElmer公司；ICG購自遼寧天醫(yī)生物制藥公司；PBS、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gbico公司；異氟烷購自山東科源制藥公司；鼠抗人αvβ3單抗原液購自美國NOVUS公司；鼠抗人MMP2單抗、鼠抗人FRα單抗購自北京西雅金橋生物公司。

1.1.2 主要儀器：IVIS?Spectrum小動(dòng)物活體成像儀購自美國PerkinElmer公司，小動(dòng)物氣體麻醉裝置購自美國Caliper公司。

1.1.3 細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所腫瘤藥理室傳代、保存。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4～6周齡Bal b/c裸鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，雌性，購自北京維通利華公司。受試動(dòng)物飼養(yǎng)于無菌的獨(dú)立送風(fēng)IVC籠中，用專門為小鼠配制的消毒飼料、瓜子、純凈水飼喂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：SGC-7901細(xì)胞接種于含100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2.5 g/L胰蛋白酶消化、傳代。

1.2.2 裸鼠胃癌皮下移植瘤模型構(gòu)建：將處于對(duì)數(shù)期的SGC-7901細(xì)胞用胰酶消化、離心(1 200 r/min,5 min)，生理鹽水洗滌后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107ml-1。16只裸鼠分別于右側(cè)腋下接種0.2 ml單細(xì)胞懸液，待腫瘤長(zhǎng)至0.8～1.0 cm備用。

1.2.3 成像前準(zhǔn)備：(1)配制探針：IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST、ICG凍干粉溶于無菌PBS中，4 ℃避光保存；(2)麻醉：異氟烷持續(xù)吸入麻醉至裸鼠四肢無力。

1.2.4 活體FLI：16只荷瘤鼠，分4組，每組4只，每組荷瘤鼠依次尾靜脈注射2 nmol/100 μl IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST、ICG，注射探針前、后1 h、3 h、7 h、24 h、48 h利用IVIS?Spectrum進(jìn)行FLI，Living Image軟件分析圖像，以腫瘤部位為中心，直徑10 mm的圓形區(qū)域劃感興趣區(qū)域(region of interest, ROI)，測(cè)量各時(shí)間點(diǎn)ROI的平均熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.5 離體FLI：待以上荷瘤鼠體內(nèi)探針完全代謝后(約4 d)，重新分別尾靜脈注射2 nmol/100 μl IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST、ICG，各探針在瘤體濃聚高峰時(shí)和探針注射后48 h分別處死各組荷瘤鼠，剝離瘤體及主要臟器(心、肝、脾、雙腎)，用PBS洗滌后，再用上述方法立即進(jìn)行FLI，測(cè)量其平均熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.6 組織學(xué)檢查：離體FLI結(jié)束后，腫瘤組織經(jīng)病理學(xué)檢查，明確組織類型，并行各探針對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)免疫組化(immunohistochemistry，IHC)檢測(cè)驗(yàn)證各探針的特異性。

2 結(jié)果

2.1 活體FLI 連續(xù)動(dòng)態(tài)FLI結(jié)果顯示，尾靜脈注射各探針后，隨著時(shí)間的推移，與ICG相比，3種靶向性探針逐漸在皮下移植瘤濃聚，小動(dòng)物活體成像儀能在瘤體探測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，與鄰近正常組織對(duì)比明顯。量化瘤體平均熒光信號(hào)強(qiáng)度可見3種探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)在腫瘤濃聚高峰時(shí)間不一，依次為探針注射后1 h、1 h、24 h。而ICG注射后主要聚集在肝臟，48 h后完全排出體外，持續(xù)成像沒有在瘤體探測(cè)到明顯的特異性熒光信號(hào)(見圖1～2)。

2.2 離體FLI 探針在瘤體濃聚高峰時(shí)以及探針注射后48 h對(duì)腫瘤及主要臟器(心、肝、脾、雙腎)進(jìn)行離體FLI，量化各臟器平均熒光信號(hào)強(qiáng)度，獲得各探針在裸鼠胃癌移植瘤模型的代謝及組織分布情況。MMPSenseTM750FAST和IntergriSenseTM750經(jīng)肝、腎同時(shí)代謝，而FolateRsenseTM680主要經(jīng)腎臟代謝，探針注射后48 h在瘤體仍能探測(cè)到熒光信號(hào)，但均較代謝器官(肝臟或腎臟)弱。ICG主要聚集在肝臟，注射后48 h經(jīng)肝、腎代謝后完全排出體外(見圖3～4)。

2.3 組織學(xué)檢查結(jié)果 裸鼠胃癌皮下移植瘤進(jìn)行組織學(xué)和3種靶向性探針?biāo)鶎?duì)應(yīng)靶點(diǎn)(αvβ3、FRα、MMP)的IHC檢測(cè)。HE染色證實(shí)該移植瘤為胃癌，3種特異性熒光探針I(yè)ntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680和MMPSenseTM750FAST各自對(duì)應(yīng)的分子靶點(diǎn)αvβ3、FRα和MMP在移植瘤均有不同程度表達(dá)(見圖5)。

