孫鈺林，申一鳴，梁積新，陳玉清，沈浪濤,*

1.中國原子能科學(xué)研究院 國家同位素工程技術(shù)研究中心，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413

64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA:靶向葉酸受體陽性腫瘤的PET/MRI雙模態(tài)顯像探針

孫鈺林1,2，申一鳴1,2，梁積新1，陳玉清1,2，沈浪濤1,2,*

1.中國原子能科學(xué)研究院 國家同位素工程技術(shù)研究中心，北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413

報道了一種可用于葉酸受體陽性腫瘤顯像的PET/MRI雙模態(tài)顯像探針(64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA)的合成、初步的生物學(xué)評價及PET/CT和MRI顯像結(jié)果。該探針由包覆了生物相容性的聚乙二醇(poly ethylene glycol, PEG)、超順磁氧化鐵納米粒子(superparamegnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs)、葉酸(folic acid, FA)、1，4，7，10-四乙酸-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid, DOTA)和正電子放射性核素64Cu組成。經(jīng)純化后，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA放化純大于98%。荷KB裸鼠體內(nèi)分布顯示：64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在肝臟、脾臟和肺中的放射性攝取較高，與非靶向標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH比較，其對KB細胞瘤有明顯的靶向作用。在MRI和PET/CT模式下，KB腫瘤能被較清晰地顯像。64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA作為KB細胞腫瘤的PET/MRI雙模態(tài)顯像劑，有待于進一步深入研究以改善其標記率、穩(wěn)定性和比活度等。

PET/MRI雙模態(tài)顯像探針；超順磁性氧化鐵納米粒子；葉酸；DOTA；64Cu

近期的研究報告指出，2012年全球新增1 400萬癌癥病人并有820萬病人死亡。其中，中國新增307萬癌癥病人并約有220萬人死亡。癌癥的早期診斷和有效治療可以降低大約每年1/3至1/2(即240萬～370萬)癌癥病人的死亡[1]。腫瘤早期診斷和靶向治療藥物的設(shè)計是利用各種腫瘤生物標志物(如特異性受體、單克隆抗體及其片段、多肽等)來實現(xiàn)的[2]。在許多腫瘤(如卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、腎癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和腦癌)中葉酸受體(folate receptor，F(xiàn)R)被過度表達。因此，葉酸受體是與這些腫瘤密切相關(guān)的靶標。人們已開展了以葉酸受體為靶向的各種腫瘤放射性顯像藥物的研究[3-4]。然而，無論是單光子發(fā)射計算機斷層成像(SPECT)還是正電子發(fā)射斷層成像(PET)的單模態(tài)顯像技術(shù)，盡管它們具有高靈敏度等優(yōu)點，但其空間分辨率較低。因此，融合了兩種顯像模態(tài)的SPECT/電子計算機斷層掃描(CT)、PET/CT已在臨床中得到了廣泛應(yīng)用。PET/磁共振成像(MRI)雙模態(tài)顯像技術(shù)既具有高靈敏度和高軟組織對比度，而且與PET/CT相比，還顯著降低了輻射劑量，已成為具有廣闊應(yīng)用前景的雙模態(tài)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)。目前，全球約有70臺PET/MRI已投入臨床使用[5]。用于PET/MRI的雙模態(tài)顯像探針也正在研發(fā)中[6-8]。

PET/MRI雙模態(tài)顯像探針既要含有MRI成像組分，還要含有能用于PET顯像的組分，還可能含有靶向分子。表面包覆有聚乙二醇(poly ethylene glycol, PEG)等聚合物的超順磁氧化鐵納米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs)本身既可以作為MRI造影劑，還可以作為構(gòu)建雙(或多)模態(tài)分子影像探針和其它生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的平臺[9-10]。以葉酸受體為靶向的MRI腫瘤對比劑已有一些研究[11-13]，但其PET/MRI雙模態(tài)顯像探針鮮見報導(dǎo)。

本工作擬先合成表面接有3-氨基丙基三乙氧基硅烷的超順磁氧化鐵納米粒子(SPIONs-APTES)；然后，把預(yù)先與葉酸偶聯(lián)的聚乙二醇(FA-PEG)與SPIONs-APTES連接，得到SPIONs-PEG-FA；接著，再將能與正電子核素64Cu牢固結(jié)合的雙功能螯合劑1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid, DOTA)連接到SPIONs-PEG-FA上，獲得DOTA-SPIONs-PEG-FA，進行核素64Cu標記后得到標記物(64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA)(圖1)。最后分別用靶向探針64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA和非靶向探針64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH對荷KB細胞裸鼠進行體內(nèi)生物分布以及PET和MRI顯像的研究。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(dicyclohexylcarbodiimide, DCC)，上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)，Alfa Aesar公司；氨基羧基聚乙二醇(NH2-PEG2000-COOH)，北京希凱創(chuàng)新科技有限公司；葉酸(folic acid, FA)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)、二乙基三胺五乙酸(diethylene triamine pentacetate acid, DTPA)、醋酸銨及其它化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團試劑有限公司；1,4,7,10-四乙酸-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷由本實驗室制備；Whatman 1號層析紙、超濾濃縮離心管(Vivaspin 500, 10 kDa)，美國GE公司；透析袋(MWCO：8 000～14 000)，國藥集團試劑有限公司；透析袋(MWCO：1 000)，佰聚生物；64CuCl2溶液由北京原子高科股份有限公司提供。

