葉勵超，黃玉婷

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建泉州 362000

丹參酮Ⅱa對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的病理影響

葉勵超1，黃玉婷2

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建泉州 362000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建泉州 362000

目的 探究丹參酮Ⅱa對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的病理影響。方法 從泉州實(shí)驗(yàn)動物公司購買60只小鼠，健康C57BL/6雌性小鼠，8～13周齡，研究時間2016年1—3月，使用MOG35-55作為抗原免疫，建立EAE模型。將小鼠隨機(jī)分成兩組，每組30只，一組為對照組，小鼠發(fā)病后腹腔注射5%DMSO。另一組為觀察組，腹腔注射丹參酮Ⅱa。分別觀察0、10、20 d兩組小鼠的病理狀況。 結(jié)果 觀察組小鼠，在治療10、20 d的臨床癥狀明顯比對照組輕，觀察組小鼠的軸索損失比對照組輕，觀察組小鼠20 d時的髓鞘病理評分為（0.86±0.33）分，對照組評分為（1.98±0.65）分，觀察組和對照組的病理評分異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組小鼠20 d炎性細(xì)胞浸潤評分（1.49±0.47）分比對照組（2.61±0.62）分低，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 丹參酮Ⅱa能夠減輕EAE小鼠炎癥反應(yīng)，髓鞘脫失和軸索損傷，改善臨床癥狀。

丹參酮Ⅱa；脫髓鞘；炎性細(xì)胞浸潤；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎

多發(fā)性硬化癥是由T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，病理變化主要是炎性細(xì)胞浸潤，以及腦白質(zhì)的脫髓鞘病變。多發(fā)性硬化癥多發(fā)于中青年群體中，發(fā)病后需要長期的藥物治療，當(dāng)前主要的藥物是免疫抑制劑類和激素類的藥物，這些藥物的不良反應(yīng)比較大，而且不適合長期用藥。尋找合適的藥物治療多發(fā)性硬化癥十分重要和緊迫[1-2]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病機(jī)制和多發(fā)性硬化癥相似，是公認(rèn)的研究多發(fā)性硬化癥的理想動物模型，能夠?yàn)槎喟l(fā)性硬化癥的治療提供研究的借鑒。丹參酮Ⅱa是我國傳統(tǒng)中藥丹參的主要生物活性成分，是一種脂溶性二萜醌類化合物，廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病等中，有多種藥理作用，丹參酮Ⅱa對抑制腦損傷后的炎癥反應(yīng)有重要作用，能夠保護(hù)腦和脊髓。為探究丹參酮Ⅱa對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的病理影響，特選取60只小鼠從2016年1—3月進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇60只健康小鼠，8～13周齡，小鼠全部雌性，質(zhì)量180～200 g，將60只小鼠隨機(jī)分為兩組，觀察組和對照組，每組30只，觀察組小鼠周齡8～13周，平均周齡（10.3±1.7）周，體質(zhì)量16～20 g，平均體質(zhì)量（18.5±1.3）g，對照組小鼠周齡9～13周，平均周齡（10.5±1.4）周，體質(zhì)量17～21 g，平均體質(zhì)量（18.6±1.5）g，兩組小鼠的周齡、體質(zhì)量等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。觀察組小鼠注射丹參酮Ⅱa，對照組注射5%二甲基亞砜（DMSO）。建立動物模型，對照組小鼠在神經(jīng)功能評分達(dá)到1分后，每日腹腔注射5%DMSO，觀察組在小鼠的神經(jīng)功能評分達(dá)到1分后，開始腹腔注射丹參酮Ⅱa20 mg/kg，1次/d，直到處死。

1.2 方法

建立EAE模型，以MOG35-55為抗原免疫，免疫動物全部在乙醚麻醉的狀態(tài)下，以及充分固定中進(jìn)行。將抗原MOG35-55稀釋成液體狀態(tài)，使用生理鹽水，達(dá)到5 mg/mL，然后加入完全弗氏佐劑，加入體積比例為1∶1，將液體混合均勻，乳化后，進(jìn)行注射。每只小鼠0.1 mg，在脊柱兩側(cè)的皮膚下，分4點(diǎn)進(jìn)行注射，免疫后當(dāng)天為第0小時，從第 0～48小時，小鼠腹腔內(nèi)注射 500 ng PTX，每只小鼠1 000 ng。每日早晨8：00和晚上16:00點(diǎn)，評估小鼠的臨床癥狀，并對小鼠稱重，在治療前，治療10，20 d，分別在觀察組和對照組中取出10只小鼠，使用4%多聚甲醛灌注固定，取脊髓腰膨的大部分，制成石蠟切片，進(jìn)行Bielschowsky's神經(jīng)軸索染色觀察、LFB染色觀察和HE染色觀察。

1.3 評價標(biāo)準(zhǔn)

