于乃超，任志勇，宋君，王輝，魏長(zhǎng)月

（1.陽(yáng)光融和醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 261000；2.中國(guó)人民解放軍第89醫(yī)院 全軍創(chuàng)傷骨科研究所創(chuàng)傷骨科，山東 濰坊 261021）

Ilizarov外固定架由前蘇聯(lián)醫(yī)學(xué)專家Gavriil Ilizarov于1952年在西伯利亞庫(kù)爾干設(shè)計(jì)[1]，該技術(shù)可用于解決骨折延遲愈合、骨矯形康復(fù)、肢體短縮等多個(gè)方面的難題。然而牽拉成骨技術(shù)也會(huì)產(chǎn)生一些令人頭疼的臨床問題，比如針道感染、術(shù)后護(hù)理程序繁瑣、周期長(zhǎng)、新生骨質(zhì)量差以及再次骨折需重新手術(shù)內(nèi)固定等弊端。在Ilizarov技術(shù)中，怎么保證截骨延長(zhǎng)區(qū)的成骨質(zhì)量及成骨速度，大量學(xué)者做了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。安全、有效地加快牽拉成骨的礦化進(jìn)程成為該領(lǐng)域目前研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。EI-Bialy等曾做過系列研究報(bào)道，骨再生、新生骨形成在經(jīng)過系統(tǒng)的低強(qiáng)度脈沖超聲波 (Low-Intensity Pulsed Ultrasound Stimulation，LIPUS)治療后，具有顯著的促進(jìn)愈合作用。自上個(gè)世紀(jì)80年代，Duarte研究了多種超聲頻率信號(hào)對(duì)骨折愈合速度及新生骨形成質(zhì)量的影響，結(jié)果證明所有對(duì)骨愈合有效的均為低強(qiáng)度脈沖超聲波，并且證實(shí)了每天15 min低強(qiáng)度的治療顯著提高了骨折愈合部位的骨強(qiáng)度[2]。近年來國(guó)外創(chuàng)傷研究學(xué)者對(duì)LIPUS引起了高度重視，這方面的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)取得一些進(jìn)展，盡管國(guó)外有些學(xué)者研究超聲治療骨延長(zhǎng)的臨床效果，但是時(shí)間較短，多為4～6周[3，4]，長(zhǎng)時(shí)間的愈合情況隨訪結(jié)果以及生物力學(xué)方面的研究評(píng)價(jià)鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及材料

中國(guó)成年家兔60只，體重1.5～2.0 kg，雌雄不限，由菏澤醫(yī)專動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。采用標(biāo)準(zhǔn)化單籠飼養(yǎng)管理，統(tǒng)一飼料喂養(yǎng)，同等采光通風(fēng)條件，自由飲水。隨機(jī)分兩組：實(shí)驗(yàn)組：低強(qiáng)度脈沖超聲波治療；對(duì)照組：不做干預(yù)。

低強(qiáng)度超聲骨折治療儀：Smith＆Nephew低強(qiáng)度超聲骨折治療儀，其強(qiáng)度為30 mw/cm2，工作頻率為1.5 MHz，脈沖寬度為200 μs，重復(fù)頻率為l kHz。

1.2 動(dòng)物模型的制作

動(dòng)物禁食水，用常規(guī)脫毛劑將左小腿脫毛，測(cè)量左小腿初始長(zhǎng)度，精確測(cè)量脛骨初始全長(zhǎng)。無菌條件下進(jìn)行，兩組均采用氯胺酮肌注麻醉。麻醉起效后術(shù)區(qū)常規(guī)消毒鋪單。取左脛前內(nèi)側(cè)入路，于左脛骨中上1/3處作縱行切口，依次切開，鈍性分離脛前肌，將肌層牽向兩側(cè)予以保護(hù)，暴露脛骨。先在脛骨粗隆下約1.0 cm處縱向?qū)⒚勄肮悄ぷ饕婚L(zhǎng)約1.0 cm切口，在此平面向遠(yuǎn)近端適當(dāng)游離，暴露脛骨，將線鋸由腓側(cè)穿入自脛側(cè)穿出，在干骺端行骨膜外截骨。為了方便放入外固定架，暫時(shí)保留脛骨前外側(cè)1/3骨皮質(zhì)不被鋸斷以維持截面穩(wěn)定性及下肢力線。將外固定架套入兔左下肢，分別在截骨面上下各1.0 cm處垂直打入兩組平行克氏針，用雙邊外固定架固定。固定結(jié)束后將脛骨近端截骨面完全鋸斷，旋緊螺絲帽分別加壓。在脛骨截骨線以遠(yuǎn)0.5 cm水平將腓骨截?cái)?，碘伏、生理鹽水沖洗創(chuàng)口，縫合后包扎固定。術(shù)后連續(xù)5 d注射抗生素預(yù)防感染，于術(shù)后第8天起開始延長(zhǎng)外固定架近端，2次/d，每次牽張0.5 mm，牽張總長(zhǎng)度為1.0 cm（共牽張10 d），隨后固定。骨牽張結(jié)束后固定期第2天，實(shí)驗(yàn)組行低強(qiáng)度脈沖超聲波治療；對(duì)照組則不予處理。