圖1 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA

荷KB人口腔表皮樣癌細胞裸鼠，SPF級，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。取4～5周齡Balb/c雌性裸鼠，右前肢腋下接種5×106個KB細胞，待腫瘤平均直徑達到8～10 mm時用于實驗。

FD-80型真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；JEM2100F型透射電子顯微鏡、JMS-T100CS質(zhì)譜儀，日本電子株式會社；Nano ZS動態(tài)光散射粒度分析儀，英國Malvern公司；Affinity-1傅里葉變換紅外光譜儀、UV-2700紫外-可見吸收光譜儀，日本SHIMADAZU公司；BKT-4500Z型振動樣品磁強計，美國Quantum Design公司；ADVANCE Ⅲ 400 MHz核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；AR-2000放射性薄層掃描儀，德國Eckert Ziegler公司；1470-002 γ 計數(shù)器，美國Perkin Elmer公司；7.0 T小動物磁共振成像儀，美國Varian公司；Inveon 小動物PET/CT成像儀，德國Siemens公司。

1.2 納米粒子的合成與表征

從超順磁氧化鐵納米粒子核心的合成開始，經(jīng)六步反應(yīng)合成DOTA-SPIONs-PEG-FA，其反應(yīng)路線示于圖2。

1.2.1 SPIONs的制備 合成反應(yīng)在N2保護下進行。將549 mg FeCl3·6H2O和282 mg FeSO4·7H2O溶于40 mL氮氣飽和水中，攪拌溶解。滴加氨水將pH調(diào)至 9，再將溫度升高到50 ℃，繼續(xù)反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢后，用50 mL除氧水洗滌，磁鐵吸附傾倒，除去銨鹽，重復(fù)3次。產(chǎn)物在60 ℃下真空干燥，得到黑色塊狀固體SPIONs 123 mg(產(chǎn)率為53%)，于4 ℃下保存。

1.2.2 SPIONs-APTES的制備 移取0.5 mL氮氣飽和水和10 mL無水乙醇混合，制備含水量為3%～5%(體積比)的水-乙醇混合溶液，并用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 為4.5～5.5。然后，加入200 μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，活化5 min。再加入86 mg SPIONs，機械攪拌，反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，以20 mL 95%乙醇洗滌，磁鐵吸附傾倒，除去未反應(yīng)的APTES，重復(fù)5次。產(chǎn)物在60 ℃下真空干燥，得到黑色粒狀固體SPIONs-APTES 100 mg，于4 ℃下保存。

1.2.3 FA-NHS的合成 本反應(yīng)在室溫、N2保護和避光下進行。將502 mg 葉酸加入到10 mL無水二甲基亞砜(DMSO)中，攪拌至溶解。再加入250 mg DCC反應(yīng)2 h。將150 mg NHS溶于1 mL無水DMSO中，然后滴加到上述反應(yīng)液中，5 min滴加完畢，在室溫下反應(yīng)過夜。將粗產(chǎn)物過濾除去沉淀，在40 ℃下將濾液減壓濃縮30 min，再向濾液中滴加無水乙醚∶丙酮=7∶3(體積比，下同)的混合液，至不再生成沉淀為止。過濾，所得固體以50 mL無水乙醚∶丙酮=7∶3的混合液洗滌，重復(fù)3次，于30 ℃下真空干燥，獲得黃色粒狀固體FA-NHS 322 mg(產(chǎn)率為53%)，裝瓶封口后在-20 ℃下保存。

1.2.4 FA-PEG的合成 在室溫、N2保護下，將300 mg NH2-PEG-COOH加入到10 mL DMSO中，再將162 mg FA-NHS溶于2 mL DMSO中，滴加到上述反應(yīng)液中，5 min滴加完畢，再加入150 mgN,N-二異丙基乙基胺，于避光條件下反應(yīng)24 h。粗產(chǎn)物在去離子水中透析(截留分子量(MWCO)=1 000 Da)48 h后凍干，得到黃色泡沫狀固體FA-PEG 267 mg(產(chǎn)率為76%)，裝瓶封口后-20 ℃下保存。

