徐明明，李建超，劉益飛，劉俊華

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇南通 226000；2.鹽城市第一人民醫(yī)院急診科，江蘇鹽城 224006；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科病理科，江蘇南通 226000

FOXO4在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

徐明明1，李建超2，劉益飛3，劉俊華1

1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科，江蘇南通 226000；2.鹽城市第一人民醫(yī)院急診科，江蘇鹽城 224006；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科病理科，江蘇南通 226000

目的 探討FOXO4在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中的表達(dá)及其臨床意義。 方法 方便選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科2005年3月—2007年3月手術(shù)切除的150例NSCLC標(biāo)本及20例正常肺組織標(biāo)本，應(yīng)用SP法分別檢測(cè)FOXO4表達(dá)情況，并分析NSCLC組織中FOXO4表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果FOXO4在腫瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)率為42.67%，明顯低于正常肺組織的80.00%（P＜0.01）。FOXO4在腫瘤組織中的表達(dá)與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小和病理分型之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；但與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期之間密切相關(guān)（P＜0.05）。其中高、中分化組FOXO4陽(yáng)性表達(dá)率(62.50%;50.00%)明顯高于低分化組(25.00%)（P=0.004）；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達(dá)率(80.00%)明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(29.09%)（P＜0.01）；TNMⅢ期組表達(dá)率(7.32%)明顯低于Ⅰ、Ⅱ期組(77.50%;43.48%)（P＜0.01）結(jié)論FOXO4在NSCLC中低表達(dá)，提示其可能為抑癌基因。

FOXO4；非小細(xì)胞肺癌；免疫組織化學(xué)

隨著環(huán)境污染的加重，肺癌的發(fā)病率及死亡率呈急劇上升趨勢(shì)。肺癌的5年生存率低于乳腺癌和大腸癌，僅為15%。FOXO轉(zhuǎn)錄因子是叉頭框（Forkhead box,FOX）家族中的一員，通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡、分化等過(guò)程[1]。FOXO4是FOXO亞家族中的成員，在胃癌、大腸癌中的表達(dá)都有所下調(diào)或缺失，表明多種機(jī)制導(dǎo)致的FOXO4失活可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2-3]。該研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)FOXO4在NSCLC中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，試圖闡明FOXO4在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。方便收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科2005年3月—2007年3月手術(shù)切除NSCLC標(biāo)本150例，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

NSCLC標(biāo)本150例，其中男122例，女28例；中位年齡64歲；鱗癌97例，腺癌41例，腺鱗癌12例；腫瘤≤3 cm 45例，＞3 cm 105例；高分化16例，中分化82例，低分化52例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移110例，無(wú)轉(zhuǎn)移40例；Ⅰ期40例、Ⅱ期69例，Ⅲ期41例。正常肺組織20例，取自癌灶遠(yuǎn)處，診斷無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。所有標(biāo)本制備成組織微陣列（TMA）。

1.2 方法

1.2.1 TMA制作 TMA是選取有代表性的組織部分，順序排列在載體上而制備成微縮組織陣列。在蠟塊中標(biāo)記代表性部位；石蠟與蜂蠟混合，制備成空白蠟塊，芯片儀蠟塊上打孔；將供體蠟塊軟化，細(xì)針鉗取代表性組織轉(zhuǎn)移至空白打孔蠟塊上；制備成組織芯片。

1.2.2 FOXO4蛋白檢測(cè) 采用免疫組化 SP法檢測(cè)FOXO4蛋白表達(dá)。切片脫蠟、脫水；熱修復(fù)抗原；消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；正常羊血清封閉；滴加兔抗人單克隆抗體FOXO4；滴加二抗；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；鹽酸酒精分化；PBS液返藍(lán)；梯度酒精脫水；二甲苯浸泡透明；封片；已知標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照，PBS液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.3 結(jié)果判定 采用雙盲法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。FOXO4蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞核，陽(yáng)性染色呈棕黃色或棕褐色；高倍鏡下每張切片選取5個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。FOXO4蛋白根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分，染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞無(wú)著色0分、淡棕色1分、棕色2分、棕褐色3分；同物鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比率﹤1%；1分，比率2%～25%；2分，比率26%～50%；3分，比率51%～75%；4分，比率﹥75%。兩項(xiàng)得分相乘：0～3分為 “-”；4～6分為“+”；7～9分為“++”；10～12分為“+++”?！?～+++”。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，用[n（%）]表示，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXO4在NSCLC和正常肺組織中的表達(dá)