1.3 觀察指標(biāo)

X線攝片觀察：分別于固定期第28天，第56天，第84天拍攝兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)脛骨全長(zhǎng)X線片，仔細(xì)觀察不同時(shí)相段延長(zhǎng)區(qū)的成骨情況。

HE染色組織學(xué)檢查：固定期第28天，第56天，第84天分別于兩組中隨機(jī)抽取8只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在牽張成骨區(qū)內(nèi)取材，HE染色，光鏡下觀察組織學(xué)變化。

骨密度測(cè)定：于固定期第84天將兩組處死的8只動(dòng)物取標(biāo)本，用Hologic QDR-2000雙能X線骨密度儀（中國(guó)人民解放軍第89醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心）進(jìn)行骨密度測(cè)定。

扭轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：在固定期第84天，每組隨機(jī)抽取8只行力學(xué)實(shí)驗(yàn)，測(cè)量最大扭矩，扭轉(zhuǎn)角，計(jì)算抗扭強(qiáng)度及剛度：Tb(抗扭強(qiáng)度)=Mn(最大扭矩)/Wn(抗扭截面模量)，GJP(抗扭剛度)=Mn·l(長(zhǎng)度)/θ(扭轉(zhuǎn)角)。

2 結(jié)果

2.1 X線攝片觀察

固定期第28天：X線示兩組延長(zhǎng)區(qū)均可見少量模糊低密度骨痂影，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組骨痂密度略高（圖 1）。

圖1，2兩組固定期第28天X線片

圖3,4兩組固定期第56天X線片

圖5,6兩組固定期第84天X線片

圖7,8兩組固定期第28天牽張間隙新生骨組織（HE 染色×100）

圖9,10兩組固定期第56天牽張間隙新生骨組織（HE 染色×100）

圖11,12兩組固定期第84天牽張間隙新生骨組織（HE 染色×200）

固定期第56天：X線示兩組新骨密度及數(shù)量均增加并充填于整個(gè)延長(zhǎng)區(qū)，延長(zhǎng)區(qū)內(nèi)出現(xiàn)少量縱行排列的條索狀或片狀新骨影，骨延長(zhǎng)區(qū)新生骨骨痂影由截骨斷端向中央生長(zhǎng)，遠(yuǎn)近截骨斷端有模糊的新生皮質(zhì)骨征象。實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組放射狀透光區(qū)減弱（圖 2）。

固定期第84天：實(shí)驗(yàn)組髓腔通暢，骨折線消失，骨皮質(zhì)完整，相比之下對(duì)照組骨折線稍顯模糊，部分皮質(zhì)骨發(fā)育不良（圖3）。

2.2 HE染色觀察

固定期第28天：對(duì)照組可見炎性細(xì)胞減少，破骨細(xì)胞減少；實(shí)驗(yàn)組可見炎性細(xì)胞減少，破骨細(xì)胞減少，少量纖維軟骨骨痂形成（圖4）。

固定期第56天：實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組軟骨骨痂向骨性骨痂轉(zhuǎn)變明顯，骨細(xì)胞較肥大，鈣鹽沉積均勻（圖5）。

固定期第84天：實(shí)驗(yàn)組新生骨組織主要以板層骨為主，骨痂形成改建過程成熟；對(duì)照組主要以編織骨為主，骨髓腔進(jìn)一步改建，相對(duì)實(shí)驗(yàn)組落后（圖6）。

