李兆坤， 王鳳寰， 陳 彬， 蔣思萍， 徐愛國

(1.北京工商大學(xué) 食品學(xué)院, 北京 100048; 2.西藏自治區(qū)高原生物研究所, 西藏 拉薩 850001)

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青藏高原珍稀大型真菌亞東木耳菌絲發(fā)酵條件研究

李兆坤1,2， 王鳳寰1，*， 陳 彬2，*， 蔣思萍2， 徐愛國2

(1.北京工商大學(xué) 食品學(xué)院, 北京 100048; 2.西藏自治區(qū)高原生物研究所, 西藏 拉薩 850001)

為了更好地開發(fā)利用西藏珍稀大型真菌亞東木耳，對亞東木耳菌絲生長和次級代謝條件進(jìn)行研究?？疾炝瞬煌囵B(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對亞東木耳菌絲生長速度、生物量和次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，可溶性淀粉、酵母浸粉和CaCl2分別為亞東木耳生長代謝的較佳碳源、氮源和無機鹽，維生素B1、B2對菌絲生長無明顯促進(jìn)作用。較佳培養(yǎng)溫度為26 ℃，較佳培養(yǎng)時間為63 d，菌絲生長較佳初始pH值為7.0，較佳次級代謝初始pH值為6.0。HPLC圖譜分析結(jié)果表明，次級代謝產(chǎn)物種類多達(dá)200余種，其中初始pH值和溫度條件對次級代謝多樣性的影響較為明顯。

大型真菌； 亞東木耳； 培養(yǎng)條件； 次級代謝； HPLC分析

大型真菌是菌物界真菌門肉眼可見的一類真菌，菌物種類繁多，全世界約有150多萬種，按功能一般分為藥用真菌和食用真菌[1]。有一些大型真菌(如猴頭菇，香菇等)既可食用又具有醫(yī)療保健作用，即為食藥兼用真菌[2]。從工業(yè)生產(chǎn)角度來說，研究食藥用大型真菌的發(fā)酵和次級代謝，對于開發(fā)菌絲體粉末保健品、食品添加劑以及含有次級代謝產(chǎn)物的藥品具有重要意義。

亞東木耳是一種珍稀的食藥兼用野生經(jīng)濟(jì)真菌，因產(chǎn)于西藏亞東縣而得名，近幾年備受關(guān)注。亞東木耳生長在峨眉薔薇(Rosa omeiensis)科枯樹枝上，經(jīng)鑒定屬于黑耳屬(Exidiasp.)真菌[3]，且味道鮮美、營養(yǎng)豐富，被譽為“植物肉、素中之葷”。2012年，亞東木耳的市售價格已達(dá)到4 000元/kg，成為當(dāng)?shù)鼐用裨鍪盏囊粋€重要渠道，但同時也出現(xiàn)了過渡采挖現(xiàn)象，導(dǎo)致其產(chǎn)量逐漸下降。為了更好地利用該野生菌資源，對亞東木耳菌絲進(jìn)行人工培養(yǎng)并進(jìn)一步研究其活性次級代謝，具有重要意義。

目前尚未見亞東木耳菌絲培養(yǎng)研究的相關(guān)報道。本研究擬考察碳源、氮源、無機鹽、生長因子、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等條件對亞東木耳菌絲生長和次級代謝的影響，以期獲得了亞東木耳快速生長的營養(yǎng)和環(huán)境條件以及適宜的菌絲次級代謝培養(yǎng)條件；利用高效液相色譜分析技術(shù)對亞東木耳菌絲次級代謝產(chǎn)物多樣性進(jìn)行定性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種，亞東木耳(Exidiasp.)，從西藏亞東縣采集長有亞東木耳子實體的樹枝，通過無菌操作將子實體表面消毒、切成碎片后，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)出無污染、生長健壯的菌絲體，經(jīng)多次純化獲得原始菌種材料[4]。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定亞東木耳屬于黑耳屬(Exidiasp.)真菌。

葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、水解乳蛋白均為生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；(NH4)2SO4、KNO3、KCl、CaCl2、ZnCl2、MgSO4、FeSO4、Fe2(SO4)3均為分析純，北京化工廠；維生素B1、B2均為實驗試劑；乙腈(色譜純)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；乙酸乙酯(分析純)、甲醇(分析純)，北京化工廠；馬鈴薯、超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA- CW型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YXQ- LS- 100SII型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司；DL- CJ- 2N型潔凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH- 250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG- 9246A型真空干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；RE- 5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LaboStar 7 TWF UV型超純水器，Evoqua Water Technologies Company；1100型高效液相色譜儀(四元梯度泵，檢測器，Agilent1100工作站)，Agilent公司；Symmetry C18型色譜柱，Waters公司。

1.3 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)[5]。

種子培養(yǎng)基：改良的PD(馬鈴薯葡萄糖)培養(yǎng)基，在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入酵母粉0.2%，MgSO40.1%，維生素B110 mg/L[6]。

基本培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母粉2 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO41 g/L，維生素B10.01 g/L，固體培養(yǎng)基含有瓊脂1.5%[7]。

1.4 實驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基因素對菌絲生長和次級代謝影響實驗

分別以可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖作為碳源，替換基本培養(yǎng)基(固體)中的葡萄糖[8]，于平板中間接種約0.5 cm見方的菌塊，26 ℃下靜置培養(yǎng)。一周后每3 d測量菌絲半徑一次，并觀察菌絲形態(tài)，考察不同碳源對菌絲生長速率的影響。在500 mL三角瓶中，配制200 mL基本培養(yǎng)基，分別以可溶性淀粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖作為碳源，替換基本培養(yǎng)基(液體)中的葡萄糖，自然pH值，于26 ℃恒溫箱內(nèi)靜置培養(yǎng)55 d，考察不同碳源對菌絲生長量及次級代謝的影響。

分別以牛肉膏、蛋白胨、水解乳蛋白、(NH4)2SO4，KNO3作為氮源，替換基本培養(yǎng)基(固體)中的酵母粉[9]，培養(yǎng)及測量方法同碳源對菌絲生長影響實驗，考察不同氮源對菌絲生長速率的影響。分別以牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀作為氮源替換基本培養(yǎng)基(液體)中的酵母粉，其他條件同上，考察不同氮源對菌絲生長量及次級代謝的影響。

分別以KCl、CaCl2、ZnCl2、FeSO4、Fe2(SO4)3，替換基本培養(yǎng)基(液體)中MgSO4，其他條件同上，考察不同無機鹽對菌絲生長量及次級代謝的影響。

配制PDA培養(yǎng)基，加入不同生長因子(維生素B1、B2)，無生長因子培養(yǎng)基作為空白對照。于平板中央接種約0.5 cm見方的菌塊，26 ℃下靜置培養(yǎng)。1周后每3 d測量菌絲半徑1次，并觀察菌絲形態(tài)。實驗均作3組平行。

1.4.2 環(huán)境因素對菌絲生長及次級代謝影響實驗

在500 mL三角瓶中，加入200 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1 mol/L的HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0五個梯度，每個梯度設(shè)置兩組平行，接種菌齡30 d菌種。置于26 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)55 d，考察培養(yǎng)基初始pH值對菌絲生長及其次級代謝的影響。

分別設(shè)置20，22，24，26，28，30 ℃五個溫度梯度，自然pH值，其他條件同初始pH值，考察溫度對菌絲生長及次級代謝的影響。

利用米飯作為固體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。設(shè)置時間為35，42，49，56，63 d五個時間梯度，室溫下靜置培養(yǎng)，考察不同培養(yǎng)時間對次級代謝的影響。以上實驗均作3組平行。

1.4.3 菌絲收集及代謝產(chǎn)物處理

菌絲收集：采用6層紗布過濾并剝落黏質(zhì)菌絲的方法。菌絲自然風(fēng)干至質(zhì)量不變時，稱重。

菌絲發(fā)酵液的處理：用與發(fā)酵液同等體積的乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯相進(jìn)行減壓濃縮，得到濃縮液。待溶劑揮干，用50～60 ℃沸程石油醚處理，去除低極性次級代謝物(油脂類)，38 ℃真空干燥36 h后稱重。將干菌絲用5 mL甲醇浸泡后超聲(200 W，10 min)提取3次，得到的提取液濃縮后與發(fā)酵濃縮液合并。