FOXO4蛋白表達(dá)主要位于細(xì)胞核，陽(yáng)性染色呈棕褐色或棕黃色。150例NSCLC組織中，F(xiàn)OXO4蛋白陽(yáng)性率42.67%，明顯低于正常對(duì)照組（80.00%）(P＜0.01)。圖1A、圖1B、圖1C分別可見(jiàn)正常肺細(xì)胞、鱗癌細(xì)胞及腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)棕褐色顆粒沉積。

圖1A 正常肺組織FOXO4染色陽(yáng)性（SP×40/400）

圖1B 鱗癌組織FOXO4染色陽(yáng)性（SP×40/400）

圖1C 腺癌組織FOXO4染色陽(yáng)性（SP×40/400）

2.2 FOXO4表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

FOXO4在NSCLC中的表達(dá)與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小和腫瘤類(lèi)型之間無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)（P﹤0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

肺癌的發(fā)生發(fā)展由癌基因、抑癌基因及其它因子共同參與。通過(guò)研究轉(zhuǎn)錄因子FOXO4，以期有助于闡明FOXO4在NSCLC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。FOXO4是FOXO亞家族中的成員之一，F(xiàn)OXO4的DNA結(jié)合域具有特征性結(jié)構(gòu)：3個(gè)α螺旋、3個(gè)β鏈及2個(gè)翅膀狀大環(huán)[4]。FOXO4存在于人體組織器官中，其中心臟、骨骼肌中呈高水平表達(dá)。此外，F(xiàn)OXO4還與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、大腸癌、胃癌。

磷酸化是FOXO4蛋白最重要的翻譯后修飾。在胰島素生長(zhǎng)存活因子刺激下，PI3K-PKB/SGK信號(hào)通路激活，PKB和SGK進(jìn)入細(xì)胞核后對(duì)FOXO4蛋白產(chǎn)生磷酸化，其位點(diǎn)為 Thr32、Ser197、Ser262，導(dǎo)致磷酸化的FOXO4蛋白出核并滯留于細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。14-3-3特異性結(jié)合磷酸化的FOXO4，通過(guò)干擾核定位序列以及誘導(dǎo)FOXO4構(gòu)象改變，使其暴露出核輸出序列并與核外運(yùn)蛋白作用，促進(jìn)FOXO4蛋白出核失活[5]。轉(zhuǎn)錄因子FOXO4除接受磷酸化、乙酰化修飾外，O位N-乙酰葡萄糖胺糖基化和單泛素化也是其重要的修飾方式，并且在生命活動(dòng)中起重要作用[6]。

表1 FOXO4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

機(jī)體細(xì)胞中，F(xiàn)OXO4蛋白受PI3K/AKT、Ras調(diào)控，調(diào)節(jié)p27kip1和cyclin D的表達(dá)，使細(xì)胞周期分別停滯于G1、S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達(dá)增加誘導(dǎo)血管生成、糖代謝、紅細(xì)胞生成等相關(guān)基因的表達(dá)，而這些是腫瘤增大必需的條件。研究發(fā)現(xiàn)，定位于核內(nèi)的FOXO4通過(guò)下調(diào)HIF-1α蛋白水平，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、葡萄糖載體1和紅細(xì)胞生成素的表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[7]。miR-421在鼻咽癌細(xì)胞中通過(guò)抑制FOXO4轉(zhuǎn)錄活性，使其下游分子如p21、 p27、Bim及Fasl的表達(dá)下降，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抵抗細(xì)胞凋亡。已知作為抑癌基因的FOXO4，不僅參與阻滯腫瘤細(xì)胞周期，還通過(guò)多種途徑參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。FOXO4通過(guò)激活Bim因子，上調(diào)Bim蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。在非應(yīng)激條件下的人上皮癌細(xì)胞中，siRNA沉默 NAD依賴(lài)的脫乙酰酶SIRT1后，F(xiàn)OXO4介導(dǎo)了下游caspase3和caspase7的腫瘤細(xì)胞凋亡，而此過(guò)程與P53、FOXO3a無(wú)關(guān)。Lee發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)了FOXO4蛋白磷酸化，使ANXA8表達(dá)下降，進(jìn)而誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞EMT發(fā)生，提示FOXO4可能參與腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程[9]。該文發(fā)現(xiàn)FOXO4蛋白表達(dá)無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（80.00%vs 29.09%）(P<0.01)，提示FOXO4參與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。劉向強(qiáng)等[2]發(fā)現(xiàn)FOXO4在大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織 （47.50%vs 91.25%，P< 0.001），提示FOXO4在大腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著抑制因子的作用。該研究采用 SP法檢測(cè)了 150例NSCLC標(biāo)本中FOXO4蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FOXO4蛋白主要分布于細(xì)胞核，其表達(dá)率明顯低于正常肺組織（80.00%vs 42.67%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

分析NSCLC組織中FOXO4表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)FOXO4表達(dá)缺失與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示FOXO4在NSCLC發(fā)生、分化及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著抑制作用。因此，該研究認(rèn)為FOXO4的低表達(dá)與NSCLC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)OXO4可能為抑癌基因。

[1]Wilk A,Urbanska K,Grabacka M,et al.Fenofibrate-Induced Nuclear Translocation of FoxO3A Triggers Bim-Mediated Apoptosis in Glioblastoma Cells in Vitro[J].Cell Cycle,2012,11(14):2660-2671.