小鼠的臨床癥狀評分的標(biāo)準(zhǔn)為：四肢無異常為0分，步態(tài)不穩(wěn)為1分，輕度癱瘓為2分，一個肢體全部癱瘓為3分，四肢全部癱瘓為12分；尾巴無異常為0分，尾巴半癱為1分，尾巴全癱為2分；死亡為15分。觀察LFB染色標(biāo)準(zhǔn)的評分為無髓鞘脫失0分，輕度髓鞘脫失1分，中度髓鞘脫失2分，重度髓鞘脫失3分。HE染色評分為無炎癥變化為0分，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤但只在脊膜和血管周圍為1分，輕度炎性細(xì)胞浸潤為2分（1～10片），中度炎性細(xì)胞浸潤為3分（11～100片），重度炎性細(xì)胞浸潤為4分（100片以上）。每個組織每個切片隨機(jī)挑選5個脊髓白質(zhì)區(qū)域，觀察“血管袖套”的形成情況，以及炎性細(xì)胞浸潤情況，計(jì)算炎性細(xì)胞并取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

該次調(diào)查所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)資料間的檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

60只小鼠在10～16 d內(nèi)開始發(fā)病，表示EAE動物模型制作完成，能夠?qū)π∈筮M(jìn)行藥物干預(yù)。對照組30只小鼠免疫后全部發(fā)病，小鼠的臨床癥狀有體重減輕、缺乏食欲、行走困難、萎靡不振、皮毛粗糙等，發(fā)病高峰期臨床癥狀最嚴(yán)重，小鼠雙后肢，或者全部四肢出現(xiàn)肌力下降的現(xiàn)象，甚至大小便失禁、不能自主翻身、全部癱瘓，一些小鼠呈垂死狀況，持續(xù)較長的時間。觀察組30只小鼠免疫后也全部發(fā)病，在臨床癥狀達(dá)到1分以上，開始進(jìn)行藥物治療，對照組和觀察組小鼠在治療前，臨床癥狀無顯著差異。10 d后，對照組小鼠進(jìn)入發(fā)病高峰期，臨床癥狀嚴(yán)重，觀察組小鼠給予丹參酮Ⅱa治療，出現(xiàn)尾部癱瘓，或者雙后肢輕度癱瘓或者全癱，沒有出現(xiàn)不能自主翻身，也沒有大小便失禁，20 d后，對照組小鼠的癥狀有所緩解，但有后肢癱瘓或者尾部癱瘓的遺留癥狀，觀察組小鼠癥狀緩解比較快，并且臨床癥狀比較輕，只有尾部無力，或者尾部輕微癱瘓等癥狀。20 d時，觀察組小鼠的神經(jīng)功能評分為（1.32±0.17）分，對照組小鼠的神經(jīng)功能評分為（2.51±0.39）分，（t= 7.832，P=0.002），對照組小鼠的神經(jīng)功能評分高于觀察組，兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

通過對兩組小鼠的Bielschowsky's神經(jīng)軸索染色觀察，治療前，兩組小鼠都存在軸索損傷，表現(xiàn)為腫脹扭曲、排列混亂和形狀不規(guī)則。治療10 d后，對照組小鼠軸索損傷更加明顯，直徑大小不一，形態(tài)不規(guī)則，病灶表現(xiàn)為大片狀，軸索斷裂，甚至消失，和髓鞘脫失、炎性細(xì)胞浸潤的部位有一致性，而且和疾病的嚴(yán)重程度有密切的關(guān)系。觀察組也存在軸索損失，但是程度和范圍比對照組輕。治療20 d后，對照組無明顯變化，觀察組比治療10 d的損傷程度較輕。

通過兩組小鼠的LFB染色觀察，發(fā)病前兩組小鼠沒有明顯的髓鞘脫失部位，但出現(xiàn)顏色變淺而且變薄的現(xiàn)象。對照組在10 d后，出現(xiàn)大小不同的片狀髓鞘脫失區(qū)域，藍(lán)色髓鞘部位減少，而且顏色變淡，甚至出現(xiàn)大片的空泡變性脫失區(qū)域，脫失部位常伴有炎性細(xì)胞浸潤。治療20 d后，沒有明顯變化。觀察組小鼠在10 d后，存在小的髓鞘脫失區(qū)域，顏色變淺，部分髓鞘變薄，沒有大片狀脫失區(qū)域。治療20 d后，比治療10 d的髓鞘變粗，藍(lán)色髓鞘區(qū)域增加。觀察組20 d時，病理評分為（0.86±0.33）分，對照組評分為（1.98±0.65）分，（t= 6.475，P=0.001），觀察組和對照組的病理評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

