張春陽(yáng)，王星，孫潔，王翠芳

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 急診科，遼寧 沈陽(yáng) 110024；2.病理科）

結(jié)直腸癌是胃腸道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，居男性惡性腫瘤的第4位，居女性第3位。世界范圍內(nèi)的死亡率約為發(fā)病率的1/2，雖然治療方法不斷改進(jìn)，但其預(yù)后并不樂(lè)觀。結(jié)直腸癌的病因和發(fā)病機(jī)制與環(huán)境和遺傳兩種因素有關(guān)：前者主要是飲食，尤其是脂肪和動(dòng)物蛋白；遺傳因素本身以多種方式表現(xiàn)，最眾所周知的是結(jié)直腸癌好發(fā)于家族性腺瘤性息肉患者和Lynch綜合征患者，其他息肉病類(lèi)型癌發(fā)生的比例非常低?；蛩缴系难芯堪l(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活、突變以及凋亡基因的失調(diào)等。

泛素是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，近年來(lái)越來(lái)越多的一些與泛素相關(guān)的低分子量蛋白，即泛素樣蛋白被鑒定出來(lái)，它們與多種細(xì)胞進(jìn)程有關(guān)。迄今為止，兩個(gè)泛素樣蛋白家族被鑒定出來(lái)，分別命名為泛素樣修飾蛋白（the ubiquitin-like modifiers，UBLs）和泛素域蛋白（ubiquitin-domain proteins，UDPs）[1]。

FAT 10也稱(chēng)雙泛素，屬于泛素樣蛋白的UBL家族。FAT 10是一個(gè)18 kD的蛋白，與泛素在N端和C端分別有29%和36%的同源性，最初認(rèn)為它是定位于6號(hào)染色體的主要組織相容性復(fù)合體的一個(gè)基因[2]。盡管FAT 10的功能并未完整闡明，但有研究顯示它在多種細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)FAT 10在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，分析FAT 10的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理資料之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 結(jié)直腸癌組織標(biāo)本

收集本院2010年3月-2011年3月結(jié)直腸癌患者外科手術(shù)切除標(biāo)本61例，所有患者術(shù)前均未接受放、化療。其中男38例，女23例。患者中位年齡67歲（39～97歲）。中位腫瘤大小50 mm（25～110 mm）。高中分化46例，低分化15例。臨床分級(jí)Ⅰ期和Ⅱ期共22例，Ⅲ期和Ⅳ期共39例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。癌旁組織為距癌2 cm內(nèi)的組織，正常結(jié)直腸黏膜組織取自手術(shù)切除標(biāo)本切緣組織（距癌＞5 cm）。所收集標(biāo)本均于手術(shù)切除后迅速保存于液氮中備用。

1.2 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定

組織標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm厚切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫苯、水化后，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法(S-P法)檢測(cè)FAT 10蛋白的表達(dá)。一抗為鼠抗人FAT10單克隆抗體 (1:200，Santa Cruz公司)，DAB顯色，以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色。高倍視野(×400)下選陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)區(qū)域計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按FAT10表達(dá)百分率分為以下五個(gè)等級(jí)：0%為0分，≤10%為1分，10%～50%為2分，51%～80%為3分，≥80%為4分。根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度分為四個(gè)等級(jí)：無(wú)染色為0分，淺棕黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，黃褐色計(jì)為3分。以陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度的分值之和 0，1，2，3，4，5，6，7 作為每一例的染色評(píng)分（IS，Immunoreactive score），得分＜4判定為陰性，積分≥4為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)FAT10表達(dá)及其與臨床病理因素之間關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane’s檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 FAT 10在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，正常結(jié)直腸黏膜及癌旁組織的細(xì)胞核中分別只有4例（6.56%）和11例（18.03%）FAT10呈核陽(yáng)性，且多為弱陽(yáng)性，其余均為陰性（圖1A）。按上述免疫組化染色評(píng)分，正常結(jié)直腸黏膜組織中只有1例（1.64%）、癌旁組織中有6例（9.84%）的FAT10表達(dá)可認(rèn)為是陽(yáng)性。結(jié)直腸癌中有46例FAT 10呈核陽(yáng)性表達(dá)（75.41%），其中有39例為均勻的中等到強(qiáng)陽(yáng)性（63.93%）（圖1 B）。結(jié)直腸癌組織與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織和正常結(jié)直腸黏膜組織相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,癌旁組織與其對(duì)應(yīng)的正常結(jié)直腸黏膜相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）(表 1，圖 2)。