圖1 裸鼠胃癌皮下移植瘤模型活體熒光分子成像圖Fig 1 Subcutaneous xenograft models in vivo fluorescence imaging

圖2 特異性熒光探針與ICG在腫瘤部位平均熒光信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間變化圖

Fig 2 The fluorescence intensity of the specific probes and ICG in the tumor site changes over time

3 討論

基于熒光靶向性探針的胃癌熒光分子成像能在病變形態(tài)結(jié)構(gòu)改變前，從分子水平識(shí)別和描述病變的在體黏膜特征[6]。胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中有一些高表達(dá)的分子可以作為腫瘤診斷的候選靶點(diǎn)，比如胃癌特異性抗原(MG7、MGb2)[4-5]，細(xì)胞表面的一些特異性受體(如：整合素[6]、表皮生長(zhǎng)因子受體[7]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體[8]、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體[9]等)，或蛋白水解酶(基質(zhì)金屬蛋白酶[10]、組織蛋白酶B[11]等)及一些小分子受體(葉酸受體α[12])等。熒光分子探針能與這些靶點(diǎn)特異性結(jié)合高亮腫瘤從而實(shí)現(xiàn)病變的熒光檢測(cè)。目前基于靶向性熒光分子探針的胃癌成像仍停留在動(dòng)物和人離體組織標(biāo)本研究階段。2012年，Hoetker等[13]用熒光染料AlexaFlour488標(biāo)記西妥昔單抗構(gòu)建了靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的熒光探針，經(jīng)尾靜脈注射該探針到裸鼠胃癌皮下移植瘤模型體內(nèi)，利用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(confocal laser endomicroscopy, CLE)在荷瘤鼠瘤體上觀察到西妥昔單抗組熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，并在亞細(xì)胞水平定位了EGFR的分布。MG7抗原是第四軍醫(yī)大學(xué)課題組發(fā)現(xiàn)的一種特異性較高的胃癌相關(guān)抗原，在胃癌組織中表達(dá)率高達(dá)94%，在胃癌患者血清中的檢出率為83.6%，是極具早期診斷價(jià)值的胃癌分子標(biāo)志物[4]。2013年，Li等[4]將AlexaFlour488標(biāo)記的抗MG7單克隆抗體與新鮮人胃癌組織及正常胃組織體外共孵育后利用CLE檢測(cè)，結(jié)果顯示23例胃癌組織標(biāo)本中22例有特異性熒光信號(hào)，而非癌組織標(biāo)本則無或僅有弱熒光信號(hào)。

熒光內(nèi)窺成像技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化的最大阻礙就是靶向性熒光探針在人體應(yīng)用的安全性。因此，開發(fā)臨床可用的靶向性探針將會(huì)是胃癌熒光內(nèi)窺成像研究中的重要方向。整合素αvβ3作為細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞表面受體，它在胃癌表面和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，通過特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路削弱細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附并影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，參與腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。整合素能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)的表達(dá)，MMP通過降解腫瘤周圍的基質(zhì)而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其活性增強(qiáng)或表達(dá)上調(diào)與胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)聯(lián)[10]。葉酸受體α(folate receptor α, FRα)是一種細(xì)胞表面蛋白，已被證實(shí)為一種新的腫瘤標(biāo)記物，在多種實(shí)體瘤(包括胃癌)中高表達(dá)[12]。另外，由于活體內(nèi)的血紅蛋白、水和脂質(zhì)對(duì)600～900 nm的近紅外熒光的吸收率最低，與可見光相比，近紅外熒光成像擁有更深的組織穿透性且自體熒光干擾少[10]。

注：圖中1、2、3、4、5分別指腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、雙腎。圖3 組織離體FLI圖 A: αvβ3; B: FRα; C: MMP; D: ICGFig 3 Ex vivo FLI of tissue A: αvβ3; B: FRα; C: MMP; D: ICG

注：圖中1、2、3、4、5分別指腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、雙腎。

圖4 探針在瘤體濃聚高峰時(shí)以及探針注射后48 h的組織分布圖 A: ICG; B: IntergriSenseTM750; C: FolateRsenseTM680; D: MMPSenseTM750FAST

Fig 4 The distribution of the probe at the peak tumor concentration and 48 hours after the injection of the probe A: ICG; B: IntergriSenseTM750; C: FolateRsenseTM680; D: MMPSenseTM750FAST

圖5 裸鼠胃癌皮下移植瘤HE染色和免疫組化結(jié)果圖(400×) A: HE; B: αvβ3; C: FRα; D: MMP

Fig 5 HE staining and immunohistochemical analysis of transplanted tumors in nude mice (400×) A: HE; B: αvβ3; C: FRα; D: MMP