通過兩組小鼠HE染色觀察，治療前兩組小鼠都存在炎性細(xì)胞浸潤，集中在脊髓白質(zhì)附近。對照組小鼠治療10 d后，有大片狀的炎性細(xì)胞浸潤，脊髓多處小血管附近，小靜脈4周，出現(xiàn)炎性細(xì)胞，主要是淋巴細(xì)胞，20 d后炎性細(xì)胞減少，血管袖套減少。觀察組小鼠治療10 d后，炎性細(xì)胞集中在小血管周圍，很少有血管袖套現(xiàn)象，治療20 d后，血管袖套現(xiàn)象完全消失，炎性細(xì)胞更加減少。兩組病理評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組小鼠HE染色病理評分比較[(x±s)，分]

3 討論

多發(fā)性硬化癥的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，與細(xì)胞凋亡、異常的自身免疫反應(yīng)激活有密切的關(guān)系，和EAE模型比較相似，主要是脫髓鞘反應(yīng)和炎性細(xì)胞浸潤等，EAE模型是國際公認(rèn)的MS的動物模型[3-6]。該次實(shí)驗(yàn)通過建立EAE模型，探究丹參酮Ⅱa對EAE治療的作用。實(shí)驗(yàn)小鼠在免疫后10～16 d開始發(fā)病，到大約20 d，對照組小鼠的平均臨床評分達(dá)到最高。Bielschowsky's神經(jīng)軸索染色表明，在疾病發(fā)生的早期，已經(jīng)出現(xiàn)軸索損傷的現(xiàn)象，在高峰期更為明顯。隨著病情的惡化，軸索損傷逐漸加重，而且引起不可逆性的神經(jīng)功能缺損。該次研究中觀察Bielschowsky's染色，注射丹參酮Ⅱa的觀察組，損傷程度明顯比對照組輕，丹參酮Ⅱa對軸索損傷有保護(hù)作用。通過LFB染色觀察和HE染色觀察，觀察組的髓鞘脫失病理評分為（0.86±0.33）分，對照組評分為（1.98±0.65）分，觀察組明顯低于對照組，觀察組炎性細(xì)胞浸潤病理評分（1.49±0.47）分，對照組（2.61± 0.62）分，觀察組明顯低于對照組，兩組病理評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有研究認(rèn)為，丹參酮Ⅱa可以降低脊髓損傷后的一些炎性因子，降低炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡，具有抗氧化、清除自由基、消炎、活血化瘀等作用，與該文研究結(jié)果一致[7-9]。丹參酮Ⅱa已被證實(shí)，具有良好的保護(hù)心肌的作用，是許多疾病的聯(lián)合用藥，并且可以促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)，有保護(hù)神經(jīng)的作用。

綜上所述，丹參酮Ⅱa對于治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎有積極的作用，能夠減少軸索損傷、髓鞘脫失和炎性反應(yīng)，改善小鼠的臨床癥狀。

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Pathological Effect of TanshinoneⅡa on the Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

YE Li-chao1,HUANG Yu-ting2

1.Departmentof Neurology,Second Affiliated Hospital of Fujian Medical College,Quanzhou,Fujian Province,362000 China；
2.Department of Clinical Laboratory,Second Affiliated Hospital of Fujian Medical College,Quanzhou,Fujian Province, 362000 China

ObjectiveTo study the pathological effect of tanshinoneⅡa on the mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods60 healthy C57BL/6 female mice aged from 8 weeks to 13 weeks from January to March 2016 purchased by Quanzhou Experimental Animal Company were selected and MOG35-55 was used as the antigen immunity and the EAE model was established and the rats were randomly divided into two groups with 30 cases in each,the control group adopted the intraperitoneal injection of 5%DMSO after onset,while the observation group adopted the intraperitoneal injection of tanshinoneⅡa,and the pathological situations of the two groups was observed on 0 d,10 d and 20 d.ResultsThe clinical symptoms in the observation group at 10 d and 20 d were milder than those in the control group,and the axonal loss in the observation group was milder than that in the control group,and the medullary sheath pathological score in the observation group and in the control group was respectively （0.86±0.33）points and （1.98±0.65）points,and the difference in the pathological score between the two groups was obvious（P＜0.05）,and the 20 d inflammatory cell infiltration score in the observation group was lower than that in the control group[（1.49±0.47）points vs （2.61±0.62）points],and the difference was obvious with statistical significance（P＜0.05）.ConclusionThe tanshinoneⅡa can relieve the EAE mice inflammatory reactions,myelinoclasis and axonotmesis and improve the clinical symptoms.

TanshinoneⅡa;Demyelination;inflammatory cell infiltration;Experimental autoimmune encephalomyelitis

R4

A

1674-0742（2017）06（c）－0034-03

10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.18.034

2017-03-25）

泉州市技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（2015Z33）。

葉勵超（1973-），男，福建南安人，碩士，主任醫(yī)師，研究方向:神經(jīng)免疫。