固體發(fā)酵基質(zhì)處理：用甲醇- 氯仿- 乙酸乙酯混合溶液 (三者體積比為1∶1∶1)浸泡基質(zhì)，超聲浸提15 min，重復(fù)3次。浸提液經(jīng)減壓濃縮得到濃縮液，并用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯相經(jīng)減壓濃縮得到代謝產(chǎn)物粗提取物。

1.4.4 菌絲發(fā)酵次級代謝產(chǎn)物高效液相分析

根據(jù)次級代謝產(chǎn)物質(zhì)量加入相應(yīng)體積的甲醇進(jìn)行溶解，使代謝產(chǎn)物樣品質(zhì)量濃度均為0.02 g/mL。每個樣品中加入50 μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的亞東木耳次級代謝產(chǎn)物YE- 1(純度>95%)作為參照物。樣品溶液經(jīng)0.45 μm有機膜過濾后進(jìn)行液相色譜分析[10]。

C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相乙腈/水體系(乙腈比例變化為：0～40 min 5%～30%，40～70 min 30%～54%，70～86 min 54%～74%，86～92 min 74%～78%，92～105 min 90%～100% ，105～125 min 100%)，流速0.8 mL/min、檢測波長235 nm、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對菌絲生長的影響

2.1.1 不同培養(yǎng)基成分對菌絲生長的影響

在菌絲生長過程中，前5～7 d為環(huán)境適應(yīng)期，生長較緩慢，7 d后大多數(shù)菌絲已萌發(fā)進(jìn)入生長狀態(tài)。葡萄糖和麥芽糖作為簡單碳源，對菌絲快速生長最為有利，但最終菌絲強度稍弱，生物量較低，而可溶性淀粉作為大分子底物，可為菌絲生長提供長效碳源，更利于生物量的積累。在液體培養(yǎng)基中，以可溶性淀粉作為碳源獲得最大生物量，為0.427 g(見表1)。

表1 不同碳源對菌絲生長的影響

++++菌絲強度強，+++菌絲強度較強，++菌絲強度較弱，下表同。菌絲強弱包括菌絲粗細(xì)和菌絲致密程度。

菌絲在不同氮源中生長速度差異較大，菌絲生長速度由快到慢依次為酵母粉、硝酸鉀、牛肉膏、蛋白胨、水解乳蛋白，菌絲強弱依次為酵母浸粉=蛋白胨>硫酸銨>牛肉膏≥水解乳蛋白>硝酸鉀，其中在硝酸鉀為氮源的平板瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲幾乎呈透明態(tài)，極其稀疏細(xì)弱。液體發(fā)酵實驗同樣表明酵母粉是亞東木耳菌絲培養(yǎng)的最適氮源。培養(yǎng)到48 d時，酵母和牛肉膏培養(yǎng)基中菌絲最先出面，到55 d停止培養(yǎng)時，酵母浸粉培養(yǎng)基中菌絲已覆蓋整個液面，培養(yǎng)基顏色呈深褐色，在此氮源條件下菌絲達(dá)到最大干重為0.294 g(見表2)。

表2 不同氮源時菌絲生長情況

*表示截止到最終記錄日期菌絲未長滿。

在CaCl2培養(yǎng)基中達(dá)到最大生物量為0.292 g，相對于其他實驗金屬離子來說， Ca2+最適合亞東木耳菌絲生長。而當(dāng)培養(yǎng)基中加入Fe、Zn微量元素時，菌絲不生長(見表3)，一種可能原因是微量元素含量過高抑制菌絲生長，另一種可能是兩種微量元素本身對菌絲有抑制作用，可通過加入不同濃度微量元素進(jìn)一步驗證。

表3 不同無機鹽下的菌絲質(zhì)量

有文獻(xiàn)報道，B族維生素對擔(dān)子菌菌絲生長多有促進(jìn)作用[11-13]，本實驗測定維生素B1、B2對亞東木耳生長的影響。在亞東木耳菌絲培養(yǎng)過程中，兩種B族維生素作為生長因子，菌絲長勢相差不大(見圖1)，因此認(rèn)為維生素B1、B2對亞東木耳菌絲生長速度和菌絲強弱沒有影響。

圖1 維生素B1、B2培養(yǎng)基中菌絲生長趨勢Fig.1 Growth trend of hyphae in culture mediums including vitamin B1 and B2