圖2 DOTA-SPIONs-PEG-FA的合成路線示意圖Fig.2 Synthetic scheme of DOTA-SPIONs-PEG-FA

1.2.5 SPIONs-PEG-FA的制備 在N2保護下，將160 mg FA-PEG溶于20 mL無水DMSO中，加入84.8 mg EDC攪拌10 min，再加入24.8 mg NHS攪拌30 min。然后，將50 mg SPIONs-APTES溶于5 mL無水DMSO中，加入上述反應(yīng)液中，反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)透析(MWCO=8 000～14 000)、凍干，得到黑色固體SPIONs-PEG-FA 169 mg，裝瓶封口后在-20 ℃下保存。

1.2.6 DOTA-SPIONs-PEG-FA的制備 稱取50 mg DOTA溶于5 mL水中，9.5 mg EDC溶于1 mL水中，將兩者混合。用0.1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至5，反應(yīng)10 min。將反應(yīng)瓶移至冰浴中，加入9 mg NHS，再用0.1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至5.5，繼續(xù)反應(yīng)30 min。稱取25 mg SPIONs-PEG-FA溶于3 mL水中，加入上述反應(yīng)液中，再用0.1 mol/L NaOH將反應(yīng)液pH值調(diào)至8.5，反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)透析(MWCO=8 000～14 000)、凍干，得到黑色固體DOTA-SPIONs-PEG-FA 28 mg，裝瓶封口后在-20 ℃下保存。

1.2.7 納米粒子的表征 采用傅里葉紅外光譜儀(FTIR)測定納米粒子的紅外光譜。通過動態(tài)光散射(DLS)的方法測量納米粒子的水合動力學(xué)直徑分布。用透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米粒子的形貌。采用振動樣品磁強計(VSM)測定納米粒子的飽和磁化強度、矯頑力和剩磁。用紫外-可見吸收光譜儀(UV)測定各樣品中鐵元素的含量。用小動物核磁共振成像儀掃描不同濃度的樣品，根據(jù)各濃度信號強度擬合出DOTA-SPIONs-PEG-FA的弛豫率。

1.364Cu的標記反應(yīng)

1.3.1 配體濃度對標記率的影響 分別取100 μL溶有1 μg、10 μg、100 μg、1 mg DOTA-SPIONs-PEG-FA的0.1 mol/L醋酸銨緩沖溶液(pH=6.5)，加入到2 mL EP管中，再加入100 μL(約52 MBq)的64CuCl2，渦旋混勻，在40 ℃下孵育45 min，然后用快速薄層層析法測定標記率。

1.3.2 溫度對標記率的影響 取100 μL溶有10 μg DOTA-SPIONs-PEG-FA的0.1 mol/L醋酸銨緩沖溶液，加入到2 mL EP管中，再分別加入70 μL (約37 MBq)的64CuCl2，渦旋混勻，分別在40、60、80、100 ℃下孵育45 min，然后用快速薄層層析法測定標記率。

1.4 標記物的純化和體外穩(wěn)定性

取5 mg的DOTA-SPIONs-PEG-FA溶于500 μL醋酸銨緩沖溶液(pH=6.5)，加入到2 mL EP管中，再加入64CuCl2(約296 MBq)，渦旋混勻，在60 ℃下孵育45 min。

采用超濾濃縮離心管離心的方法進行純化。將標記物移至超濾濃縮離心管上層，在5 000 r/min的條件下離心10 min，棄去下層液體，上層殘余物分別用500 μL 10 mmol/L DTPA和1 mmol/L DTPA溶液洗滌各一次，離心，至下層濾液基本無放射性活度檢出，然后收集上層殘余物。

采用快速薄層層析法(instant thin layer chromatography, ITLC)測定64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA的標記率和放化純度。取2 μL反應(yīng)液點樣于Whatman 1號層析紙上，用φ=10%醋酸銨/甲醇混合液(體積比為50∶50)配制的15 mmol/L EDTA溶液為展開劑展開并用放射型薄層掃描儀掃描，測定標記率或放化純度。

非靶向標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH的標記和純化方法與64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA相同。

將100 μL64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA標記物(約0.37 MBq)，加入到200 μL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH=7.4)中，在37 ℃下溫育，用快速薄層層析法測定標記物在4、12 h的放化純度，觀察標記物的體外穩(wěn)定性。

1.5 荷瘤鼠體內(nèi)生物分布

取18只荷KB細胞裸鼠，隨機分成2組，每組9只。一組經(jīng)尾靜脈注射100 μL溶有64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA(約0.37 MBq)的生理鹽水溶液，另一組經(jīng)尾靜脈注射100 μL溶有64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH(約0.37 MBq)的生理鹽水溶液，并分別在給藥后1、3、6 h各個時間點取3只荷瘤鼠摘眼球取血，繼而斷頸處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、肌肉、股骨、瘤稱重，并用γ計數(shù)器測定放射性計數(shù)，經(jīng)衰變校正后，計算百分注射劑量率 (%ID/g)。