2.2 結(jié)直腸癌中FAT10的表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)

在61例結(jié)直腸癌中，我們對(duì)FAT10的表達(dá)與一些臨床病理學(xué)參數(shù)（包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）之間關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAT10的表達(dá)與腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（表2）。

圖1免疫組織化學(xué)（S-P法）檢測(cè)FAT10在結(jié)直腸組織中的表達(dá)（原始放大倍數(shù)：100×）；A FAT10在結(jié)腸癌旁組織中陰性表達(dá)；B FAT10在中分化結(jié)腸腺癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)

圖2 FAT 10在正常結(jié)直腸黏膜組織、癌旁組織及結(jié)直腸癌中表達(dá)的半定量分析

表1 FAT 10在結(jié)直腸組織中的表達(dá)（x±s）

表2 61例結(jié)直腸癌中FAT 10表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析

3 討論

FAT10，泛素化調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程，包括有絲分裂、染色體穩(wěn)定性、凋亡、免疫控制和26S蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換[3，4]。FAT 10能夠與人紡錘體聚集檢測(cè)點(diǎn)蛋白（mitotic arrest deficie-ncy 2，MAD 2）非共價(jià)結(jié)合，而此蛋白負(fù)責(zé)在有絲分裂時(shí)保持紡錘體的完整性，MAD 2功能受到抑制則導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，這是許多腫瘤發(fā)生的重要特征[5]。

已在一些惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)FAT 10基因過(guò)度表達(dá)，其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致致癌細(xì)胞及非致癌細(xì)胞惡變[6]，并與人紡錘體聚集檢測(cè)點(diǎn)蛋白（mitotic arrest deficiency 2，MAD 2）非共價(jià)結(jié)合，而此蛋白負(fù)責(zé)在有絲分裂時(shí)保持紡錘體的完整性[7]，這其中包括胃腸道和婦科的惡性腫瘤。有報(bào)道稱(chēng)IFN-γ和TNF-α能夠上調(diào)FAT 10基因表達(dá)[2,6,10]。并已經(jīng)確定為FAT 0的相互作用蛋白[12]，而P 53在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。一些惡性腫瘤中FAT 10的異常高表達(dá)，細(xì)胞周期前中期細(xì)胞中高表達(dá)FAT 10蛋白，MAD 2著絲粒位點(diǎn)所導(dǎo)致的非染色體分離有絲分裂和染色體不穩(wěn)定性，并且FAT 10的表達(dá)受TNF-α（一個(gè)假定的腫瘤啟動(dòng)子）正調(diào)節(jié)[4,14]，受P 53（基因組的守護(hù)者）負(fù)調(diào)節(jié)[15]，這些都提示FAT 10在調(diào)控細(xì)胞周期和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)AT 10蛋白在結(jié)直腸正常黏膜組織、癌旁組織和結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增高，提示FAT 10表達(dá)增加在結(jié)直腸癌的癌變過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。

此外，在61例結(jié)直腸癌中，我們對(duì)FAT 10的表達(dá)與一些臨床病理學(xué)參數(shù)（包括年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期、分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）之間關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAT 10的表達(dá)與腫瘤的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。臨床分期Ⅲ+Ⅳ期的結(jié)直腸癌中FAT 10表達(dá)明顯高于臨床分期Ⅰ+Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌更易于表達(dá)FAT 10。這些在一定程度上說(shuō)明了FAT 10與結(jié)直腸癌的惡性程度及癌細(xì)胞的侵襲、增殖密切相關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)AT 10作為一個(gè)泛素樣修飾蛋白，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)FAT 10在結(jié)直腸癌中表達(dá)增高，且與結(jié)直腸癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，深入研究探討FAT 10在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，尤其是其與細(xì)胞周期的關(guān)系，明確FAT 10在結(jié)直腸癌中的診斷、預(yù)后及治療價(jià)值將是十分必要的，這也是我們下一步研究的目標(biāo)。

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