2.1.2 環(huán)境因素對菌絲生長的影響

在pH值小于7.0時，菌絲生長量呈遞增趨勢，pH值為7.0時，菌絲生長量最大，pH值為8.0時菌絲量略有下降，因此pH值7.0為菌絲生長的最適宜初始pH值(見表4)。

根據(jù)觀察，菌絲生長到20 d，不同溫度條件下的生長狀態(tài)已有明顯區(qū)別。24，26，28 ℃時液面下菌絲已開始結(jié)成大塊絮狀，22 ℃時菌絲略有結(jié)絮現(xiàn)象，較小成片，而30 ℃時菌絲只是在原菌種基礎(chǔ)上生長少量。由此可知，亞東木耳在26 ℃條件下最適宜生長(見表4)。

表4 不同初始pH值和溫度下菌絲質(zhì)量

2.2 不同因素對菌絲次級代謝的影響

2.2.1 不同培養(yǎng)基成分對菌絲次級代謝的影響

可溶性淀粉、酵母浸粉、CaCl2分別為獲得最多次級代謝產(chǎn)物的碳、氮源和無機鹽(見表5)。與菌絲生物量結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，該結(jié)果與菌絲生物量結(jié)果一致，說明菌絲生長狀況好時，其次級代謝也越充分。

2.2.2 環(huán)境因素對菌絲次級代謝的影響

初始pH值為6.0條件下次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最大，與菌絲生物量結(jié)果不一致(見表4、表6)，不同初始pH值時的菌絲生物量和次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量結(jié)果表明，中性偏堿性條件更適合亞東木耳菌絲生長，中性偏酸性條件更適合菌絲代謝。菌絲在26 ℃時最大次級代謝產(chǎn)物量為0.063 g(見表6)，與菌絲生物量結(jié)果一致，因此，26 ℃為亞東木耳最適生長和次級代謝溫度。

表5 不同營養(yǎng)條件下次級代謝產(chǎn)物質(zhì)量

表6 不同環(huán)境條件下次級代謝產(chǎn)物質(zhì)量

時間因素中，利用熟米飯基質(zhì)對大型真菌進(jìn)行固體發(fā)酵培養(yǎng)，避免液體培養(yǎng)中由于時間過長而導(dǎo)致的水分大量蒸發(fā)，此方法所得產(chǎn)物稱為菌質(zhì)。真菌在該基質(zhì)上可快速布滿并進(jìn)行代謝，產(chǎn)生各種生理活性物質(zhì)，同時其胞外酶系又可以對基質(zhì)中的化學(xué)成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，從而使菌質(zhì)中有豐富的化學(xué)成分[14]。在考察時間范圍內(nèi)，菌絲代謝物產(chǎn)量隨時間增加而增加，雖然63 d內(nèi)次級代謝產(chǎn)物量呈現(xiàn)上升趨勢，但培養(yǎng)到63 d時，基質(zhì)水分已嚴(yán)重下降，不利于菌絲繼續(xù)生長代謝。利用大米發(fā)酵亞東木耳，63 d為較合適的培養(yǎng)時間。

2.3 菌絲次級代謝HPLC圖譜分析

對不同環(huán)境因素下次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行HPLC圖譜分析，在相同色譜條件下比較其代謝產(chǎn)物差異性。取各單因素實驗中次級代謝產(chǎn)物質(zhì)量最多的樣品作為研究對象，即時間單因素實驗，取49，56，63 d條件下得到的3組樣品作為分析對象；初始pH值單因素實驗，取pH值為5.0，6.0，7.0條件下得到的3組樣品作為分析對象；溫度單因素實驗，取24，26，28 ℃條件下得到的3組樣品作為分析對象。

在235 nm波長處有紫外光吸收的亞東木耳次級代謝產(chǎn)物十分豐富(見表7)，200 mL發(fā)酵液提取出的次級代謝產(chǎn)物中，高效液相色譜可檢測到多達(dá)200余種化合物。溫度因素中26 ℃條件下峰數(shù)量最多；初始pH值為7.0條件下峰數(shù)量最多；時間因素中35 d和42 d時峰數(shù)量分別為167個和186個，與表7中列出的49 d的202個峰數(shù)量相差較大，而56 d和63 d的樣品峰數(shù)量與49 d的相差不大，因此，可推知菌絲在49 d時代謝已較為充分。