1.6 荷瘤鼠的MRI和PET/CT顯像

取荷KB細胞裸鼠3只，一只作為空白組；一只先經(jīng)尾靜脈注射50 μL FA-PEG(200 μg)進行葉酸受體阻斷，30 min后再注射100 μL DOTA-SPIONs-PEG-FA(20 μg)；一只經(jīng)尾靜脈注射100 μL DOTA-SPIONs-PEG-FA(20 μg)。在給藥后4 h進行MRI顯像。

取荷KB細胞裸鼠3只，一只經(jīng)尾靜脈注射100 μL非葉酸受體靶向標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH(約18.5 MBq)；一只先經(jīng)尾靜脈注射50 μL FA-PEG(200 μg)進行葉酸受體阻斷，30 min后再注射100 μL64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA(約18.5 MBq)；一只經(jīng)尾靜脈注射100 μL64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA(約18.5 MBq)。在給藥后4 h進行PET/CT顯像。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米粒子的合成與表征

首先在N2保護和避光的條件下，將葉酸與過量的DCC和NHS反應(yīng)生成葉酸的活性酯FA-NHS。然后，用一端含有羧酸基團，另一端含有氨基基團的PEG在N，N-二異丙基乙基胺存在下，與FA-NHS偶聯(lián)得到FA-PEG的粗產(chǎn)物并進行透析純化。FA-PEG的1H NMR譜結(jié)果如下：δ= 8.60(1H，N=CH-C，pteridine(a))；7.68，6.62(4H，—C4H4—，Ph(c,d))；4.55(2H,—CH2—(b) )；4.31(1H,CH(e))；3.31～3.50(182H,—CH2CH2O—,PEG(h，i))；2.19～2.38(6H,—CH2—(f，g，j))；2.50(DMSO)[12]。核磁共振氫譜表明，葉酸已與PEG偶聯(lián)。

采取化學(xué)共沉淀法合成氧化鐵納米粒子核心。然后，使用APTES對納米粒子表面進行修飾，利用APTES上的氨基與FA-PEG上的羧基反應(yīng)，得到SPIONs-PEG-FA。最后，將DOTA中的一個羧基活化，并與納米粒子表面剩余的氨基反應(yīng)，得到標記物前體DOTA-SPIONs-PEG-FA。

圖3 SPIONs(a)、SPIONs-APTES(b)、SPIONs-PEG-FA(c)、DOTA-SPIONs-PEG-FA(d)的FTIR光譜Fig.3 FTIR spectra of SPIONs(a), SPIONs-APTES(b),SPIONs-PEG-FA(c), DOTA-SPIONs-PEG-FA(d)

納米粒子的粒徑用透射電鏡進行了觀測。SPIONs-APTES和SPIONs-PEG-FA的TEM圖示于圖4。由圖4可知：SPIONs-APTES為不規(guī)則顆粒，有團聚現(xiàn)象，粒徑介于50～100 nm；與SPIONs-APTES比較，包覆PEG后的納米粒子SPIONs-PEG-FA的分散性和均勻性較好，粒徑明顯增大，粒徑介于100～200 nm。

納米粒子在溶液狀態(tài)中的粒徑分布情況用動態(tài)光散射法進行研究。在水溶液中，SPIONs-APTES和SPIONs-PEG-FA的DLS測定結(jié)果示于圖5。由圖5可知，強度權(quán)重的DLS顯示均為單峰，平均水合動力學(xué)粒徑分別為86 nm和133 nm。其結(jié)果與TEM結(jié)果一致。

通過磁滯回線的研究可以揭示納米材料是否具有超順磁性。SPIONs和DOTA-SPIONs-PEG-FA的磁性測定結(jié)果示于圖6。由圖6可知：其磁滯回線顯示，納米粒子的磁化強度隨外加磁場強度的增大而增大，當(dāng)外加磁場強度增大到一定值(10 G)后，磁化強度的增加趨于平緩并逐漸達到飽和；SPIONs和DOTA-SPIONs-PEG-FA的飽和磁化強度分別為35.6 emu/g和7.9 emu/g，DOTA-SPIONs-PEG-FA的剩磁為0.2 emu/g，幾乎可以忽略不計，說明其具有超順磁性[14-15]。

圖4 SPIONs-APTES(a)和SPIONs-PEG-FA(b)的TEM圖Fig.4 TEM images of SPIONs-APTES(a) and SPIONs-PEG-FA(b)

圖5 SPIONs-APTES(a)和SPIONs-PEG-FA(b)的水合動力學(xué)直徑分布Fig.5 Hydrodynamic size distribution of SPIONs-APTES(a) and SPIONs-PEG-FA(b)

圖6 SPIONs(a)和DOTA-SPIONs-PEG-FA(b)的磁滯回線Fig.6 Hysteresis loops of SPIONs(a) and DOTA-SPIONs-PEG-FA(b)

T2對比劑降低橫向弛豫時間，通過減少組織信號來辨別組織正常與否。有外加磁場時，信號強度減弱，影像變黑，從而產(chǎn)生信號對比，可以辨別組織間的差異。DOTA-SPIONs-PEG-FA中不同鐵濃度時，T2權(quán)重MR的顯像結(jié)果示于圖7。由圖7可知，隨著DOTA-SPIONs-PEG-FA中Fe濃度的增加，MRI圖像的負對比效果越來越明顯，信號強度逐漸減弱，影像逐漸變黑。