2.3 骨密度測(cè)定

骨密度測(cè)定結(jié)果用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)程序在電子計(jì)算機(jī)上行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組差異有顯著性（P＜0.05）。兩組骨密度值排列順序?yàn)椋簩?shí)驗(yàn)組＞對(duì)照組(表1)。

表1 兩組骨密度測(cè)試結(jié)果比較（配對(duì)t檢驗(yàn)）

2.4 生物力學(xué)測(cè)試

在固定期第84天，每組隨機(jī)抽取8只行力學(xué)實(shí)驗(yàn)，測(cè)量最大扭矩，扭轉(zhuǎn)角計(jì)算抗扭強(qiáng)度及剛度。結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)程序在電子計(jì)算機(jī)上行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組載荷強(qiáng)度較大（表2）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)骨密度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明超聲治療可以明顯提高骨密度，促進(jìn)骨折愈合。

表2 兩組扭力測(cè)試結(jié)果比較±s)

表2 兩組扭力測(cè)試結(jié)果比較±s)

Group Mn(kg·cm) Tb(g/mm2) GJP(gcm2/ 度) θ(度 /cm)（最大扭矩） （抗扭強(qiáng)度） (抗扭剛度) （單位長(zhǎng)度扭轉(zhuǎn)角）對(duì)照組 10.05±0.65 1543.54±10.62 3345.13±506.64 1.8630±0.25實(shí)驗(yàn)組 14.13±0.47 1924.23±11.19 5213.00±537.28 3.2066±0.26

3 討論

3.1 低強(qiáng)度超聲促進(jìn)骨折修復(fù)的作用及其機(jī)制

超聲波穿過和進(jìn)入生物組織是由機(jī)械能量形式實(shí)現(xiàn)的，被作為診斷和治療工具廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。最新研究表明，當(dāng)機(jī)械負(fù)荷在低能量(5microstrain)高頻(30 Hz)的時(shí)候?qū)墙M織可產(chǎn)生應(yīng)答[5]。此外低強(qiáng)度脈沖超聲波引起的機(jī)械負(fù)荷不能誘導(dǎo)正常骨產(chǎn)生適應(yīng)性效應(yīng)[6,7]。但迄今為止低強(qiáng)度脈沖超聲波可促進(jìn)骨折愈合及新生骨形成的生物學(xué)原理和機(jī)制仍不是很清楚。認(rèn)為與超聲波可能導(dǎo)致骨質(zhì)中靜態(tài)壓力變化有關(guān)。本研究是LIPUS模型在兔下肢骨建立，操作并不復(fù)雜，但是也受能量限制和多方面參數(shù)影響。另外我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過LIPUS治療后BMP-2信使核糖核酸和蛋白質(zhì)的表達(dá)增加，可以促進(jìn)成骨作用和增強(qiáng)生物力學(xué)強(qiáng)度、剛度。實(shí)驗(yàn)證明可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞活動(dòng)及骨形成，此外，礦物附著率增加，類骨質(zhì)厚度和小脂肪細(xì)胞表達(dá)顯著增加，成骨細(xì)胞的活動(dòng)以及骨組織分化，新骨生成和新生血管分化在骨愈合中發(fā)揮著重要作用。因此，加大LIPUS的應(yīng)用能為現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)及研究提供更有力的說服力。

3.2 低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)新生骨形成的影響

LIPUS能夠顯著促進(jìn)骨延長(zhǎng)區(qū)新骨形成和骨痂改建，當(dāng)骨折或外傷導(dǎo)致的骨缺損后形成于骨折端的復(fù)合組織，在經(jīng)過一系列的轉(zhuǎn)變，直至恢復(fù)原有的強(qiáng)度、剛度。LIPUS還能夠促進(jìn)骨膜增生，形成骨膜新生骨，其X線上顯示為骨皮質(zhì)外面局限性或廣泛性的層狀、帶狀、放射狀的高密度影。LIPUS能產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力，它對(duì)骨的形成影響較大，反復(fù)承受高應(yīng)力時(shí)，骨的大小、形狀和結(jié)構(gòu)可因機(jī)械應(yīng)力的變化而改變，骨密度可以增加，反之骨量將減少。骨折愈合過程中，壓應(yīng)力和張應(yīng)力將有助于骨的形成，而LIPUS能夠持續(xù)緩慢地施加這種壓力。除了促進(jìn)骨折愈合外還可以檢測(cè)骨痂形成，形成系統(tǒng)的評(píng)估參數(shù)，超聲的傳播速度對(duì)新生骨形成骨痂的反射性結(jié)構(gòu)改變是最靈敏的。骨密度掃描儀和X射線分析結(jié)果表明骨礦物質(zhì)沉積的情況，說明LIPUS可以促進(jìn)新生骨形成的礦物質(zhì)沉積以及骨痂塑形改建，被逐漸骨化是一個(gè)非常重要的進(jìn)程，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超聲可以促進(jìn)骨密度鈣質(zhì)沉積，并加速向正常骨密度恢復(fù)。