以亞東木耳發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到的化合物YE- 1作為標(biāo)準(zhǔn)品，其峰作為參照峰，計算相對保留時間α(公式α=tdi/tds,其中tdi為不定峰i的保留時間，tds為參照物的保留時間)，由此可得到同一因素不同水平下圖譜中相同峰信息[15]。

以相似峰數(shù)量與各條件中最多峰數(shù)的比值作為相似峰百分比(見表8)，用于說明同一因素不同水平間代謝差異性。從表8中可知，溫度單因素中相同峰百分比為29.6%，初始pH值單因素中相同峰百分比為21.5%，其代謝差異性相對較大，說明初始pH值和溫度因素對亞東木耳次級代謝多樣性影響較為顯著。

HPLC圖譜能夠在一定程度上反映不同因素、水平下代謝產(chǎn)物的多樣性，從而對大型真菌培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的獲得具有一定指導(dǎo)意義。由于本實驗中樣品為發(fā)酵原產(chǎn)物，化合物種類數(shù)量龐大，進(jìn)行圖譜分析有一定困難，因此，采用HPLC法只能實現(xiàn)定性分析，且不可避免地存在主觀誤差[16]。

表7 不同環(huán)境因素下所有峰數(shù)量

表8 不同影響因素下相同峰數(shù)量及與總峰數(shù)比值

3 結(jié) 論

探索了食藥兩用大型真菌亞東木耳菌絲生長代謝的優(yōu)化條件。研究表明，菌絲生長和代謝的優(yōu)化條件為：碳源為可溶性淀粉，氮源為酵母浸粉，無機鹽為CaCl2，溫度為26 ℃，菌絲代謝初始pH值為6.0，菌絲生長初始pH值為7.0，時間為63 d。溫度和初始pH值對亞東木耳菌絲次級代謝差異性影響較為顯著，因此，通過適當(dāng)控制亞東木耳的培養(yǎng)溫度和初始pH值有利于獲得豐富的次級代謝產(chǎn)物。文獻(xiàn)報道，亞東木耳具有一定的寄主專一性[3]。實驗表明，亞東木耳生長周期漫長，因此要獲得其適宜的培養(yǎng)條件，還需要進(jìn)一步探究。

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(責(zé)任編輯：葉紅波)

Study on Fermentation Conditions of Rare Yadong Edible Fungus in Tibetan Plateau

LI Zhaokun1,2, WANG Fenghuan1,*, CHEN Bin2,*, JIANG Siping2, XU Aiguo2

(1.BeijingTechnologyandBusinessUniversity,Beijing100048,China; 2.TibetPlateauInstituteofBiology,Lasa850001,China)

In order to utilize and develop the rare Yadong edible fungus(Exidiasp.) better, the growth and metabolism culture conditions of the mycelium were explored. Effects of the culture mediums and the different conditions on mycelium growth rate, biomass, and secondary metabolites production were investigated. The results showed that glucose was the most suitable carbon source for mycelial growth, and soluble starch was the most suitable carbon source to obtain maximum biomass and metabolic product yield. Yeast extract was the most suitable nitrogen source for growth and metabolism. CaCl2was the optimal inorganic salt while vitamin B1and B2had no significant effects on promoting mycelial growth. HPLC fingerprint results showed that compounds of secondary metabolites were as many as 200 kinds and initial pH and temperature factors had more obvious influences on the secondary metabolic diversity.

edible fungus; Yadong edible fungus; culture conditions; secondary metabolism; HPLC analysis

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.02.008

2095-6002(2017)02-0051-07

李兆坤，王鳳寰，陳彬，等. 青藏高原珍稀大型真菌亞東木耳菌絲發(fā)酵條件研究[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2017,35(2):51-57. LI Zhaokun, WANG Fenghuan, CHEN Bin, et al. Study on fermentation conditions of rare Yadong edible fungus in Tibetan plateau[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(2):51-57.

2016-07-05

2014年西藏自治區(qū)科技計劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目“高原地區(qū)雙孢菇栽培技術(shù)研究與菌絲發(fā)酵及次生代謝活性分析”。

李兆坤，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)；

*王鳳寰，男，副教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究，通信作者；

*陳 彬，男，副研究員，博士，主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)方面的研究，通信作者。

TS255; TS201.3

A