根據(jù)不同濃度下弛豫時間的差異擬合獲得兩者之間的線性關(guān)系[16]，其線性方程為y=50.404x+5.514。據(jù)此計算得到該納米粒子的弛豫率R2=55.9 L/(mmol·s)。采用鄰菲羅啉分光光度法測定樣品中鐵的含量[17]。每毫克樣品SPIONs、SPIONs-APTES、SPIONs-PEG-FA、DOTA-SPIONs-PEG-FA中鐵含量分別為667、531、151、129 μg。

圖7 DOTA-SPIONs-PEG-FA中不同鐵濃度時，T2權(quán)重MR的顯像結(jié)果Fig.7 T2-weighted MRI scan of DOTA-SPIONs-PEG-FA at different iron concentrations

上述超順磁性和T2對比效果研究表明，DOTA-SPIONs-PEG-FA可以作為MRI顯像的組分。

2.264Cu的標記

由于64Cu的制備比較復(fù)雜，國內(nèi)64Cu藥物的研究很少。本研究組曾進行了64Cu標記超順磁性氧化鐵納米粒子SPION-DOPA-DOTA/RGD的研究[18]。

2.2.1 配體質(zhì)量對標記率的影響 標記反應(yīng)在醋酸銨緩沖溶液(pH=6.5)、40 ℃下進行，反應(yīng)時間為45 min，考察用52 MBq的64Cu標記時，不同配體(DOTA-SPIONs-PEG-FA)質(zhì)量對標記率的影響，結(jié)果示于圖8(a)。由圖8(a)可知，隨著配體質(zhì)量的增加，標記率顯著提升。當(dāng)配體質(zhì)量為1 μg時，標記率并不理想，僅為2.2%；當(dāng)配體質(zhì)量增加到1 mg時，標記率顯著提高，達到13.2%，但標記率曲線并沒有出現(xiàn)平緩的趨勢。由此推測，造成標記率不高的原因可能是結(jié)合在納米粒子表面的雙功能螯合劑(DOTA)有限，并且結(jié)合的螯合劑還可能被PEG所覆蓋，不利于與64Cu的結(jié)合。考慮到后續(xù)可能進行的小動物PET顯像實驗，必須控制注射液的體積不能過大，選擇100 μL醋酸銨緩沖溶液溶解配體可滿足體積要求。增加配體質(zhì)量可以使標記率顯著提高，但是考慮到配體在醋酸銨緩沖溶液中的溶解度，100 μL的醋酸銨緩沖溶液只能溶解1 mg配體。因此，選擇配體質(zhì)量為1 mg標記52 MBq的64Cu。

(a)——醋酸銨緩沖溶液(pH=6.5)，40 ℃，反應(yīng)時間為45 min，A(64Cu)=52 MBq；(b)——A(64Cu)=37 MBq，m(配體)=10 μg，反應(yīng)時間為45 min圖8 配體質(zhì)量(a)和反應(yīng)溫度(b)對標記率的影響Fig.8 Influences of ligand mass(a) and reaction temperature(b) on labeling efficiency

2.2.2 反應(yīng)溫度對標記率的影響 以37 MBq的64Cu標記10 μg配體，反應(yīng)時間為45 min條件下，考察不同溫度對標記率的影響，結(jié)果示于圖8(b)。參照文獻[19]進行了溫度對標記率影響的研究，將初始溫度設(shè)為40 ℃，標記率僅為4.5%。當(dāng)溫度升至60 ℃時，標記率提高到19.5%。溫度在80～100 ℃，標記率增加不大?？紤]到較高的溫度可造成納米粒子的團聚或表面包覆物的脫落，降低納米粒子的穩(wěn)定性。在實驗中也發(fā)現(xiàn)，在80 ℃時，納米粒子在水溶液中出現(xiàn)了沉淀現(xiàn)象。因此，經(jīng)綜合考慮，選擇60 ℃為標記溫度。

2.3 標記化合物的純化

利用納米粒子具有較大分子量的特點，采取超濾濃縮離心法純化64Cu納米材料的標記物。選取10 kDa的超濾濃縮離心管，經(jīng)離心分離后，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在離心管的上層，而游離的64Cu隨濾液到達離心管的下層。在上層殘余物中加入DTPA溶液，以絡(luò)合殘留的游離64Cu和與納米粒子非特異性結(jié)合的64Cu，離心分離至下層濾液中基本無放射性檢出為止，收集所有濾液。上層殘余物的放射性活度除以上層殘余物和所有濾液的活度之和，即可得到該反應(yīng)的標記率，在優(yōu)化條件下，其標記率為23%。經(jīng)DTPA溶液洗滌純化后的產(chǎn)物用薄層層析法檢測其放射性化學(xué)純度，標記物集中在原點附近，Rf=0～0.1，而游離的64Cu(Rf=0.6～0.7)很少。這說明64Cu已成功標記到DOTA-SPIONs-PEG-FA，且放化純大于98%。