[2]劉向強(qiáng),湯善宏,張志勇,等.轉(zhuǎn)錄因子FOXO4在大腸癌中的表達(dá)及意義[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(9): 969-971.

[3]張超,王德榮,曲飛,等.轉(zhuǎn)錄因子FOXO4與胃癌及Hp感染關(guān)系的臨床研究[J].中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2013,16 (3):210-213.

[4]Vacha P,Zuskova I,Bumba L,et al.Detailed Kinetic Analysis of the Interaction Between the FOXO4-DNA-Binding Domain and DNA.[J].Biophysical Chemistry,2013,184(3): 68-78.

[5]Obsil T,Ghirlando R,Anderson DE,et al.Two 14-3-3 Binding Motifs are Required for Stable Association of Forkhead Transcription Factor FOXO4 with 14-3-3 Proteins and Inhibition of DNA Binding[J].Biochemistry,2014,42(51): 15264-15272.

[6]Ho SR,Wang K,Whisenhunt TR,et al.O-GlcNAcylation Enhances FOXO4 Transcriptional Regulation in Response to Stress[J].Febs Letters,2010,584(1):49-54.

[7]Fu B,Li Y,Zhao Z.The Correlation of HIF-1α,MACC1 and FOXO4 in Gastric Carcinoma Pathology and Prognosis[J]. Chongqing Medicine,2015(9):1180-1183.

[8]Wang W,Zhou PH,Hu W.Overexpression of FOXO4 Induces Apoptosis of Clear-Cell Renal Carcinoma Cells through Downregulation of Bim[J].Molecular Medicine Reports,2016,13(3):2229.

[9]Lee MJ,Yu GR,Yoo HJ,et al.ANXA8 Down-Regulation by EGF-FOXO4 Signaling is Involved in Cell Scattering and Tumor Metastasis of Cholangiocarcinoma.[J].Gastroenterology,2009,137(3):1138.

Expression and Significance of FOXO4 in the Non-small-cell Lung Cancer

XU Ming-ming1,LI Jian-chao2,LIU Yi-fei3,LIU Jun-hua1

1.Department of Cardio-Thoracic Surgery,Hospital Affiliated to Nantong University,Nantong,Jiangsu Province,226000 China；2.Department of Emergency,Yancheng First People’s Hospital,Yancheng,Jiangsu Province,224006 China；3.Department of Cardio-Thoracic Surgery&Department of Pathology,Hospital Affiliated to Nantong University,Nantong,Jiangsu Province,226000 China

ObjectiveTo study the expression and significance of FOXO4 in the non-small-cell lung cancer.MethodsConvenient selection 150 cases of NSCLC specimens and 20 cases of normal lung tissue specimens with operation resection in our hospital from March 2005 to March 2007 were selected and the FOXO4 expression was tested by the SP method and the correlation between the FOXO4 expression in NSCLC tissues and clinical pathological features was analyzed.ResultsThe positive expression rate of FOXO4 in the normal tissues was obviously lower than that in the normal lung tissue, (42.67%vs 80.00%)(P<0.01),and the difference in the expression of FOXO4 in tumor tissues among different genders, ages,smoking,mass sizes and pathological types was not statistically significant(P>0.05),but the expression was closely related to the differentiation degree,lymphatic metastasis and TNM staging(P<0.05),and the positive expression rate of FOXO4 in the high and moderate differentiation groups was obviously higher than that in the low differentiation group(62.50%, 50.00%vs 25.00%),（P=0.004）.and the expression rate in the no lymphatic metastasis group was obviously higher than that in the lymphatic metastasis group,(80.00%vs 29.09%)(P<0.01),and the expression rate in the TNMⅢgroup was obviously lower than that in the TNMⅠ and TNMⅡ groups(7.32%vs 77.50%,43.48%)(P<0.01).ConclusionThe expression of FOXO4 in NSCLC is low,which reminds that it may be the cancer suppressor gene.

FOXO4;Non-small-cell lung cancer;Immunohistochemistry

R734

A

1674-0742（2017）06（c）－0031-04

10.16662/j.cnki.1674-0742.2017.18.031

2017-03-22）

徐明明（1988-），男，江蘇南通人，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：胸部腫瘤診治。