本實(shí)驗(yàn)選用αvβ3、FRα、MMP作為胃癌熒光分子成像的目標(biāo)靶點(diǎn)，利用與上述靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的近紅外靶向熒光分子探針(IntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST)進(jìn)行胃癌的熒光診斷成像?；铙wFLI和離體FLI結(jié)果顯示，尾靜脈注射各探針后，探針立即全身分布，與ICG相比，3種靶向性探針逐漸在皮下移植瘤濃聚，小動(dòng)物活體成像儀能在瘤體探測(cè)到明顯的熒光信號(hào)，與鄰近正常組織對(duì)比明顯。量化分析ROI平均熒光信號(hào)強(qiáng)度證實(shí)探針I(yè)ntergriSenseTM750、FolateRsenseTM680、MMPSenseTM750FAST在腫瘤濃聚高峰時(shí)間不一，依次為注射后1 h、1 h、24 h。注射后48 h在瘤體仍能探測(cè)到熒光信號(hào)，但均較代謝器官(肝臟或腎臟)弱。而ICG注射后主要在肝臟聚集，48 h后經(jīng)肝臟代謝、經(jīng)腎臟完全排出體外，持續(xù)成像沒有在瘤體探測(cè)到明顯的特異性熒光信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)首次證明，這3種特異性熒光分子探針對(duì)胃癌具有良好的靶向性，并且成像清晰、定位準(zhǔn)確。免疫組化提示，各探針對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)在裸鼠皮下移植瘤中表達(dá)均陽性。結(jié)合熒光分子成像和免疫組化結(jié)果證實(shí)FRα、αvβ3和MMP可以作為熒光分子成像診斷胃癌的特異性靶點(diǎn)，這3種近紅外商業(yè)探針也可應(yīng)用于胃癌的熒光診斷研究。

荷瘤鼠持續(xù)活體FLI和離體臟器FLI證實(shí)上述靶向探針在注射后48 h，除移植瘤外，其他部位仍可見強(qiáng)度不一的熒光信號(hào)，提示與瘤體未結(jié)合的探針仍未完全排除體外，這可能與探針分子量大，代謝緩慢，血清半衰期長(zhǎng)有關(guān)。如果探針全身應(yīng)用后易在體內(nèi)積累，會(huì)增加背景噪音，降低腫瘤病變的信噪比，影響活體成像效果。在后續(xù)研究中，可以以這些靶點(diǎn)為基礎(chǔ)，篩選出分子量更小的配體(如短肽[14]、核酸適體[15]等)，與熒光物質(zhì)結(jié)合，構(gòu)建出藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布特性更優(yōu)秀的胃癌靶向性熒光探針。目前，胃癌熒光分子成像依舊處于臨床前研究階段，而食管和結(jié)腸瘤變已有人在體FLI研究成果報(bào)道[16-18]。相信在不久的將來，胃癌熒光分子診斷也會(huì)取得突破性進(jìn)展。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Application of near infrared fluorescent molecular probe in molecular imaging of gastric cancer

HE Ling1,2, QU Yawei2, WANG Weian2, XIA Minxin2, LIU Haifeng2

1.Anhui Medical University, Hefei 230032; 2.Department of Gastroenterology， General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, China

Objective To evaluate the targeting ability and fluorescence efficiency of three kinds of near infrared fluorescent probes in molecular imaging of gastric cancer， and to screen useful molecular probes for fluorescence molecular imaging of gastric cancer. Methods Three kinds of near infrared fluorescent molecular probes (IntergriSenseTM750， FolateRsenseTM680, MMPSenseTM750FAST) were used to detect and quantify the fluorescent signal intensity of tumor tissue by in vivo fluorescent molecular imaging after injecting of the above probes to subcutaneous xenograft models of gastric cancer. The biodistribution and metabolism of these probes were performed by exvivo fluorescence molecular imaging. After fluorescence molecular imaging, the histologic examination of the transplanted tumor tissue and the immunohistochemical detection of the corresponding molecular targets (αvβ3, FRα, MMP) were performed. Results In vivo fluorescence molecular imaging showed that three kinds of probes (IntergriSenseTM750, FolateRsenseTM680, MMPSenseTM750FAST) were concentrated in the tumor-bearing tumor, and the peak was 1 hour, 1 hour and 24 hours after injection, respectively. Furthermore, compared with control group, the region of interest of the three targeted fluorescect probes were better. In vitro fluorescence molecular imaging confirmed that the probes was mainly metabolized by the liver and kidney.Immunohistochemistry confirmed that three molecular targets were expressed in subcutaneous xenografts models. Conclusion The above mentioned molecular probes can be used for the fluorescence molecular imaging of gastric cancer. αvβ3, FRα and MMP can be used as targets for imaging of gastric cancer.

Near infrared; Fluorescence molecular imaging; Gastric cancer; Probe; Mouse model

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.07.019

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81471700)

賀玲，碩士研究生，研究方向：消化道消腫瘤熒光分子成像的研究。E-mail: 18516889540@163.com

劉海峰，研究方向：消化道腫瘤的早期診斷研究。E-mail:haifengliu333@163.com

R735.2

A

1006-5709(2017)07-0786-05

2017-03-21