剛開始進行標記物純化時，按文獻[20]進行超濾濃縮離心法純化，采用生理鹽水洗滌上層殘余物，但實驗中發(fā)現(xiàn)用500 μL生理鹽水洗滌5次，純化效果仍不理想，放化純只能達到90%。后由文獻[21-22]知，DTPA能與64Cu形成穩(wěn)定的配合物，競爭絡(luò)合與納米材料非特異性結(jié)合的64Cu。因此，最后采用DTPA溶液進行洗滌，顯著提高了分離效果。本研究中分別用10 mmol/L和1 mmol/L的DTPA溶液500 μL各洗滌1次，放化純即可達98%。

2.4 標記化合物的體外穩(wěn)定性

64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在PBS中的體外穩(wěn)定性結(jié)果示于圖9。由圖9可知，在37 ℃下，PBS體系中放置4 h，該標記物的放化純從初始的98%下降至93%，而一個半衰期(12 h)后，放化純降至85%。這表明該標記物在4 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

θ=37 ℃圖9 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA的體外穩(wěn)定性Fig.9 In vitro stability of 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA

2.5 荷瘤鼠體內(nèi)生物分布

人口腔表皮樣KB腫瘤細胞系被認為是進行葉酸靶向研究的“金標準”。由于KB細胞具有高且穩(wěn)定的葉酸受體表達水平，傳統(tǒng)上KB細胞常被用于葉酸靶向研究[23]。因此，以荷KB細胞瘤的裸鼠為對象進行了體內(nèi)生物分布及MRI和PET/CT的顯像研究。靶向標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA和非靶向標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH在荷KB細胞裸鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。由表1可知：兩種標記物在肝臟中((21.04±3.39)%ID/g，(25.03±3.07)%ID/g；6 h)的放射性攝取都很大；64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在脾((15.04±2.68)%ID/g，6 h)和肺((29.83±3.92)%ID/g，6 h)中的放射性攝取也較大。64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在肝、脾和肺的高攝取主要與巨噬細胞的吞噬作用有關(guān)。體內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES，包括肝、脾、肺和骨髓等組織)具有豐富的吞噬細胞，可將一定大小的納米顆粒作為異物而攝取，較大的顆粒由于不能濾過毛細血管，而被截留于某些部位。

與未連接葉酸的標記物相比，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在腫瘤中的攝取明顯增高。64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA和64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH在給藥1 h的放射性攝取率分別為(9.76±5.27)%ID/g和(1.41±0.36)%ID/g；給藥3 h的放射性攝取率分別為(8.81±8.30)%ID/g和(1.52±0.60)%ID/g；給藥6 h的放射性攝取率分別為(8.90±3.31)%ID/g和(2.09±0.63)%ID/g。這表明連接葉酸后，納米粒子對KB細胞瘤具有明顯的主動靶向作用。

表1 64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA和64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH在荷KB細胞裸鼠體內(nèi)的生物分布

注：n=3

在給藥1、3、6 h時，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA的腫瘤和血液的放射性攝取率比(T/B)分別為6.82、6.67、6.74；而64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH的T/B分別為0.65、0.52、0.68。連有葉酸納米粒子的T/B明顯高于無葉酸連接的納米粒子，并且在1～6 h內(nèi)T/B均大于6，這表明64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在腫瘤中具有較長的滯留時間，靶與非靶組織反差明顯，可在較寬的時間范圍內(nèi)對腫瘤進行顯像。

2.6 荷瘤鼠的MRI和PET/CT顯像

荷KB裸鼠給藥4 h后的MRI和PET/CT圖像示于圖10。超順磁性氧化鐵納米粒子在MRI成像中作為T2造影劑，通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中的吞噬細胞吞噬SPIONs后使相應(yīng)的區(qū)域信號減弱。由圖10(a)可知，空白組中KB細胞腫瘤部位最為明亮；當(dāng)對葉酸受體進行阻斷后(圖10(b))，圖像也稍變暗，這可能是因為盡管葉酸受體已被阻斷，DOTA-SPIONs-PEG-FA的主動靶向不起作用，但該納米粒子仍可能通過實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeation and retenting, EPR)被腫瘤少量攝取[24]，因此，使得MRI信號減弱。圖10(c)顯示，注射DOTA-SPIONs-PEG-FA 4 h后腫瘤部位信號減弱幅度大，MRI圖像變得最暗。這表明DOTA-SPIONs-PEG-FA在腫瘤部位有最大攝取，其攝取是與葉酸受體密切相關(guān)的，DOTA-SPIONs-PEG-FA可作為葉酸受體主動靶向的KB腫瘤MRI造影劑。