3.3 低強(qiáng)度超聲治療應(yīng)用的研究進(jìn)展

在過去的十多年中，大量的研究已經(jīng)證實(shí)低強(qiáng)度脈沖超聲波對(duì)于新鮮骨折、延遲愈合和骨不連不愈合以及大段骨質(zhì)缺損 (如截骨術(shù)后)均能促進(jìn)愈合。通過有效的超聲波治療，17 d即可恢復(fù)骨的正常功能，而對(duì)側(cè)無超聲波治療恢復(fù)至正常骨的功能一般在損傷后的28 d左右[8]。Heckman等率先報(bào)道，利用低強(qiáng)度脈沖超聲波治療下肢骨折，與未經(jīng)超聲處理對(duì)照組相比，骨折愈合的平均時(shí)間縮短了58 d[9]。Kristiansen（克里斯坦森）等發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，結(jié)合臨床有效的低強(qiáng)度脈沖超聲波治療，能夠使橈骨遠(yuǎn)端骨折的影像學(xué)和臨床愈合時(shí)間平均縮短37 d[10]。近年來，Mayr（邁爾）等證實(shí)治療舟狀骨骨折運(yùn)用低強(qiáng)度脈沖超聲波可提前19 d治愈[11]。對(duì)這些臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，表明低強(qiáng)度脈沖超聲波能使脛骨、橈骨和舟狀骨骨折的臨床愈合時(shí)間縮短30%～38%。LIPUS是一種非侵入的治療方式，呈現(xiàn)低毒性、低免疫性，而且具有高度針對(duì)選擇性，且在實(shí)驗(yàn)中可被反復(fù)使用，盡管LIPUS療法已經(jīng)廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，比如外科手術(shù)和骨創(chuàng)傷修復(fù)，其潛在可用性仍在初始階段，似乎LIPUS在骨組織的影響很好理解，但是文字資料仍匱乏。

許多研究已經(jīng)表明，LIPUS有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，這主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：⑴超聲波具有穿透性且不形成創(chuàng)傷，可進(jìn)入和穿過生物組織，也可體外進(jìn)行。⑵有效性：具有較好的臨床效果，本實(shí)驗(yàn)可證實(shí)。⑶安全性：局部和全身治療均無損害。⑷操作方便，操作時(shí)間短。除了以上應(yīng)用外，低強(qiáng)度脈沖超聲具有在運(yùn)動(dòng)損傷康復(fù)中的應(yīng)用潛力。發(fā)現(xiàn)合適的超聲頻率、強(qiáng)度及范圍，并采取相應(yīng)的處理，將更大程度地發(fā)揮超聲波的治療作用，減少副作用，是實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵。治療期間，單次持續(xù)時(shí)間不同的條件下，取得骨折愈合良好的效果才是推廣超聲的基礎(chǔ)。超聲促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制至今還不是很清楚，但這一結(jié)論和超聲強(qiáng)度、頻率、治療方案是否有關(guān)，或合并有其他因素仍有待證實(shí)。自LIPUS首次被報(bào)道用于治療骨不連、骨缺損成功案例之后并在臨床應(yīng)用，取得了一定療效，治愈率顯著提高。本研究的意義在于：⑴LIPUS可以促進(jìn)骨折生物力學(xué)特性的恢復(fù)，在牽張成骨應(yīng)用中可促進(jìn)新生骨形成，提供了超聲治療的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。⑵為骨矯形、大段骨缺損、骨不愈合的治療提供了一個(gè)新的方法。

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