從PET/CT圖像可知(圖10(d, e))，注射了未含有葉酸的非靶向標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH以及先經(jīng)葉酸阻斷后再注射葉酸受體靶向標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA，藥物在腫瘤部位的放射性攝取均較少，與肌肉相比沒有顯示出大的差異。而直接注射葉酸受體靶向標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA后，藥物在腫瘤部位的攝取明顯增高(圖10(f))。這說明64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA對KB細胞腫瘤確有靶向性，這種靶向是通過與葉酸受體的作用而實現(xiàn)，是主動靶向。作為KB細胞腫瘤的PET/MRI雙模態(tài)顯像劑，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA有待于進行更深入的研究。在三種情形下，給藥4 h后，藥物在肝臟中的攝取都較高(圖10(d,e,f))。這與納米材料在肝中被巨噬細胞吞噬有關(guān)。

箭頭所指為腫瘤部位(a)——空白對照組，(b)——葉酸阻斷后再注入DOTA-SPIONs-PEG-FA，(c) ——DOTA-SPIONs-PEG-FA，(d)——64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH，(e)——葉酸阻斷后再注入64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA，(f)——64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA圖10 荷KB裸鼠給藥4 h后的MRI (a—c)和PET/CT圖像(d—f)Fig.10 MRI images(a-c) and PET/CT images(d-f) of nude mice bearing KB cells tumor after 4 h injection

3 結(jié) 論

以化學(xué)共沉淀法先合成了超順磁氧化鐵納米核心，并用APTES、FA-PEG-COOH和DOTA對納米粒子表面逐次進行了修飾，獲得了DOTA-SPIONs-PEG-FA。接著，用正電子核素64Cu對其進行了標記并純化，制備了可用于PET/MRI雙模態(tài)分子顯像的64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA探針，經(jīng)過分離純化得到了放化純大于98%的標記物，并對其體外穩(wěn)定性、在荷KB細胞裸鼠的體內(nèi)生物分布及在MRI和PET/CT模式下的顯像進行了研究。結(jié)果表明，與64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH相比，連接有葉酸的標記物64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA對KB細胞腫瘤表現(xiàn)出明顯的主動靶向作用，MRI和PET/CT腫瘤成像較清晰。作為KB細胞腫瘤的PET/MRI雙模態(tài)顯像劑，64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA在向臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化之前還需要解決許多問題，如合成過程中更精密的控制(64Cu標記率的提高、放射性比活度和穩(wěn)定性的改善)、合成中間產(chǎn)物更嚴密的分析鑒定和定量檢測、體外細胞結(jié)合實驗研究、代謝產(chǎn)物分析研究以及納米材料的毒理學(xué)研究等。后續(xù)的工作將圍繞這些問題而展開。

[1] Stewart B W, Wild C P. World cancer report 2014[R]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer, 2014.

[2] Madduri S, Galliford C V, Low P S. Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2015, 14(3): 203-219.

[3] Low P S, Henne W A, Doorneweerd D D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases[J]. Acc Chem Res, 2008, 41(1): 120-129.

[4] Muller C, Schibli R. Folic acid conjugates for nuclear imaging of folate receptor-positive cancer[J]. J Nucl Med, 2011, 52(1): 1-4.

[5] Spick C, Herrmann K, Czernin J.18F-FDG PET/CT and PET/MRI perform equally well in cancer: evidence from studies on more than 2,300 patients[J]. J Nucl Med, 2016, 57(3): 420-430.

[6] Rosales R T M. Potential clinical applications of bimodal PET-MRI or SPECT-MRI agent[J]. J Label Compd Radiopharm, 2014, 57(4): 298-303.

[7] 沈浪濤.放射性藥物化學(xué)領(lǐng)域中的重要事件和前沿[J].核化學(xué)與放射化學(xué)，2015，37(5)：355-365.

[8] Joel G, Tang T, Louie A Y. Nanoparticle-based multimodal PET/MRI probes[J]. Nanomedicine, 2015, 10(8): 1343-1359.

[9] Yallapu M M, Foy S P, Jain T K, et al. PEG-functionalized magnetic nanoparticles for drug delivery and magnetic resonance imaging application[J]. Pharm Res, 2010, 27(11): 2283-2295.

[10]Harivardhan R L, Arias J L, Julien N, et al. Magnetic nanoparticles: design and characterization, toxicity and biocompatibility, pharmaceutical and biomedical applications[J]. Chem Rev, 2012, 112(11): 5818-5878.

[11]Chen T J, Cheng T H, Hung Y C, et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI[J]. J Biomed Mater Res A, 2008, 87(1): 165-175.

[12]Yoo M K, Park I K, Lim H T, et al. Folate-PEG-superparamagnetic iron oxide nanoparticles for lung cancer imaging[J]. Acta Biomaterialia, 2012, 8(8): 3005-3013.

[13]Jiang Q L, Zhang S W, Hong R Y, et al. Folic acid-conjugated Fe3O4magnetic nanoparticles for hyperthermia and MRIinvitroandinvivo[J]. Appl Surf Sci, 2014, 307(1): 224-233.

[14]王曉，崔海平，史旭東，等.SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑SPION-DMSA-99Tcm的制備及其性質(zhì)研究[J].原子能科學(xué)技術(shù)，2015，49(9)：1557-1564.

[15]王曉，崔海平，史旭東，等.新型SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑SPION-DMSA-RGD-99Tcm的合成和生物學(xué)評價[J].原子能科學(xué)技術(shù)，2015，49(11)：1932-1938.

[16]Lee H Y, Li Z, Chen K, et al. PET/MRI dual-modality tumorimaging using arginine-glycine-aspartic(RGD)-conjugated radiolabeled iron oxide nanoparticles[J]. J Nucl Med, 2008, 49(8): 1371-1379.

[17]中華人民共和國機械行業(yè)標準.JB/T 6237.3-2008,第三部分：鄰菲羅啉分光光度法測定鐵量[M].北京：機械工業(yè)出版社,2008.

[18]史旭東，王曉，申一鳴，等.超順磁性氧化鐵納米粒子SPION-dopa-PEG-DOTA/RGD的64Cu標記、純化及生物學(xué)初步評價[J].核化學(xué)與放射化學(xué)，2015，37(4)：250-256.

[19]Stockhofe K, Postema J M, Schieferstein H, et al. Radiolabeling of nanoparticles and polymers for PET imaging[J]. Pharmaceuticals, 2014, 7(4): 392-418.

[20]Rosales R T M, Tavaré R, Paul R L, et al. Synthesis of64CuⅡ-bis (dithiocarbamate-bisphosphonate) and its conjugation with superparamagnetic iron oxide nanoparticles:invivoevaluation as dual-modality PET-MRI agent[J]. Angew Chem Int Ed, 2011, 50(24): 5509-5513.

[21]Fukukawa K, Rossin R, Hagooly A, et al. Synthesis and characterization of core-shell star copolymers forinvivoPET imaging applications[J]. Biomacromolecules, 2008, 9(4): 1329-1339.

[22]Pressly E D, Rossin R, Hagooly A, et al. Structural effects on the biodistribution and positron emission tomography (PET) imaging of well-defined64Cu-labeled nanoparticles comprised of amphiphilic block graft copolymers[J]. Biomacromolecules, 2007, 8(10): 3126-3134.

[23]Müller C, Schubiger P A, Schibli R.Invitroandinvivotargeting of different folate receptor-positive cancer cell lines with a novel99mTc-radiofolate tracer[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2006, 33(10): 1162-1170.

[24]Maeda H. Tumor-selective delivery of macromolecular drugs via the EPR effect: background and future prospects[J]. Bioconjugated Chemistry, 2010, 21(5): 797-802.

64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA as a Potential PET/MRI Dual-Modal Imaging Tumor Probe Used for Targeting Folate Receptor-Positive Cancer

SUN Yu-lin1,2, SHEN Yi-ming1,2, LIANG Ji-xin1, CHEN Yu-qing1,2, SHEN Lang-tao1,2,*

1.China Institute of Atomic Energy, P. O. Box 275(58), Beijing 102413, China;2.Atom-Hitech Company, Beijing 102413, China

The synthesis, preliminary biological evaluation and PET/CT and MRI imaging results of a potential PET/MRI dual-modal imaging tumor probe,64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA, used for targeting folate receptor-positive cancer, have been reported in this investigation. This probe was composed of a superparamagnetic iron oxide nanoparticles(SPIONs) coated with the biocompatible polymer poly(ethylene glycol)(PEG), folic acid, 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid(DOTA) and positron-emitter copper-64. This radioactive probe has high radiochemical purity(greater than 98%) after purification. The bio-distribution in the nude mice bearing KB cells tumor shows that64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA has a higher uptake in liver, spleen and lung, respectively, and has an obvious effect of active targeting toward the KB tumor in contrast to64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-OH. Under the modes of both MRI and PET/CT, the KB tumor can be observed clearly. As a PET/MRI dual-modal imaging tumor probe,64Cu-DOTA-SPIONs-PEG-FA is worthy to be further studied to improve its labeling yield, stability, specific activity and so on.

PET/MRI dual-modal probe; superparamagnetic iron oxide nanoparticles; folic acid; DOTA;64Cu

2016-05-12；

2016-06-13

孫鈺林(1982—)，男，遼寧本溪人，博士研究生，放射性同位素技術(shù)專業(yè)，E-mail: alinzaixian@163.com

*通信聯(lián)系人：沈浪濤(1963—)，男，浙江永康人，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事藥物化學(xué)和有機合成化學(xué)研究，E-mail: shenlt@yahoo.com

O615.4

A

0253-9950(2017)04-0298-11

10.7538/hhx.2017.39.04.0298